Summary
우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.
Abstract
암 immunotherapy는 종양을 타겟팅하고 제거하는 면역 반응의 특이성을 활용 할 수 있습니다. 유전자 키메라 항원 수용체 (자동차)을 표현하도록 수정 T 세포의 입양 전송을 기반으로 입양 세포 치료 (ACT)는 임상 실험 1-4에서 상당한 약속을 보여 주었다. 이 자동차를 사용하여 + T 세포 비 MHC 제한 항원을 타겟팅하고 호스트에서 추적 및 지속성 최적의 생존을위한 T 세포를 functionalize 할 수있는 능력을 포함 암의 치료를 위해 다음과 같은 여러 장점이 있습니다, 그리고 마지막으로 자동차의 apoptosis를 유도하기 + 호스트 독성 (5)의 경우에 T 세포.
자동차의 최적의 기능을 Delineating + 임상 이익과 관련된 T 세포가 임상 시험의 다음 세대를 디자인하는 것이 필수적입니다. multiphoton 현미경 같은 라이브 동물 이미징의 최근 발전 면역 세포 기능의 연구를 혁신 한 전N 생체 6,7. 이 연구 생체, 임상 실험에서 T-세포 기반 ACT에서 T-세포 기능의 우리의 이해를 전진했지만에 활용하여, 사전에 주입 임상 효능 후 주입와 T-세포 준비의 분자 및 기능 기능을 연결 할 필요가 필요합니다 세포 독성 및 시토 킨 분비, 같은 T-세포 기능을 모니터링 체외 assays. 표준 흐름 세포 계측법 기반 assays은 단일 셀 수준의 T 세포 인구의 전반적인 기능을 결정하지만, 이러한 공액 형성과 수명 또는 여러 대상에게 8 죽일 같은 세포의 기능을 모니터링에 적합하지 않다고 개발되었습니다.
polydimethylsiloxane (PDMS) 등의 biocompatible 폴리머로 설계 Microfabricated 배열 spatially effectors 작은 볼륨 9 대상을 한정 할 수있는 특히 매력적인 방법입니다. 자동 시간 경과 형광 현미경, tho와 함께효과기 - 대상의 상호 작용 usands은 nanowell 배열의 이미징 개인 우물에서 동시에 모니터링 할 수 있습니다. 우리는 여기서 크게 T 세포의 cytolytic 기능을 공부에 적용 할 수있는 단일 셀 레벨에서 T-세포 매개의 세포 독성을 모니터링하기위한 높은 처리량 방법론을 제시한다.
Protocol
1. 시약 준비
- 500 ML RPMI-1640 5 ML을 혼합하여 RPMI-PLGH을 준비 페니실린 - 스트렙토 마이신, L-글루타민, 그리고 HEPES 솔루션의 각.
- 10% 태아 소 혈청 (FBS)와 RPMI-PLGH을 혼합하여 R10 솔루션을 준비합니다. FBS는 또한 30 분에 대한 ° C 이전 56에서 열 inactivated입니다.
- 37 번 프리 따뜻한 ° C RPMI-PLGH, 멸균 원추형 튜브의 R10 15 PBS의 ML, 15 ML 50 ML.
- PDMS의 nanowells의 배열의 제조 : 실리콘 마스터는 석판 술 본질적으로 이전 10 설명을 사용하여 제조된다. 철저하게 플라스틱 칼을 사용하여 Sylgard 184 엘라스토머 키트베이스와 일회용 컵에 10시 1분 체중의 비율로 경화 에이전트를 섞는다. 1 시간의 진공 챔버에서 가스를 제거하다의 혼합물. , nanowell 배열에 혼합물을 부어 유리 슬라이드로 밀봉하고 30 분에 앉아 보자. ° C 2 시간 80로 설정 오븐에 어셈블리를 전송하고 1 시간 동안 실온에서 시원한 보자. 엘라스토머는 현재 것이다이 기간과 의지의 유리 슬라이드에 결합시 전자. PDMS nanowell 배열을 포함하는 유리 슬라이드는 신중하게 스카치 테이프로 덮여와 미래의 사용까지 저장, 실리콘 마스터를 해제됩니다.
2. 대상 셀 (T) 라벨링
- 5 분에 340 XG에서 원심 분리하여 살균 15 ML 원뿔 튜브에 hemocytometer 및 펠렛 세포를 사용하여 세포 배양에서 5,000,000 대상 셀을 계산합니다. 세포 배양은 5 ML 총 볼륨 (밀도 = 1,000,000 / ML)에 전날 분할 및 T-25 플라스크 (VWR)에서 배양되어 있습니다. hemocytometer를 사용하여 셀 계산을위한 프로토콜은 이전에 11에 자세히 설명되어
- 미디어의 약 50 μl을 남기지 초과 미디어를 대기음.
- (최종 농도 2.5 μM) 150 μl RPMI-PLGH에 0.5 μl CTR 재고 (1 MM)를 혼합하여 셀 추적 레드 (CTR)의 작업 솔루션을 준비합니다. 대상 셀에 작업 솔루션 150 μl를 추가하고 P200의 피펫을 사용하여 철저하게 섞는다.반면, PKH 26 (2 μm의 최종 농도) 제조업체의 지시에 따라 라벨을 대상 셀을 사용할 수 있습니다.
- 20 분에 37 ° C / 5% CO 2 품다.
3. 효과기 (E) 셀 라벨링
- 5 분에 340 XG에서 원심 분리하여 살균 15 ML 원뿔 튜브에 hemacytometer 및 펠렛 세포를 사용하여 세포 배양에서 5,000,000 효과기 세포를 계산합니다.
- 초과 미디어를 대기음
- R10 미디어 1 ML (5 μm의 최종 농도)에 5 밀리미터 Vybrant 바이올렛 주식 1 μl를 추가하여 Vybrant DyeCycleViolet 얼룩 솔루션의 작동 솔루션을 준비합니다. 셀에 작업 솔루션을 추가하고 P200 피펫을 사용하여 resuspend. 반면, PKH 67 (2 μm의 최종 농도) 제조업체의 지시에 따라 라벨을 대상 셀을 사용할 수 있습니다. PKH 67를 사용하는 경우이 동일한 형광 채널에 있기 때문에 다음 SYTOX 그린은 사용할 수 없습니다. apoptotic 대상의 열거는 독점적를 사용하여 수행됩니다이 경우 nnexinV의 착색.
참고 : 시간 경과가 아닌 엔드 포인트 측정을 수행하는 경우, Vybrant 누나 같은 UV 염료는 피해야한다. - 20 분에 37 ° C / 5% CO 2 품다.
4. 밀도 기울기를 사용하여 라이브와 죽은 세포의 분리
- 각각 대상과 효과기 세포에 6.8 ML 및 RPMI-PLGH의 6.0 ML를 추가하고 부드럽게 등을 아래로 pipetting하여 섞는다.
- FICOLL - Paque 플러스 목표와 효과기 세포를 포함하는 각 원뿔 튜브의 하단까지의 레이어 3.5 ML. 레이어 FICOLL 천천히 FICOLL와 미디어 사이의 층을 잘 형성을 보장합니다.
- 30 분에 340 XG에 두 튜브를 원심 분리기. 노 브레이크 및 가속을 갖추고 있습니다.
- 원심 분리하는 동안 4도 판에 사전 예열 PBS 7 ML을 전송하기 만하면됩니다. nanowell 배열 (PDMS에 가공) 준비 : 에탄올과 유리 슬라이드의 깨끗한 바닥을 1 분 동안 플라즈마 산회 제를 사용하여 높은 RF 설정에서 PDMS를 산화. 이 단계는 아닌지 것또한 친수성 PDMS를 렌더링하는 동안 nanowell 배열을 rilize. 즉시 PBS를 포함하는 판에 nanowell 배열을 이동합니다.
- 바이오 안전성 캐비닛에 판을 송금 초과 PBS를 대기음. 30-45 초 다음은 10 ML DI 물과 전자 레인지가 그에 100 MG 한천 가루를 추가로 10 ML 1% 고귀한 한천을 만듭니다. 배열을 고정하고 더욱 강화하기 위해 한천 10 분을 기다려야하는 nanowell 배열을 포함하고 유리 슬라이드의 상단과 하단 가장자리에서 1 % 귀족 한천을 따뜻하게 적용합니다. 3 ML PBS 및 기음 초과 한천을 추가합니다.
- nanowell 배열의 상단에 R10의 3 ML을 추가하고 ~ 10 분 동안 평형을 보자.
- 원심 분리를 FICOLL 이후에, 각 튜브의 상단 층에서 5 ML 미디어를 대기음. 세포를 포함하는 레이어를 대기음하지 않도록주의하십시오.
- P1, 000 피펫과 새로운 멸균 원뿔 튜브로 이동이있는 FICOLL과 미디어 사이의 레이어 1-2 ML을 복구하여 세포를 (흰색 레이어) 수확. 그게 당신 맥심 확인하는 동안 세포의 두 세트에 대해이 단계를 반복복구 세포를이지는.
- 전체 가속 및 브레이크를 5 분에 340 XG에서 원심 분리하여 pipetting과 펠릿의 각 튜브, 혼합에 사전 예열 RPMI-PLGH 3 ML을 추가합니다.
- 초과 미디어를 대기음, 각 튜브에 사전 예열 RPMI-PLGH 5 ML을 추가하고 5 분에 340 XG에서 원심 분리를 반복합니다.
- 초과 미디어를 기음과 R10 500 μl의 세포 펠렛을 resuspend.
- hemacytometer에 Trypan 파랑 제외 방법을 사용하여 라이브 셀을 계산합니다.
5. Nanowell 배열로 셀 로딩
- nanowell 배열에서 초과 미디어를 기음과 배열에 걸쳐 신선한 R10의 2 ML를 추가합니다. nanowell 배열의 맨 그것이 세포의 분포에 영향을 미칠 것이기 때문에 너무 무리 / 건조되지 않았는지 확인하는 동안 다시 대기음.
- nanowell 어레이 표면에 R10 200 μl에 보증금 1 개 10 5 효과기 세포 (밀도 = 5 × 10 5 세포 / ML).
- 세포가 5 분에 정착, 실내에 표준 조직 문화 현미경 검사를 사용하자세포의 분포가 바람직하다 있는지 확인합니다. 필요한 경우 더 많은 셀을 추가 할 수 있습니다.
- 보증금 1 개 10 nanowell 어레이 표면에 200 μl R10 5 대상 세포 (밀도 = 5 × 10 5 세포 / ML).
- 세포가 5 분 및 세포의 분포가 바람직하다 수 있도록 표준 조직 문화 현미경 검사를 사용하기위한 해결하자. 필요한 경우 더 많은 셀을 추가 할 수 있습니다.
- 2 ML R10 및 기음 초과 미디어와주의 깊게 nanowell 배열을 씻어.
- 15 ML 원뿔 튜브를 멸균에서 3 ML 미리 예열 R10를 준비합니다. 얼룩 0.5mM SYTOX 그린 핵산 3 μl (최종 농도 0.5 μM) 및 작업 솔루션을 준비하는 Annexin V-알렉사 형석 647의 60 μl를 추가합니다. 세포가 우물에서 변위되지 않도록하는 동안주의 깊게 4도 판로 작업 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
- 15 분에 37 ° C / 5% CO 2 품다.
6. 영상 1
- 형광 micr를 사용하여 nanowell 배열의 이미지를 취득oscope :이 예제에서, 우리는 동력 무대와 람다-DG4을 갖추고 Z-1 현미경 ZEISS의 옵저버를 사용합니다.
- 소프트웨어 및 현미경을 초기화하고 전송 빛과 다른 형광 채널에 신호 강도를 확인합니다. 전반적으로,에 대응하는 다섯 채널을있을 것입니다 : 전송 빛, Annexin V-647 (Cy5 필터), CTR (DsRed 필터), SYTOX 녹색 (FITC 필터) 및 Vybrant 바이올렛 (DAPI 필터). 이 채도를 피하는 동안 소음에 최대 신호를 보장하기 위해 설정 현미경 있는지 확인합니다.
- X와 nanowell 배열에 대한 Y 위치를 설정합니다. 제로 위치를 설정하고 nanowell 배열 스탬프의 왼쪽 상단 모서리에 7 X 7 nanowell 배열 블록의 중심에 초점을 초기화하여 과정을 시작합니다. 정확하게 각 블록에 포커스를 반영하기 위해 각 블록의 센터와 Z-값으로 일치 할 수있는 X, Y 위치를 설정합니다.
- 위치 및 초점 준비되면, 선형 모드에서 이미지 획득을 설정하고 이미지를 획득해야합니다.
7. 후 영상
6 시간을위한 인큐베이터 (37 ° C / 5퍼센트 CO 2)로 nanowell 배열을 포함하는 4 잘 판을 전송합니다.
8. 영상이
6 단계에서 설명한대로 시간이 지점 두 번째에서 이미지를 획득.
9. 이미지 분석
- nanowells 내에서 세포의 수용 인원은 적절한 이미지 분할 프로그램 사용 (예 : ImageJ에 의해 결정됩니다 http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) 기본적으로 이전에 9,12 설명했다.
- 현미경 이미지 (t = 0 시간, t 0)의 초기 집합의 분석은 정확히 하나의 라이브 대상 셀을 (식별이 포함 된 개인 nanowells의 데이터베이스를 생성하는 데 사용됩니다로 레드 CellTracker, 빨간색)없이 죽은 세포 (Annexin V의 착색에 의해 식별, 녹색) [T1t 0 nanowells].
- 현미경 이미지 (t = 6 시간, t 6)의 두 번째 세트의 분석. 독립적 한 대상 셀 (빨간색) [T1t 6 nanowells]를 포함하는 nanowells의 두 번째 데이터베이스를 결정하는 데 사용됩니다 무결성 검사 (데이터베이스 쿼리)는 t 0의 모든 라이브 타겟이 일치하는 타겟의 최종 세트를 (T1t 0 T1match로 지정 = T1t 6 있습니다 nanowells로 구현) 생산 t 6에서 목표에 일치되는 것을 보장하기 위해 구현됩니다
- nanowells의 이펙터 세포의 수는 t 0 [E1 nanowells]에 Vybrant 보라 착색을 사용하여 결정됩니다
- 데이터베이스 쿼리는 (E1T1로 지정된 E1 및 T1 경기를 nanowells으로 정의), 하나의 목표로 공동 incubated 하나 effectors를 포함하는 nanowells를 식별하는 구현
- 이펙터 유도 apoptosis는 내가이 점수는 t 0과 긍정적 인 Annexin V t 4에 (t 6에서 Annexin V 대상 착색과 E1T1)에서 제외 Annexin V 아르 목표를 dentifying.
10. 니콘의 BioStation IM을 사용하여 살인의 선택 시간 경과 영상
- coverslip 바닥과 페트리 접시를 타고 정확히 coverslip에 맞게됩니다 nanowell 배열 칩의 작은 조각을 (5 단계에서 작성) 잘라. 깍 칩이 젖었 유지 있는지 확인하십시오.
- 믹스 1 개 10 6 목표 및 100 μl 미디어 1 개 10 6 T 세포, 그리고 coverslip에 그것을 피펫.
- 15-30 분 정도의 세포가 정착하게 할 수 있습니다.
- 신속 작은 nanowell 어레이 칩을 반전하고 coverslip에 배치.
- 칩이 칩의 상단에 이미지, 장소 중에 하나 또는 두 개의 20mm X 20mm coverslips을 이동할 수 없습니다되도록하기 위해. 요리의 맨 아래에있는 칩을 밀어 부드럽게 압력을 적용합니다.
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Representative Results
높은 처리량 cytolytic 분석의 응용의 예는 그림 2에 보여 있습니다. 간단히, CD19 별 CAR 표시 + T 세포는 nanowell 배열의 각 우물 (제 1-5)에 표시된 마우스 EL4 대상 세포와 공동 incubated되었습니다. 초기 이미지는 배열 (제 6 항)에 하나 하나 nanowell의 수용 인원을 (effectors 및 / 또는 타겟) 식별하기 위해 자동 형광 현미경에 기록되었습니다. 이미지 처리는 정확히 하나의 대상과 하나의 이펙터를 포함하는 모든 nanowells을 확인하고 죽은 대상 (제 9) 포함 nanowells를 제외하는 데 사용되었다. 이 칩은 6h에 대한 보육에 전송 된 후 칩의 두 번째 이미지는 (제 7-8) 기록되었다. 대상 셀의 apoptosis를 유도하는 이펙터의 기능은 정확히 하나의 이펙터 한 목표를 포함 nanowells에서 Annexin V와 얼룩에 의해 측정되었다. 두 개의 평행 한 실험은 같은 effectors와 두 세트의 O를 실행 한F 대상 세포 (EL4-CD19 + 및 EL4-CD19-(대조군)) 항원 특정 용해의 빈도를 (그림 2)을 결정합니다. 이 비 특정 용해 (~ 2-4%)의 낮은 주파수를 달성하는 것이 바람직하다. 방법은 적절한 대상 세포와 병렬 실험의 가용성에 따라 달라집니다 것은 effectors의 독립적 인 대상의 apoptosis를 결정하기 위해 실행됩니다. 6h 기간 (> 8 %) 이상 effectors의 부재에서 대상 apoptosis의 높은 주파수 배양 및 분석 조건을 최적화 할 필요를 나타냅니다. nanowell 배열은 지속적인 모니터링이 필요한 경우 시간 경과 영상을위한 적응 (영화 1)이 이펙터 - 대상 활용 및 후속 세포 사망의 관찰을 허용 할 수 있습니다.
1 그림. nanowell 배열 기반 cytolytic 분석의 A. 도식이 있습니다. 차를 부릅니다 +T 세포 (파란색)과 대상 셀은 (적색) nanowells의 배열에 incubated 수 있습니다. 현미경은 효과기 매개 대상 cytolysis을 모니터링하는 데 사용됩니다. CD19 특정 자동차의 B. 대표 복합 micrographs + EL4-CD19 + 대상 셀과 그렇지들에 apoptosis를 유도 T 세포.
그림 2. CD19 별 CAR + T 세포의 항원 특정 cytolytic 활동. 공동 배양 6 시간 이후에 하나의 이펙터와 하나의 목표를 포함하는 우물의 대상 셀 히스토그램 플롯. effectors없이 대상 셀의 일치 histograms는 배경 세포 사망의 빈도를보고 표시됩니다.
영화 1. 차 시간 경과 현미경 + T-세포 매개의 cytolysis. CAR + T 세포는 (라벨이없는) NA에 NALM-6-GFP + 대상 세포 (녹색)와 함께 공동 incubated되었습니다nowell 및 이미지는 동적 모니터링을 활성화하려면 12 시간의 총 매 2 분 촬영 된 것입니다. Annexin V는 문화 매체에 추가되었습니다 및 apoptotic 세포는 빨간색으로 표시된다.
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Discussion
우리는 nanowells의 배열 (그림 1) effectors 및 대상의 공동 배양을 통해 활성화 높은 처리량 단일 셀 cytolytic 분석을위한 프로토콜을 설명하고 있습니다. 처리량뿐만 아니라 기술의 주요 장점은 결과적으로 대상 셀과 autologous 또는 기본 / 검색 종양 세포의 사용을 허용 대상 세포 공학 필요없이 원하는 대상 세포에 대한 이펙터로 인한 세포 독성을 모니터링 할 수있는 기능입니다. 공간 제한은 검정 9 끝의 검색 및 기능 T 세포의 후속 복제 할 수 있습니다. 분석의 한계는 자동화 단계와 빠른 스위칭 광학있는 전문 현미경이 필요합니다. 이 그러나이 기계는 지금 연구 핵심 시설의 일환으로 널리 사용할 수 있습니다 점을 감안할 때 심각한 제한이 없습니다.
높은 처리량을 제공합니다 흐름 세포 계측법 기반 assays의 다양한 방법이 있지만 preservi단일 셀 해상도 것이다. 이러한 effectors 및 대상 13,14의 caspase / granzymes 활동의 대리 degranulation을위한 마커 (CD107a) 또는 perforin 콘텐츠를 얼룩 assays가 포함되어 있습니다. 이러한 assays 그러나 진정 효과기 - 대상 활용 또는 여러 개의 목표를 참여하고, 살인을 할 수있는 이펙터의 기능을 모니터링하지 않습니다. 이러한 E에서 실행 4h 51Cr 릴리스 분석 등 금 표준 검정에 비해 : 여전히 단일 셀 해상도를 제공하는 동시에 1시 1분의 T 비율, 우리의 방법론은 일반적으로 cytolytic effectors 같은 전체 수를보고합니다. 이전에 명시된 프로토콜이 여기에 세포 독성에서만 자세한 내용을 설명하지만이 분석은 쉽게 대상 결합 9시 단일 이펙터 세포 분비 크린 시토 킨을 결정하는 microengraving 분석과 결합 할 수 있습니다. 이 차의 복합 기능 프로필 + 단일 셀 수준에서 세포 독성 및 시토 킨 분비를 결합 T 세포를 생성하는 따라서이 가능합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
연구 상 번호 R01CA174385에 따라 국립 보건원 국립 암 연구소에 의해 지원 된이 출판물에보고했다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 전망을 대표하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
| Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
| SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
| Dulbecco's PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
| Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
| Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
| 4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
| Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
| Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
| Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
| 15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
| Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |
References
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