Summary
Метод для быстрого и полного удаления клеточных компонентов из сердца свиньи нетронутым через ретроградной перфузии описано. Этот метод дает конкретного участка сердечной внеклеточного матрикса леса, который имеет потенциал для использования в различных клинических применений.
Abstract
Перфузии на основе целого decellularization орган недавно получил интерес в области тканевой инженерии в качестве средства для создания конкретных участков леса внеклеточной матрицы, в то время как в значительной степени сохранение родного архитектуры на эшафот. На сегодняшний день, данный подход был использован в различных системах органов, включая сердце, легкие, печень и 1-5. Предыдущие методы decellularization для тканей, не легко доступны сосудистой сети, сделали ставку на длительном воздействии ткани для решения моющих средств, кислот, или ферментативного лечения в качестве средства для удаления клеточных и ядерных компонентов из окружающей внеклеточной среды 6-8. Однако эффективность этих методов навесной на способность решения проникать в ткани с помощью диффузии. В отличие от перфузии органов через естественные сосудистой системы эффективно уменьшить расстояние диффузии и способствовали перевозки decellularizatiна веществ в тканях и клеточных компонентов из ткани. Здесь мы опишем метод, чтобы полностью decellularize нетронутыми сердца свиньи через коронарные ретроградной перфузии. Протокол дали полностью decellularized сердечной внеклеточного матрикса (С-ECM) эшафот с трехмерной структурой сердце нетронутой. Наш метод использовался ряд ферментов, моющих средств, и кислоты в сочетании с гипертонической и гипотонической полоскания, чтобы помочь в лизис и удаление клеток. Протокол, используемый раствор трипсина чтобы отделить клетки от матрицы следует Triton X-100 и натрий решения дезоксихолата, чтобы помочь в удалении клеточного материала. Описанный протокол также использует перфузии скоростью более 2 л / мин в течение длительных периодов времени. Высокая скорость потока, в сочетании с решением изменения позволили транспортных агентов в тканях без загрязнения клеточных обломков и обеспечить эффективное полоскание тканей. Описанный способ удалить все ядерные материалы от Нативе свиного сердечной ткани, создавая сайт-специфической сердечной ECM эшафот, которые могут быть использованы для различных применений.
Protocol
1. Подготовка ткани и настройки эксперимента
- Урожай свиного орган сразу же после эвтаназии от объекта бойне или научно-исследовательских и смыть избыток крови. Обрежьте сердце лишний жир и ткани, сохраняя предсердия и аорты без изменений. Обрежьте жир для отделения легочной артерии от аорты. Если есть какие-либо сокращения в ткань, удалить надлежащим образом.
- Оберните каждую сердце индивидуально в морозильной камере бумагу и хранить все ткани в -80 ° C морозильнике в течение по крайней мере 24 часа в сутки, чтобы обеспечить полное замораживание.
- Когда все будет готово для использования (как правило, менее чем за 3 месяца), оттепель один неповрежденный замороженной свинины в сердце Type 1 воде на ночь погруженный в 4 л стакане при температуре 4 ° C.
- После того, как сердце полностью оттаять, погладить сердце сухо, вес сердца, и запишите вес. Сердце свиньи весом рынке должна весить приблизительно 375-450 гр.
- Подключите размер 18 Masterflex трубки к ¼ "конца колючей редуктора. Вставьте колючей редуктора итрубка внутри аорты. 2 место хомутов или безопасной связи почтовый индекс вокруг аорты, чуть ниже брахиоцефальных ствола. Редуктора и трубы должна оставаться выше аортального клапана, так коронарных артерий может быть перфузии (рис. 1).
- Используйте 30 или 60 мл шприц, чтобы заполнить трубопровод с I типа воды. Вставьте трубку в картридж насос Masterflex ролик на ее приближенные середине. Погрузитесь приток конец трубки в нижней части 4 л стакан наполнен 2,5 л воды и закрепить трубку.
- Поместите сердце в стакан наполнен водой, и премьер-насос для удаления пузырьков воздуха. Если пузырьки наблюдаются ближайшие от аорты, где трубка вставляется, аорты, возможно, придется изменить или крепится с помощью дополнительных связей. Герметичность важно поддерживать достаточное давление во время decellularization процесса (рис. 2).
- Поместите 4 л стакан, содержащий 3 л 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 Решение о мешалки и прогрейте его до 37 ° C в подготовке decellularization процесса.
2. Ткань Полоскания
- Установить насос с расходом 400 мл / мин, что обеспечивает правильный размер трубы выбран. Промойте сердце с I типа воде в течение 15-25 мин. Как насос, сердце должно набухать и изливать кровь из желудочков. Свежее решение должно быть заменено каждые 5-10 минут, или по мере необходимости в зависимости от количества крови удалены от сердца. Если кровь не изливается из сердца, отрегулировать трубки и зажимы по мере необходимости.
- Остановите насос и передать сердца в отдельный стакан наполнен 2X фосфатным буферным раствором (PBS). После того, как трубка погружена в раствор, включить насос и увеличить скорость потока до 700 мл / мин. Сердце должно оставаться в растворе в течение 15 мин, меняя раствора каждые 5 мин. Каждое решение требует изменения насос будет остановлен временно, пока ткань и трубки перемещаетсяна новый стакан.
- Передача сердце тип I воде в течение 10 мин и увеличить скорость потока до 750 мл / мин.
3. Decellularization и решение Perfusion
- Передача сердце в стакан, содержащий 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 при температуре 37 ° C. Увеличение скорости насоса до 1200 мл / мин и запустить насос. Используйте мешалкой помещают на дно стакана распространить решение в стакан. Сердце должно оставаться в 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 раствора при 37 ° С в течение в общей сложности три часа. Через 1 час, увеличить скорость насоса до 1500 мл / мин. После дополнительного часа, увеличить скорость насоса до 1800 мл / мин. Ткань постепенно подвергается увеличилась скорость перфузии в состоянии тканей и предотвратить разрыв сосудов. Сердце будет набухать и почти в два раза в размерах во время этого шага протокола. Ткань потеряет свой естественный цвет, прогрессируя от предсердий к вершине по всему гоэлектронной протокола (рис. 3).
- После каждого решения перфузии, в два этапа полоскания выполняется для удаления продуктов распада клеток, химических остатков, и лизис помощи клеток. Каждый промыть состоит из 10 минут промыть в I типа воды, а затем 10 мин смойте 2X PBS раствора при комнатной температуре. Каждое мытье состоит из удаления раствора из оригинальных стакана, добавив, промыть решения, и оборотных перфузат в стакан, содержащий погруженный сердце. После того, 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 раствора, заливать воду в 1900 мл / мин, а затем заливать 2X PBS на 1950 мл / мин.
- Передача сердце раствор 3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 при комнатной температуре. Увеличение скорости насоса до 2000 мл / мин и заливать раствор в течение одного часа. Удалить раствор из стакана и заменить свежим раствором, увеличить скорость насоса до 2100 мл / мин, и заливать свежее решение для дополнительного полтора часа, в результате чего общее время в3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 до 2,5 часов.
- Промойте ткань в I типа воды при 2150 мл / мин и 2X PBS в 2180 мл / мин в течение 10 минут каждый.
- Передача сердца к 4% раствор натрия Deoxycholate при комнатной температуре. Увеличение скорости насоса до 2200 мл / мин и заливать раствор в течение 3 часов.
- Промойте ткань в I типа воды и 2X PBS на 2200 мл / мин в течение 15 минут каждый, изменение решения через 5-10 мин для каждого решения. Описанные шаги перфузии может быть разделена на несколько дней, выполняя шаг дважды промыть и хранении сердца с прикрепленной трубкой в течение ночи при температуре 4 ° С и погружают в I типа воды.
- На следующий день, выполнить 5 минут смойте водой типа I при 750 мл / мин, а затем на 5 минут промыть в 1X PBS в 1500 мл / мин. Протокол может быть продолжено на описанные скорость потока в соответствующем решении.
4. Дезинфекция и окончательная обработка
- Передача сердца 0,1% peracуксусной кислоты / 4% раствор этанола и заливать раствор в течение 1,5 ч при 2200 мл / мин.
- Окончательный полосканий для тканей всех выполненных на 2200 мл / мин. Заливать ткани с 1X PBS в течение 15 мин, а затем два 5 минут моет в I типа воды. Эта серия полоскания повторяют еще раз, чтобы завершить процедуру решения перфузии.
- Поверните насос и снимите сердце от решения слить сердца. Вырезать связи от аорты, удалить все трубы, и поместить сердце в пустой стакан для слива в течение 1 часа. Избыток жидкости будет необходимо периодически сливать. Положите сердце на впитывающей прокладки, чтобы полностью слить сердца (рис. 4).
- После того, большая часть воды удаляется, запишите вес сердечно внеклеточного матрикса (C-ECM). Сердце может быть как ожидается, потеряет около 20-25% от своего первоначального веса во время decellularization процесса.
- Проанализируйте правого и левого желудочков, а также межжелудочковой перегородки для ДНК quantificatiна и гистологической обработки для того, чтобы подтвердить полное decellularization ткани (рис. 5).
- Замораживание C-ECM при -80 ° C в течение по крайней мере 2 часа до лиофилизации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эффект decellularization по всем сердцем свиньи, естественно, варьируется из-за различий в размерах, давления и судно договоренности. Таким образом, точный состав производного внеклеточной матрицы леса не будет таким же, от сердца к сердцу. Завершения описанных протокола даст сердца, которая появляется белый или прозрачный, с указанием потери клеточного материала. Тем не менее, общепризнано, что ткань можно считать "decellularized", основанный на сочетании нескольких количественных параметров 8. Успешный протокол decellularization будет производить матрицы с менее чем 50 нг двухцепочечной ДНК в мг ткани (рис. 6). Для того чтобы избежать иммунного ответа при имплантации матрицы, остальные ДНК должна также содержать менее 200 пар оснований (рис. 7). Для подтверждения этих выводов, гематоксилином и эозином должна выявить отсутствие ядерногоокрашивание в представительных участков желудочков и межжелудочковой перегородки (рис. 8). Trichrome Массона еще раз подтверждает потерю сердечных мышечных пучков и сохранение коллагена сетей (рис. 9).
Рисунок 1. Колючей конец трубки вставляется в аорту родного сердца. Трубы должны быть закреплены с помощью хомутов или почтовый связей выше аортального клапана для обеспечения перфузии через коронарные артерии.
Рисунок 2. Сердце погруженным в воду в стакан и 4L пузырьки воздуха должны быть удалены из трубки. Если пузырьки наблюдаются возникающие от аорты вблизи трубы, дополнительные связи должны быть использованы для обеспечения трубки к т Он аорты для того, чтобы поддерживать необходимое давление в тканях.
Рисунок 3. Качестве решения перфузии через коронарные артерии, сердце потеряет свой родной цвет, прогрессируя от предсердий к верхушке сердца и локализованных вокруг коронарных артерий.
Рисунок 4. После завершения дезинфекции и промывки шагов протокола, трубка удаляется, а сердце находится на впитывающей прокладки, чтобы позволить лишнюю воду слить из сердца. Это обеспечивает точные измерения при взвешивании ткани, а также позволяет ткани, чтобы расслабиться перед секционирования.
ГУ "ALT =" Рисунок 5 "/>
Рисунок 5. Левого желудочка (ЛЖ), правого желудочка (ПЖ) и межжелудочковой перегородки все удалены из decellularized сердце для гистологической обработки, замораживания и лиофилизации, и ДНК количественной оценке.
Рисунок 6. Количественный анализ содержания ДНК с использованием анализа Pico Green. Желудочков сердца от КМСЕ показывают значительное снижение содержания ДНК в сравнении с родной желудочков. ДНК значений, наблюдавшихся с этим протоколом наблюдается на уровне или ниже 50 нг / мг стандарт для тканей decellularized.
Рисунок 7. Размер фрагментов ДНК, как это определено ethidiuм метила гель, показал немного остаточной ДНК в decellularized желудочков по сравнению с мочевого пузыря матрицы (UBM) стандарт.
Рисунок 8. Гематоксилином и эозином показали полное удаление ядерного материала из желудочков после завершения decellularization протокол.
Рисунок 9. Trichrome окрашивания Masson о) родные и B) decellularized желудочка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Данное исследование описано методология последовательной и эффективной decellularization из свиного сердца. Протокол был модификацией ранее опубликованного отчета 1, и включить больше воздействием потока и повышения давления, в котором содержится более воспроизводимые результаты. Полученную ткань decellularized встретился всех опубликованных критериев для успешного decellularization ткани 2. Частые изменения решения были выполнены, чтобы ограничить повторное введение клеточного материала к ткани, а продолжительность воздействия каждого агента decellularization было сведено к минимуму, чтобы уменьшить неблагоприятное воздействие на ECM. Во время начальной стадии протокола, скорость перфузии постепенно увеличена до состояния тканей и позволяет более высокие скорости потока на поздних стадиях протокола. Без кондиционирования тканей на ранних стадиях, сосудистой сердце может разорваться, что делает перфузии сердца невозможно. ПротоПолковник был использован в связи с его эффективностью, и претензии не внесенных в его превосходстве над другими протоколами. Точный состав decellularization агентов и скорости перфузии предположительно могут быть изменены для получения протоколов с лучшими механическими или биологическими характеристиками, но общие принципы для доставки агентов в сердце плату.
Сохранение родного трехмерную структуру сердце было приписано несколько процедур, выполняемых по всему decellularization протокол. Во-первых, ткань была урезана и замораживают по прибытии. Замораживание способствовать лизису клеток и имеет важное значение для предварительной подготовки ткани для перфузии циклов. Ткань тщательно проверяются на наличие порезов и 2 см нетронутой нетронутой аорту выше аортального клапана. Если перикарда или эпикарда был сокращен, орган был отброшен из-за перфузат не достигли вниз по течению области сердца, а сердце не было полностью decellularized.Далее, ткань была полностью талой в I типа водой перед использованием. Воды позволило ткани, чтобы расслабиться, как это талых, а также помогали удаления остаточных сгустков крови внутри сердца. Наконец, как трубка была вставлена, были приняты меры к тому, чтобы аортального клапана остались нетронутыми, так что она образуется водонепроницаемое уплотнение вокруг трубы, так что надлежащее давление поддерживали и что решение вошел в коронарных артериях.
После каждого decellularization протокол был завершен, ряд мер контроля качества были завершены, чтобы обеспечить полное удаление клеточного материала. В настоящее время исследования подтвердили, что протокол устранены гистологическое окрашивание ядер клеток, показали, что менее 50 нг ДНК присутствовал на мг сухого веса ткани, и что любая ДНК менее 200 б.п. в размере 6. Ранее опубликованные методы сердечно decellularization показали аналогичные уровни decellularization окраски ДНК и количественной2,5,9,10. Полное decellularization было достигнуто в этих исследованиях с использованием аналогичных процедур ферментов и моющих средств. Тем не менее, в настоящем исследовании, длительность воздействия каждого химического вещества была увеличена, было больше изменений решение, и скорость потока была увеличена. Настоящий Протокол также увеличена длина химической промывки, что может привести к более эффективному удалению остатков химических веществ из внеклеточной матрицы.
Recellularization из decellularized сердца крыс с сердечной специфических клеток дало многообещающие результаты в пробирке 2,5. Всего decellularization перфузии органов разрешено для поддержания родного сосудов, что имеет решающее значение в recellularization ткани. Присущих факторов роста, матричные белки, и трехмерные волокна архитектура также способствует надлежащей прикрепление клеток, миграции и сигнализации для восстановления сократительной ткани миокарда. Свиной сердечной extracelluLAR матрица будет труднее recellularize из-за размера эшафот и количество клеток, необходимые для правильного сотовой связи и перенос питательных веществ. Тем не менее, патчи, вырезанные из сердечной матрица может быть полезна для приложений в естественных условиях. Многочисленные исследования показали потенциальные преимущества использования конкретных участков матрицы для восстановления поврежденных тканей в животных моделях 11-13. Таким образом, внеклеточный матрикс эшафот, полученные из сердечной ткани желательно инфаркт приложений реконструкции. Присущими архитектуре сердечной ткани могут представлять преимущества по сравнению с ECM эшафот, полученных от другого органа или искусственных биоматериала. Конкретных участках лесов может поддерживать инфильтрации клетки-хозяина и содействовать развитию конструктивного ответа реконструкции, в отличие от образования рубцовой ткани. На сегодняшний день, сердечной ECM патчи были исследованы в естественных условиях для реконструкции дефектов создан в стенки миокарда 14. Будущие студентыштампов будут проводиться в пробирке для изучения способности лесов для поддержки сердечной клетки высевают и культивируют на матрице. Методы, описанные здесь, могут быть применимы также к decellularization человеческих сердец.
В заключение свиного сердца decellularization можно и методов прямой вперед. Продолжение расследования этого материала обеспечит понимание ее потенциал для клинического применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Доктор Гилберт был на Научно-консультативного совета при Acell, Inc в то время как исследование было сделано, и в последнее время стал вице-президентом по исследованиям и развитию. Acell, Inc продает мочевого пузыря и матрица не имеет коммерческий интерес в данном исследовании.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность Броган гостей, Мишель Уивер и Кристен Липперт. Финансирование для этого исследования был предоставлен грант NIH R03EB009237, а также обучение грантов NIH T32EB001026-06 от Национального Института биомедицинской визуализации и биоинженерии и T32HL076124-05.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
References
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
- Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
- Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
- Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
- Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).
