Summary
हम एक एकल कोशिका उच्च throughput टी कोशिकाओं की cytotoxicity उपाय जब ट्यूमर लक्ष्य कोशिकाओं के साथ incubated परख का वर्णन. इस विधि उप nanoliter कुओं (~ 100.000 कुओं सरणी /) के एक घने, elastomeric सरणी spatially सीमित टी परिभाषित अनुपात में और कोशिकाओं लक्ष्य कोशिकाओं को रोजगार और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी मिलकर effector लक्ष्य विकार और बाद में apoptosis की निगरानी.
Protocol
1. अभिकर्मकों तैयारी
- पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन, एल glutamine, और HEPES समाधान के प्रत्येक 500 मिलीलीटर RPMI 1640 और 5 मिलीग्राम मिश्रण द्वारा RPMI PLGH तैयारी.
- 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ RPMI PLGH मिश्रण से तैयार R10 समाधान. FBS में 56 ° 30 मिनट के लिए सी अलावा करने के लिए पहले गर्मी निष्क्रिय है.
- 37 पूर्व गर्म ° C RPMI PLGH, 15 R10 बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में पीबीएस की मिलीग्राम और 15 मिलीग्राम के 50 मिलीलीटर.
- PDMS में nanowells के arrays के निर्माण: सिलिकॉन मास्टर अनिवार्य रूप से 10 पहले से वर्णित photolithography उपयोग कर निर्मित है. अच्छी तरह मिक्स Sylgard elastomer 184 किट का आधार है और इलाज एजेंट 10:01 एक डिस्पोजेबल कप में वजन के अनुपात में एक प्लास्टिक की चाकू का उपयोग. Degas 1 घंटा के लिए एक निर्वात चैम्बर में मिश्रण. Nanowell सरणी पर मिश्रण डालो, एक गिलास स्लाइड के साथ मुहर और इसे 30 मिनट के लिए बैठते हैं. एक ° लिए सी 2 घंटे 80 करने के लिए सेट ओवन में विधानसभा स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए शांत करते हैं. elastomer चालू होगाइस अवधि और इच्छा गिलास स्लाइड बंधन के दौरान ए. कांच स्लाइड PDMS nanowell सरणी युक्त ध्यान सिलिकॉन मास्टर उठाया है, सेलो टेप के साथ कवर किया है और भविष्य में उपयोग के तक जमा.
2. लक्ष्य कक्ष लेबल (टी)
- 5 मिलियन सेल संस्कृति से लक्ष्य कोशिकाओं की गणना एक hemocytometer और गोली कोशिकाओं का उपयोग कर एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 5 मिनट के लिए 340 XG पर centrifugation द्वारा. सेल संस्कृति पिछले दिन 5 मिलीग्राम कुल मात्रा (= घनत्व 1 लाख मिलीग्राम /) में विभाजित है और T-25 कुप्पी (VWR) में सभ्य. सेल hemocytometer का उपयोग कर गिनती के लिए प्रोटोकॉल के विस्तार में 11 पहले से वर्णित किया गया है
- अतिरिक्त मीडिया के लगभग 50 μl छोड़ने के पीछे मीडिया Aspirate.
- 150 μl RPMI - PLGH 0.5 μl सीटीआर स्टॉक (1 मिमी) मिश्रण (अंतिम एकाग्रता 2.5 सुक्ष्ममापी) द्वारा तैयार सेल ट्रैकर लाल (सीटीआर) के एक काम समाधान. लक्ष्य कोशिकाओं के लिए काम कर रहे समाधान के 150 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से एक P200 विंदुक का उपयोग.वैकल्पिक रूप से, PKH 26 (2 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता) निर्माता के निर्देशों के अनुसार लेबल लक्ष्य कोशिकाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- 20 मिनट के लिए 37 ° / सी 5% सीओ 2 सेते हैं.
3. Effector सेल (ई) लेबल
- सेल संस्कृति से 5 लाख effector कोशिकाओं एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक hemacytometer और गोली कोशिकाओं 5 मिनट के लिए 340 XG पर centrifugation द्वारा उपयोग की गणना.
- अतिरिक्त मीडिया Aspirate
- R10 मीडिया के 1 मिलीलीटर (5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता) 5 मिमी Vybrant वायलेट स्टॉक के 1 μl जोड़कर Vybrant DyeCycleViolet दाग समाधान के एक काम समाधान तैयार करें. काम कोशिकाओं का हल जोड़ें और P200 विंदुक का उपयोग resuspend. वैकल्पिक रूप से, PKH 67 (2 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता) निर्माता के निर्देशों के अनुसार लेबल लक्ष्य कोशिकाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि PKH 67 का प्रयोग किया जाता है, तो SYTOX ग्रीन के बाद से वे एक ही प्रतिदीप्ति चैनल में कर रहे हैं नहीं किया जा इस्तेमाल किया जाना चाहिए. apoptotic लक्ष्यों की गणना विशेष रूप से एक का उपयोग किया जाता हैइस मामले में nnexinV धुंधला हो जाना.
नोट: यदि समय चूक और माप endpoint नहीं प्रदर्शन, यूवी Vybrant वायलेट की तरह रंगों से परहेज किया जाना चाहिए. - 20 मिनट के लिए 37 ° / सी 5% सीओ 2 सेते हैं.
4. लाइव और मृत कोशिकाओं के पृथक्करण एक घनत्व ढाल का प्रयोग
- लक्ष्य और effector कोशिकाओं 6.8 मिलीग्राम और RPMI - PLGH की 6.0 मिलीलीटर जोड़ें, क्रमशः और pipetting और धीरे मिश्रण.
- परत FICOLL Paque प्लस प्रत्येक शंक्वाकार लक्ष्य और effector कोशिकाओं युक्त ट्यूब के नीचे 3.5 मिलीलीटर. - FICOLL और मीडिया के बीच परतों के परत FICOLL धीरे धीरे अच्छा गठन को सुनिश्चित करने के लिए.
- 30 मिनट के लिए 340 XG पर दोनों ट्यूबों अपकेंद्रित्र. कोई ब्रेक और त्वरण के साथ.
- Centrifugation के दौरान एक 4-अच्छी तरह से थाली पूर्व गर्म पीबीएस के 7 मिलीलीटर हस्तांतरण. Nanowell सरणी (PDMS गढ़े में) तैयार: स्वच्छ इथेनॉल के साथ गिलास स्लाइड के नीचे और उच्च आरएफ सेटिंग में PDMS oxidize 1 मिनट के लिए प्लाज्मा आक्सीकारक का उपयोग. यह कदम Ste जाएगाजबकि भी हाइड्रोफिलिक PDMS प्रतिपादन nanowell सरणी rilize. तुरंत पीबीएस युक्त थाली में nanowell सरणी चाल है.
- जैव सुरक्षा कैबिनेट प्लेट हस्तांतरण और अतिरिक्त पीबीएस aspirate. 10 मिलीलीटर डि पानी और तो माइक्रोवेव यह 30-45 सेकंड के लिए 100 मिलीग्राम अगर पाउडर जोड़कर 10 मिलीलीटर 1% महान अगर बनाओ. कि सरणी स्थिर और जमना अगर करने के लिए 10 मिनट के इंतजार के लिए nanowell सरणी शामिल गिलास स्लाइड के ऊपर और नीचे किनारे पर 1% महान अगर गर्म लागू. 3 मिलीलीटर पीबीएस और Aspirate अतिरिक्त अगर जोड़ें.
- R10 की nanowell सरणी के शीर्ष पर 3 मिलीलीटर जोड़ें और यह ~ 10 मिनट के लिए संतुलन में लाना.
- Centrifugation FICOLL बाद प्रत्येक ट्यूब के शीर्ष स्तर से 5 मिलीग्राम मीडिया aspirate. कोशिकाओं से युक्त परत नहीं aspirate सावधान रहो.
- FICOLL और मीडिया के बीच P1, 000 विंदुक और नई बाँझ शंक्वाकार ट्यूब करने के लिए कदम के साथ परत से 1-2 मिलीलीटर ठीक से फसल कोशिकाओं (सफेद परत). कोशिकाओं के दोनों सेट के लिए दोहराएँ इस समय यह सुनिश्चित करें कि आप कहावतवसूली कोशिकाओं ize.
- त्वरण और ब्रेक पर 5 मिनट के लिए 340 XG पर centrifugation द्वारा प्रत्येक ट्यूब, pipetting और गोली से मिश्रण करने के लिए पूर्व गर्म RPMI PLGH 3 मिलीलीटर जोड़ें.
- अतिरिक्त मीडिया Aspirate प्रत्येक ट्यूब पूर्व गर्म RPMI PLGH 5 मिलीलीटर जोड़ने और 5 मिनट के लिए 340 XG पर centrifugation दोहराने.
- अतिरिक्त मीडिया Aspirate और R10 के 500 μl में सेल गोली resuspend.
- जीना एक hemacytometer पर Trypan नीले अपवर्जन विधि का उपयोग कोशिकाओं की गणना.
5. Nanowell सरणी पर सेल लोड हो रहा है
- Nanowell सरणी से अधिक मीडिया Aspirate और सरणी भर में ताजा R10 के 2 मिलीलीटर जोड़ें. फिर Aspirate जबकि यकीन nanowell सरणी के ऊपर भी गीला / शुष्क के रूप में यह कोशिकाओं के वितरण को प्रभावित करेगा नहीं है.
- जमा 1 x 10 5 R10 के 200 μl में nanowell सरणी सतह पर effector कोशिकाओं (घनत्व = 5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल).
- कोशिकाओं के 5 मिनट के लिए बसने और एन के लिए एक मानक टिशू कल्चर माइक्रोस्कोप चेक का उपयोगयकीन है कि कोशिकाओं के वितरण वांछनीय है. यदि आवश्यक हो तो अधिक कोशिकाओं को जोड़ें.
- जमा 1 x 10 5 200 μl R10 में nanowell सरणी सतह पर लक्ष्य कोशिकाओं (घनत्व = 5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल).
- कोशिकाओं 5 मिनट और एक मानक टिशू कल्चर माइक्रोस्कोप चेक का उपयोग करने के लिए यह सुनिश्चित करना है कि कोशिकाओं के वितरण वांछनीय है के लिए व्यवस्थित. यदि आवश्यक हो तो अधिक कोशिकाओं को जोड़ें.
- 2 में R10 मिलीलीटर और Aspirate अतिरिक्त मीडिया के साथ nanowell सरणी ध्यान से कुल्ला.
- एक 15 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में 3 मिलीलीटर पूर्व गर्म R10 तैयार. 3 μl 0.5mm SYTOX ग्रीन न्यूक्लिक दाग एसिड (अंतिम एकाग्रता 0.5 सुक्ष्ममापी) और Annexin वि Alexa Fluor 647 के 60 μl काम समाधान तैयार जोड़ें. 4-अच्छी तरह से थाली पर काम समाधान ध्यान जोड़ें जबकि यकीन है कि कोशिकाओं कुओं से विस्थापित नहीं कर रहे.
- 15 मिनट के लिए 37 ° / सी 5% सीओ 2 सेते हैं.
6. 1 इमेजिंग
- Nanowell सरणी की छवियों एक प्रतिदीप्ति माइकर का उपयोग मोलoscope: इस उदाहरण में, हम एक ZEISS प्रेक्षक का उपयोग Z-1 एक motorized मंच और Lambda-DG4 के साथ सुसज्जित खुर्दबीन.
- सॉफ्टवेयर और माइक्रोस्कोप इनिशियलाइज़ और संचारित प्रकाश और अन्य फ्लोरोसेंट चैनलों पर संकेत तीव्रता की जांच. कुल मिलाकर, वहाँ पाँच करने के लिए इसी चैनल होगा: प्रेषित प्रकाश, Annexin (Cy5 फिल्टर) V-647, सीटीआर (DsRed फिल्टर), SYTOX ग्रीन (FITC फिल्टर), और Vybrant वायलेट (DAPI फिल्टर). सुनिश्चित करें माइक्रोस्कोप है कि यह करने के लिए शोर करने के लिए अधिक से अधिक संकेत सुनिश्चित करते हुए संतृप्ति से परहेज सेटअप.
- एक्स और वाई स्थिति nanowell सरणी के लिए सेट. शून्य की स्थिति स्थापित करने और 7 एक्स nanowell सरणी टिकट के ऊपरी बाएँ कोने पर 7 nanowell सरणी ब्लॉक के केंद्र पर ध्यान केंद्रित आरंभ करने के दौरान प्रक्रिया शुरू करो. एक्स, वाई के लिए प्रत्येक ब्लॉक के केंद्र और z-मान के साथ मेल करने के लिए सही प्रत्येक ब्लॉक पर ध्यान केंद्रित करने को प्रतिबिंबित करने के लिए पदों पर सेट करें.
- एक बार स्थिति और ध्यान सब सेट कर रहे हैं, छवि अधिग्रहण रैखिक मोड में सेट और छवियों को प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करें कि.
7. बाद इमेजिंग
4-अच्छी तरह से 6 घंटे के लिए एक मशीन (37 ° / सी 5% सीओ 2) में nanowell सरणी युक्त थाली स्थानांतरण.
8. 2 इमेजिंग
2 समय बिंदु पर छवियों को प्राप्त करने के रूप में 6 चरण में उल्लिखित है.
9. छवि विश्लेषण
- nanowells भीतर कोशिकाओं के अधिभोग (जैसे ImageJ, उपयुक्त छवि विभाजन कार्यक्रमों के उपयोग के द्वारा निर्धारित किया जाता है http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) अनिवार्य रूप से 9,12 पहले से वर्णित है.
- माइक्रोस्कोप छवियों (= 0 टी घंटा, टी 0) के आरंभिक सेट का विश्लेषण करने के लिए व्यक्ति वास्तव में एक जीवित लक्ष्य सेल (की पहचान युक्त nanowells के एक डेटाबेस उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता हैद्वारा CellTracker लाल, लाल) और कोई मृत कोशिकाओं (Annexin वी धुंधला हो जाना द्वारा की पहचान, हरे) [0 nanowells T1t]
- माइक्रोस्कोप छवियों (टी = 6 घंटा, 6 टी) के दूसरे सेट का विश्लेषण करने के लिए स्वतंत्र रूप से 1 लक्ष्य (लाल) सेल [6 nanowells T1t] युक्त nanowells के एक दूसरे डेटाबेस का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है एक अखंडता की जाँच (डेटाबेस क्वेरी) करने के लिए सुनिश्चित करें कि 0 टी में सभी जीवित लक्ष्य 6 टी में लक्ष्य के लिए मिलान कर रहे हैं मिलान लक्ष्यों की एक अंतिम सेट (nanowells है कि T1t 0 = 6 T1t, T1match के रूप में नामित है के रूप में कार्यान्वित) का उत्पादन करने के लिए लागू किया जाता है
- effector कोशिकाओं में nanowells की संख्या 0 टी [E1 nanowells] में Vybrant वायलेट धुंधला हो जाना का उपयोग निर्धारित किया जाता है
- एक डेटाबेस क्वेरी के लिए एकल लक्ष्यों (है कि E1 और T1 मैच है nanowells के रूप में परिभाषित किया गया है, रूप में नामित E1T1) के साथ सह - incubated एकल effectors युक्त nanowells की पहचान करने के लिए लागू किया जाता है
- मैं effector प्रेरित apoptosis से रन बनाए है लक्ष्य है कि Annexin वी 0 टी और Annexin सकारात्मक 4 टी वी (E1T1 annexin वी 6 टी में लक्ष्य धुंधला के साथ) में नकारात्मक dentifying.
10. हत्या के वैकल्पिक इमेजिंग समय चूक Nikon BioStation आईएम का उपयोग
- Coverslip नीचे के साथ एक पेट्री डिश ले लो और बाहर nanowell सरणी चिप का एक छोटा सा टुकड़ा (5 चरण में तैयार) कि वास्तव में coverslip पर फिट होगा काट. सुनिश्चित करें कि चिप गीला रहता है जबकि काटने.
- 1 मिक्स x 10 6 लक्ष्य और 1 x 10 100 μl मीडिया में 6 टी कोशिकाओं, और यह coverslip पर विंदुक.
- बारे में 15-30 मिनट के लिए कोशिकाओं को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें.
- तेजी से छोटे nanowell सरणी चिप पलटना और coverslip पर जगह है.
- आदेश में यह सुनिश्चित करने के लिए है कि चिप इमेजिंग जगह दौरान चिप के शीर्ष पर एक या दो 20mm x 20mm coverslips को स्थानांतरित करने के लिए सक्षम नहीं होगा. दबाव पकवान के नीचे करने के लिए चिप धक्का धीरे लागू करें.
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Representative Results
उच्च throughput cytolytic परख के आवेदन का एक उदाहरण चित्रा 2 में प्रदर्शन किया है. संक्षेप में, कार CD19 विशिष्ट लेबल + टी कोशिकाओं लेबल माउस EL4 व्यक्तिगत कुओं एक nanowell सरणी के (1-5 अनुभाग) में कोशिकाओं के लक्ष्य के साथ सह - incubated. स्वचालित फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर एक प्रारंभिक छवि के सरणी (6 धारा) पर हर एक nanowell के अधिभोग effectors (और / या लक्ष्य) की पहचान करने के लिए दर्ज किया गया था. छवि प्रसंस्करण करने के लिए वास्तव में एक ही लक्ष्य और एक एकल effector युक्त nanowells की पहचान करने और मृत लक्ष्य (9 धारा) युक्त nanowells बाहर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. चिप 6 के लिए एक मशीन के लिए स्थानांतरित किया गया था और फिर चिप की एक दूसरी छवि (7-8 धारा) दर्ज की गई थी. effector की क्षमता लक्ष्य कोशिकाओं में apoptosis प्रेरित annexin वी साथ बिल्कुल एक effector और एक लक्ष्य युक्त nanowells में धुंधला द्वारा मापा गया था. दो समानांतर प्रयोगों ही effectors और दो ओ सेट के साथ चला गयाच लक्ष्य कोशिकाओं (EL4 - CD19 + और EL4 CD19 (नकारात्मक नियंत्रण)) प्रतिजन विशेष lysis की आवृत्ति (2 चित्रा) निर्धारित करने के लिए. यह गैर विशिष्ट lysis (~ 2-4%) के कम आवृत्तियों प्राप्त करने के लिए वांछनीय है. पद्धति उचित लक्ष्य कोशिकाओं और समानांतर प्रयोगों की उपलब्धता पर निर्भर करता है effectors के स्वतंत्र लक्ष्य में apoptosis का निर्धारण करने के लिए चलाए जा रहे हैं. 6 अवधि (8%) पर effectors के अभाव में लक्ष्य apoptosis की उच्च आवृत्तियों संवर्धन और परख की स्थिति का अनुकूलन की जरूरत को इंगित करता है. सरणी nanowell समय चूक इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जब सतत निगरानी की जरूरत है (1 मूवी) और इस effector लक्ष्य विकार और बाद में सेल मौत की निगरानी के लिए अनुमति देता है.
चित्रा 1. ए nanowell सरणी आधारित cytolytic परख के योजनाबद्ध. कार लेबल +टी कोशिकाओं (नीला) और लक्ष्य कोशिकाओं (लाल) की एक सरणी nanowells में incubated हैं. माइक्रोस्कोपी effector मध्यस्थता लक्ष्य कोशिकालय पर नजर रखने के लिए प्रयोग किया जाता है. बी CD19 विशेष कार के प्रतिनिधि समग्र micrographs + टी कोशिकाओं है कि EL4 CD19 + लक्ष्य कोशिकाओं और लोगों को है कि नहीं में apoptosis प्रेरित.
चित्रा 2. एंटीजन - विशिष्ट CD19 विशिष्ट कार + टी कोशिकाओं की cytolytic गतिविधि लक्ष्य सह ऊष्मायन के 6 घंटे के बाद एक एकल effector और एक ही लक्ष्य वाले कुओं की सेल हिस्टोग्राम भूखंडों. Effectors बिना लक्ष्य कोशिकाओं के मिलान histograms पृष्ठभूमि कोशिका मृत्यु की आवृत्ति की रिपोर्ट करने के लिए दिखाए जाते हैं.
1 फिल्म. कार की माइक्रोस्कोपी समय चूक + कार टी सेल मध्यस्थता कोशिकालय. + टी कोशिकाओं (unlabeled) एक ना में तक NALM-6-GFP + लक्ष्य कोशिकाओं (हरा) के साथ सह - incubatedनॉवेल और छवियों 12 गतिशील निगरानी सक्षम घंटा की कुल के लिए हर 2 मिनट ले जाया गया. Annexin वी संस्कृति मीडिया के लिए जोड़ा गया है और apoptotic कोशिकाओं लाल लेबल हो जाते हैं.
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Discussion
हम एक उच्च throughput एकल कोशिका cytolytic effectors और nanowells (1 चित्रा) के arrays में लक्ष्य के सह ऊष्मायन के माध्यम से सक्षम परख के लिए प्रोटोकॉल रेखांकित किया है. Throughput के अलावा तकनीक का एक प्रमुख लाभ वांछित लक्ष्य कोशिकाओं के खिलाफ लक्ष्य सेल इंजीनियरिंग के लिए की जरूरत है जो बदले में ऑटोलॉगस / या मिलान प्राथमिक लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में ट्यूमर कोशिकाओं के उपयोग के लिए अनुमति देता है बिना effector की मध्यस्थता cytotoxicity की निगरानी करने की क्षमता है. स्थानिक प्रसूति और 9 परख के अंत में कार्यात्मक टी कोशिकाओं के बाद क्लोनिंग पुनर्प्राप्ति की अनुमति देता है. परख की एक सीमा स्वचालित चरणों और तेजी से स्विचन प्रकाशिकी के साथ विशेष माइक्रोस्कोप के लिए जरूरत है. हालांकि यह एक गंभीर सीमा दी है कि इन मशीनों को अब अनुसंधान कोर सुविधाओं के भाग के रूप में व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं है.
वहाँ प्रवाह cytometry आधारित assays की एक किस्म है कि उच्च throughput की पेशकश कर रहे हैं, जबकि preserviएकल कोशिका संकल्प एनजी. Assays कि degranulation के लिए किराए मार्कर (CD107a) या effectors और कस्पासे / 13,14 लक्ष्य में granzymes गतिविधि में perforin सामग्री के लिए दाग शामिल हैं. इन assays लेकिन वास्तव में effector लक्ष्य विकार या effector की क्षमता में संलग्न हैं और कई लक्ष्यों को मारने की निगरानी नहीं करते. एक 4 51Cr रिहाई की परख, ई पर चलाने के रूप में सोने के मानक परख: टी 1:1 के अनुपात की तुलना में, हमारी पद्धति आमतौर पर cytolytic effectors के एक ही कुल संख्या की रिपोर्ट है, जबकि अभी भी एकल कोशिका संकल्प प्रदान. हालांकि प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित cytotoxicity पर केवल विवरण, के रूप में पहले से उल्लिखित इस परख microengraving लक्ष्य 9 ligation पर एक effector कोशिकाओं द्वारा secreted साइटोकिन्स निर्धारित परख के साथ आसानी से जोड़ा जा सकता है. इस प्रकार यह संभव है के लिए कार की समग्र कार्यात्मक प्रोफाइल + टी कोशिकाओं है कि cytotoxicity और cytokine स्राव एकल कोशिका के स्तर पर गठबंधन उत्पन्न.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
अनुसंधान के इस प्रकाशन में बताया पुरस्कार R01CA174385 संख्या के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के अधिकारी विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
| Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
| SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
| Dulbecco's PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
| Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
| Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
| 4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
| Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
| Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
| Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
| 15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
| Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |
References
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