T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

Summary

我々は、腫瘍標的細胞とインキュベートした場合、T細胞の細胞傷害活性を測定するための単一セルハイスループットアッセイが記載されている。この方法では、空間的に定義された比率で、T細胞と標的細胞を閉じ込めるために、サブナノリットルウェル（〜100,000ウェル/配列）の高密度、エラストマー配列を採用しており、エフェクター - 標的抱合及びその後アポトーシスを監視するために、蛍光顕微鏡に接続されている。

Abstract

癌免疫療法は、腫瘍を標的とし、排除する免疫応答の特異性を活用することができます。遺伝的にキメラ抗原受容体（CAR）を発現するように改変T細胞の養子移入に基づく養子細胞療法（ACT）は、臨床試験^1-4のかなりの約束を示している。そこに車を使用して⁺ T細胞を、MHC非制限抗原を標的とし、宿主内でホーミングと永続最適な生存のためのT細胞を、官能化する能力を含む癌の治療のためにはいくつかの利点があり、そして最後に、CARのアポトーシスを誘導するために⁺宿主毒性⁵のイベントでのT細胞。

CARの最適な機能を線引き⁺臨床的利点を伴うT細胞は臨床試験の次の世代を設計するために不可欠です。多光子顕微鏡のように生きている動物のイメージングにおける最近の進歩は、免疫細胞機能の研究に革命をもたらした私nの生体^6,7。これらの研究は、in vivoでのT細胞の機能についての我々の理解を進めているが、臨床試験でのT細胞ベースのACTは、T細胞の調製に利用することにより、臨床的有効性の注入後との事前注入の分子および機能的特徴をリンクする必要があるのを必要とします細胞毒性およびサイトカイン分泌、のようにT細胞の機能を監視し、インビトロアッセイ。標準的なフローサイトメトリーに基づいたアッセイは、単一細胞レベルでのT細胞の集団の全体的な機能を決定するが、これらは抱合体形成と寿命または複数のターゲット^8を殺すために同じ細胞の能力を監視するには適さないことが開発されている。

ポリジメチルシロキサン（PDMS）のような生体適合性ポリマーで設計微細加工された配列は、空間的に小さなボリューム⁹のエフェクターや目標を閉じ込めるために特に魅力的な方法です。自動化されたタイムラプス蛍光顕微鏡との組み合わせで、カントーエフェクター - 標的相互作用のusandsはnanowell配列の撮像個々のウェルで同時に監視することができます。我々はここで広く、T細胞の細胞傷害機能を研究に適用することができ、単一細胞レベルでのT細胞媒介性細胞傷害性を監視するためのハイスループットな方法論を提示する。

Protocol

1。試薬の調製

1. 500ミリリットルのRPMI-1640と5 mlペニシリン - ストレプトマイシンそれぞれ、L-グルタミン、およびHEPES溶液を混合することにより、RPMI-PLGHを準備します。
2. 10％ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI-PLGHを混合することにより、R10溶液を調製します。 FBSはさらに〜30分間56℃の前で熱不活化である。
3. 37℃でプレ暖かい℃のRPMI-PLGH 50mlのPBSを15ミリリットル、無菌コニカルチューブでR10の15ミリリットル。
4. PDMSにおけるnanowellsのアレイの作製：シリコンマスターは、本質的に以前に^10を説明したフォトリソグラフィを用いて作製される。徹底的にプラスチック製のナイフを使用して使い捨てカップの10:1の重量比でシルガード184エラストマーキットのベースと硬化剤を混ぜる。ドガ1時間真空チャンバー内で混合。 、nanowellアレイ上に混合物を注ぐスライドガラスで密閉して、30分間放置します。 ℃で2時間、80に設定したオーブンにアセンブリを移し、1時間室温で冷ます。エラストマーは最新版でしょうこの期間中の電子と意志スライドガラスに接着する。 PDMS nanowell配列を含有するガラススライドは慎重に、シリコンマスターリフトオフスコッチテープで覆われており、将来使用するまで保存されています。

2。標的細胞（T）のラベル

1. 5分間、340×gで遠心分離することにより滅菌15mlコニカルチューブに血球計数器とペレット細胞を用いた細胞培養から500万標的細胞をカウントします。細胞培養は5ミリリットル総容積（密度= 100万/ ml）に前日分割し、T-25フラスコ（VWR）中で培養される。血球計数器を用いて細胞計数のためのプロトコルは、以前¹¹を詳細に説明してきた
2. メディアの約50μlを残して余分なメディアを吸引します。
3. （最終濃度2.5μM）を150μlのRPMI-PLGHに0.5μlのCTRストック（1mM）を混合することにより、携帯トラッカーレッド（CTR）のワーキング溶液を調製します。標的細胞への作用溶液を150μlを加え、P200のピペットを用いてよく混合します。交互に、PKH 26（最終濃度2μM）を製造元の指示に従って、ラベル標的細胞を使用することができます。
4. 20分間37℃/ 5％CO ₂でインキュベートする。

3。エフェクター（E）細胞標識

1. 5分間、340×gで遠心分離することにより滅菌15mlコニカルチューブに血球計およびペレット細胞を用いた細胞培養から500万エフェクター細胞をカウントする。
2. 余分なメディアを吸引
3. R10のメディアの1ミリリットル（5μMの最終濃度）を5mMのVybrantバイオレット株式1μlを添加してVybrant DyeCycleVioletステインソリューションの作業溶液を調製します。細胞への実用的なソリューションを追加し、P200のピペットを用いて再懸濁します。交互に、PKH 67（最終濃度2μM）を製造業者の指示に従って、ラベル標的細胞を使用することができます。 PKH 67が使用されている場合は、それらが同じ蛍光チャンネルにあるので、その後SYTOXグリーンは使うべきではありません。アポトーシス目標の列挙は、専ら使用して行われこの場合nnexinV染色。
   注：時間経過ではなく、エンドポイントの測定を行う場合は、Vybrantバイオレットのような紫の染料は避けるべきである。
4. 20分間37℃/ 5％CO ₂でインキュベートする。

4。密度勾配を用いた生細胞と死細胞の分離

1. それぞれ、ターゲットとエフェクター細胞に6.8ミリリットルおよびRPMI-PLGHの6.0ミリリットルを加え、穏やかに上下にピペッティングにより混和します。
2. 標的細胞とエフェクター細胞を含む各コニカルチューブの底にのFicoll-Paque Plusの層3.5ミリリットル。 FICOLLとメディア間の層の良好な形成を確保するためFICOLLゆっくり層。
3. 30分間340 xgで両方のチューブを遠心分離します。ノーブレーキと加速しています。
4. 遠心中、4ウェルプレートにあらかじめ温めておいたPBSを7ミリリットルを転送します。 nanowellアレイ（PDMSで作製）を準備エタノールでスライドガラスの底をきれいにし、1分間のプラズマ酸化剤を用いた高RF設定でPDMSを酸化させる。このステップでは、STEますまた、親水性のPDMSをレンダリング中nanowell配列をrilize。直ちにPBSを含むプレートにnanowellアレイを移動する。
5. バイオセーフティキャビネットにプレートを移し、過剰のPBSを吸引除去する。 30から45秒後、10ミリリットルのDI水と電子レンジ、それに100mgの寒天粉末を添加して10ミリリットル1パーセントNoble寒天を作る。配列を固定化して凝固寒天は10分待機するnanowellの配列が含まれているスライドガラスの上端と下端に暖かい一パーセントノーブル寒天を適用します。 3ミリリットルPBSおよび吸引過剰寒天を追加します。
6. nanowellアレイの上面上にR10の3ミリリットルを追加し、約10分間平衡化しましょう​​。
7. 遠心分離をフィコールに続いて、各管の最上層から5ミリリットルメディアを吸引除去する。細胞を含有する層を吸引しないように注意してください。
8. 、P1とFICOLLとメディアの間の層1〜2ミリリットルを回収することにより細胞（白層）収穫000ピペットと新しい滅菌コニカルチューブに移動します。それがあなたの格言を確認しながら細胞の両方のセットに対してこの手順を繰り返し回復細胞をIZE。
9. フル加速とブレーキで5分間340×gで遠心分離によるピペッティングし、ペレットによるミックス、各チューブにあらかじめ温めておいたRPMI-PLGHの3ミリリットルを追加します。
10. 余分なメディアを吸引し、各チューブにあらかじめ温めておいたRPMI-PLGH 5 mlを加え、5分間、340×gで遠心操作を繰り返します。
11. 余分なメディアを吸引除去し、R10の500μlの細胞ペレットを再懸濁します。
12. 血球計算盤にトリパンブルー排除法を用いて生細胞数を数えます。

5。 Nanowellアレイ上にセルの読み込み

1. nanowellアレイから余分なメディアを吸引除去し、アレイ全体の新鮮なR10の2ミリリットルを追加します。 nanowellアレイの上面は、それが細胞の分布に影響を与えるとして、あまりにもウェット/ドライでないことを確認しながら再度吸引してください。
2. nanowellアレイ表面上にR10の200μlの預金1×10 ^5個のエフェクター細胞（密度= ^5×10 5細胞/ ml）。
3. 細胞は5分間静とenに標準的な組織培養顕微鏡検査を使用してみましょう細胞の分布が望ましいことを確認してください。必要に応じて複数のセルを追加します。
4. 敷金1×10 nanowellアレイ表面上の200μlのR10の⁵の標的細胞（密度= ^5×10 5細胞/ ml）。
5. 細胞は5分と細胞の分布が望ましいことを確実にするために標準的な組織培養顕微鏡検査を使用するために解決しましょう​​。必要に応じて複数のセルを追加します。
6. 2ミリリットルR10と吸引余分なメディアで慎重nanowell配列をすすぐ。
7. 15ミリリットル滅菌コニカルチューブに3ミリリットル予め温めR10を準備します。ステイン0.5mMのSYTOXグリーン核酸の3μL（終濃度0.5μM）及びワーキング溶液を調製したアネキシンV-アレクサフルオル647の60μlを添加する。細胞をウェルからはずれていないことを確認しながら慎重に4ウェルプレート上に実用的なソリューションを追加します。
8. 15分間37℃/ 5％CO ₂でインキュベートする。

6。イメージングの1

1. 蛍光MICRを使用nanowell配列の画像を取得oscope：この例では、我々は電動ステージとLambda-DG4を装備し、Z-1顕微鏡ツァイスObserverを使用。
2. ソフトウェアや顕微鏡を初期化し、透過光や他の蛍光チャンネル上の信号強度を確認してください。全体的に、に対応した5つのチャンネルがあるでしょう：透過光、アネキシンV-647（Cy5のフィルタ）、CTR（DsRedをフィルタ）、SYTOXグリーン（FITCフィルター）、およびVybrantバイオレット（DAPIフィルター）。顕微鏡は、それが飽和状態を回避しながら、ノイズに対する最大の信号を確実にするためにセットアップしていることを確認します。
3. nanowellアレイ用のXとYの位置を設定します。ゼロの位置を設定するとnanowellアレイスタンプの左上隅に7×7 nanowell·アレイ·ブロックの中心にフォーカスを初期化することによって、プロセスを開始します。正確には、各ブロックに焦点を反映するように各ブロックの中心とz値と一致するように、x、yの位置を設定します。
4. 位置とフォーカスがすべて設定されたら、リニアモードで画像取得を設定し、画像を取得するようにしてください。 2に必要な有効にした場合。

7。ポストイメージング

6時間インキュベーター（37℃/ 5％CO _2）にnanowell配列を含む4ウェルプレートを転送します。

8。イメージング2

ステップ6で説明したように第二の時点で画像を取得。

9。画像解析

1. nanowells内の細胞の占有率は、適切な画像分割プログラムの使用（ 例えば ImageJは、によって決定されhttp://rsbweb.nih.gov/ij/ ）本質的には以前に説明した^9,12。
2. 顕微鏡画像（T = 0時間; トン_0）の初期セットの分析は、正確に1つのライブターゲットセル（同定含む個別nanowellsのデータベースを生成するために使用され赤）と無死んだ細胞（Annexin V染色により同定、緑）[T1t ₀ nanowells]; CellTracker赤で。
3. 顕微鏡画像の第2セットの分析は（T = 6時間_、6トン） _が独立して1標的細胞（赤）[T1t ₆ nanowells]を含むnanowellsの2番目のデータベースを決定するために使用されます。整合性チェック（データベースクエリ）がt ₀におけるすべてのライブの目標が一致した目標の最終的なセットを（T1t ₀ T1matchとして指定された= T1t _6を持っ_て nanowellsとして実装）を生成するためにトン₆でターゲットにマッチしていることを確認するために実装され
4. nanowellsにおけるエフェクター細胞の数がt ₀でVybrantバイオレット染色法を用いて決定される[E1 nanowells]
5. データベースクエリ（E1T1として指定されたE1およびT1 _{が一致して}いるnanowellsとして定義）は、単一のターゲットと同時インキュベートシングルエフェクターを含むnanowellsを識別するために実装されています
6. エフェクター誘導アポトーシスは、iによって採点される t ₀とt _4（トン₆のアネキシンVターゲット染色によるE1T1）で正アネキシンVでの負のアネキシンVで目標をdentifying。

10。ニコンBioStation IMを使って殺すのオプションタイムラプスイメージング

1. カバーガラスの底が付いてペトリ皿を取ると正確にカバースリップに収まるnanowellアレイチップ（ステップ5で調製したもの）の小片を切り出す。カットしながらチップが濡れたままでいることを確認してください。
2. ミックス1×10 ⁶目標と100μlの培地で1×10 ⁶ T細胞、カバーガラス上に移します。
3. 約15〜30分で細胞が落ち着くようにすることができます。
4. 急速に小nanowellアレイチップを反転してカバースリップの上に置きます。
5. なお、チップの上部にイメージング、場所中に1つまたは2つの20ミリメートル×20mmのカバーグラスを動かすことができないことを確実にするために。皿の底にチップをプッシュするように優しく圧力をかける。

テント"> 注意：nanowellアレイチップの底が高分解能イメージングのために厚すぎるので、逆さまにしなければならないこの時には、細胞の多くが洗い流され、これはステップ9.2で、セル番号を容易に制御することができないので。そしてステップ9.3におけるインキュベーション時間は、最適化されなければならない。

Representative Results

ハイスループット細胞傷害アッセイのアプリケーションの例を図2に示されています。簡単に説明すると、ラベルの付いたCD19特異CAR ⁺ T細胞はnanowellアレイ（セクション1-5）の各ウェルに標識マウスEL4標的細胞と共培養した。最初のイメージは、アレイ上のすべての単一のnanowell（第6項）の占有を（エフェクターおよび/またはターゲット）を識別するために自動化された蛍光顕微鏡で記録された。画像処理は正確に単一のターゲットを含むすべてのnanowellsと単一エフェクターを特定し、死んだ目標（第9節）を含むnanowellsを除外するために使用されていました。チップは6時間インキュベーターに移した後、チップの第2の画像（セクション7-8）を記録した。標的細胞にアポトーシスを誘導するエフェクターの能力を正確に1つのエフェクターと一つのターゲットを含むnanowellsに、アネキシンVで染色することにより測定した。二つの平行実験は同じエフェクターと2セットoに実行されました抗原特異的溶解（ 図2）の周波数を決定するために、fの標的細胞（EL4-CD19 ⁺およびEL4-CD19-（ネガティブコントロール））。それは、非特異的溶解（〜2-4％）の低い周波数を達成することが望ましい。方法論は適切な標的細胞の可用性に依存しており、並列実験はエフェクターの独立した目標でアポトーシスを決定するために実行する。 6H期間エフェクターの不在（> 8％）で、ターゲット·アポトーシスの高い周波数は培養、アッセイ条件を最適化する必要性を示しています。 nanowell配列は、連続的な監視が必要とされるときタイムラプスイメージングに適応（ムービー1）、これはエフェクター - 標的結合およびその後の細胞死の観察を可能にすることができます。

図1。 nanowellアレイベースの細胞傷害性アッセイのA回路図。標識CAR ⁺T細胞（青）と標的細胞（赤）nanowellsの配列中でインキュベートされる。顕微鏡は、エフェクター媒介標的細胞融解を監視するために使用されています。 CD19固有CARのB.描写複合顕微鏡⁺ EL4-CD19 ⁺標的細胞とそうでないものにアポトーシスを誘導するT細胞。

図2。 CD19特異CAR ⁺ T細胞の抗原特異的な細胞傷害活性。共インキュベーションの6時間後に単一のエフェクターと、単一のターゲットを含むウェルの標的細胞ヒストグラムプロット。エフェクターなしで、標的細胞のヒストグラムが一致した背景細胞死の頻度を報告するために示されています。

ムービー1。 CARのタイムラプス顕微鏡⁺ T細胞媒介細胞溶解。CAR ⁺ T細胞（ラベルなし）NAのNALM-6-GFP +標的細胞（緑）と共培養したノウェルとイメージが動的監視を有効にするには12時間の合計は2分ごとに撮影された。赤いラベルが付いなるアネキシンVは培養培地およびアポトーシス細胞に添加した。

Discussion

我々はnanowellsの配列（ 図1）でエフェクターや目標の共インキュベーションを介して有効高スループット、単一セルの細胞傷害性アッセイのためのプロトコルの概要を示している。スループットに加え、技術の主な利点は、順番に標的細胞として、自己またはプライマリ/マッチした腫瘍細胞の使用を可能にする標的細胞工学を必要とせずに所望の標的細胞に対するエフェクター媒介細胞傷害性を監視する機能です。空間的な閉じ込めは、検索およびアッセイ⁹の末端に官能T細胞のその後のクローニングを可能にします。アッセイの制限は、自動化されたステージと高速スイッチング光学た特殊な顕微鏡の必要性である。しかしながら、これは、これらのマシンは現在研究中核施設の一部として広く利用可能であることを考えれば重大な制限はありません。

preserviながら、より高いスループットを提供し、フローサイトメトリーに基づいたアッセイの様々なものがありますngの単一セルの解像度。これらは、エフェクターやターゲット^13,14におけるカスパーゼ/グランザイム活性における脱顆粒（CD107a）またはパーフォリンコンテンツのサロゲートマーカーについて染色アッセイを含む。これらのアッセイは、しかし本当にエフェクター - 標的結合または複数のターゲットを従事し、殺すためにエフェクターの能力を監視しません。このようなEで実行4H 51Cr放出アッセイなど金本位アッセイと比較：まだシングルセルの解像度を提供しながら、1:1のT比、我々の方法は、典型的には、細胞溶解性のエフェクターと同じ全体的な数を報告します。前に概説したようにプロトコルは、ここで細胞毒性に関する詳細のみを概説していますが、このアッセイは、容易に目標ライゲーション⁹時シングルエフェクター細胞によって分泌されるサイトカインを決定するmicroengravingアッセイと組み合わせることができます。それは車の複合機能プロファイル⁺シングルセルレベルでの細胞毒性およびサイトカイン分泌を組み合わせたT細胞を生成することが可能である。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 w/o L-glutamine	Cellgro	15-040-CV
Penicillin-streptomycin	Cellgro	30-002-CI	10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin
L-glutamine	Cellgro	25-005-CI	200 mM solution
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Lot tested
Cell Tracker Red Stain	Invitrogen	C34552	50 μg
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 μl
Dulbecco's PBS	Cellgro	21-031-CV	500 ml
Noble agar	DIFCO	2M220	100 g
Trypan Blue	Sigma Aldrich	T8154	0.4% liquid, sterile filtered
Hemocytometer	Hausser Scientifics	1492	Bright line
4-well plate	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Basic plasma cleaner
Observer.Z1	ZEISS		Fluorescent microscope (works with the three parts below)
Lambda 10-3	Sutter Instrument		Filter controller
Lambda DG-4	Sutter Instrument		Ultra-High-Speed Wavelength switcher
Hamamatsu EM-CCD Camera	Hamamatsu	C9100-13	CCD-Microscope camera
15 ml conical tube	BD Falcon	352097
50 ml conical tube	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc.	Biostation IM
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0	35 mm petri dish, 10 mm microwell