Summary
신속하고 완벽하게 역행 재관류를 통해 그대로 돼지의 심장에서 세포 구성 요소를 제거하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 여러 임상 응용 프로그램에서 사용하기 위해 가능성이있는 사이트 특정 심장 세포 외 기질 비계를 산출.
Abstract
크게 비계의 기본 구조를 유지하면서 재관류 기반 전체 오르간 decellularization은 최근, 특정 사이트 세포 외 기질 공사장 공중 발판을 만들 수있는 수단으로 조직 공학 분야에 대한 관심을 얻었습니다. 현재까지이 방식은 심장, 폐, 간 1-5을 포함한 장기 시스템의 다양한 활용되었습니다. 쉽게 접근 할 수 혈관 네트워크가없는 조직에 대한 이전 decellularization 방법은 세제, 산, 또는 주변 세포 환경 6-8에서 세포와 핵 구성 요소를 제거하는 수단으로 효소 트리트먼트 솔루션에 조직의 장시간 노출시 의존하고 있습니다. 그러나, 솔루션의 능력에 따라 이러한 방법 힌지의 효과는 확산을 통해 조직을 침투합니다. 대조적으로, 자연 혈관 시스템을 통해 기관의 재관류 효과적으로 확산 거리와 decellularizati의 촉진 수송을 감소조직에서 조직과 세포의 구성 요소에 에이전트 있습니다. 여기, 우리는 완전히 관상 동맥 재관류 역행을 통해 그대로 돼지의 심장을 decellularize하는 방법을 설명합니다. 프로토콜은 그대로 심장의 3 차원 구조를 완벽하게 decellularized 심장 세포 외 기질 (C-ECM) 비계를 굴복. 우리의 방법은 효소, 세제, 그리고 세포의 용해 및 제거에 도움 hypertonic과 hypotonic 린스와 커플 링 산 일련의를 사용했습니다. 프로토콜은 세포 물질의 제거에 도움 튼 X-100과 나트륨 deoxycholate 솔루션 다음 행렬의 세포를 분리하는 트립신 솔루션을 사용했습니다. 설명 프로토콜은보다 큰 2 L / 오랜 시간 동안 분 재관류 속도를 사용합니다. 세포 파편의 오염없이 조직에 대리인의 교통편을 허용 및 솔루션 변경과 결합 높은 유량은 조직의 린스 효과 보장. 설명 방법은 nati의 모든 핵 물질을 제거응용 프로그램의 다양한 사용할 수있는 특정 사이트 심장 ECM 비계를 만들고, 돼지의 심장 조직이 있어요.
Protocol
1. 조직 준비 및 실험 설정
- 즉시 도살장 또는 연구 시설에서 안락사 이후 초과 피가 묻은 손을 씻어 수확 돼지의 기관. 심방과 대동맥을 그대로 유지 초과 지방 및 조직의 마음을 잘라. 거리에 대동맥에서 폐동맥을 분리 할 지방 트림. 조직에 상처가있는 경우, 적절하게 폐기하십시오.
- 냉동고 종이에 개별적으로 마음을 정리하고 완전한 냉동을 보장하기 위해 최소 24 시간에 -80 ° C의 냉동고에있는 모든 조직을 저장합니다.
- 할 때 사용 (보통 미만 3 개월), 밤 4 ° C.에서 4 L의 비커에 잠겨 1 형 물에 해동 한 그대로 냉동 돼지의 심장 준비
- 마음이 완전히 해동 한 후, 심장이 건조 두드려 마음을 무게, 그리고 무게를 기록합니다. 시장 무게 돼지의 심장은 약 3백75-4백50g 무게해야합니다.
- 가시 감속기의 ¼ "끝으로 크기를 18 Masterflex 관을 연결합니다. 가시 감속기를 넣고대동맥 내부 튜브. 단지 팔 머리 트렁크 아래의 장소 2 호스 클램프 또는 대동맥 주위 안전한 우편 관계. 감속기와 튜브는 대동맥 밸브 위에 유지해야하며, 관상 동맥이 (그림 1) perfused 할 수 있도록.
- 유형 I 물 튜브를 채우기 위해 30 또는 60 ML의 주사기를 사용합니다. 대략 중간 지점에 Masterflex 롤러 펌프의 카트리지 내에 튜브를 삽입합니다. 유입 물 2.5 L로 가득 4 L의 비커의 바닥에있는 튜브의 끝과 튜브를 확보 잠기.
- 물이 담겨있는 비커에 심장과 기포를 제거하는 주요 펌프를 놓으십시오. 거품이 튜브가 삽입되어있는 대동맥에서 오는 관찰하는 경우 대동맥 추가 관계로 재배치 또는 보안해야 할 수 있습니다. 밀폐 씰은 decellularization 프로세스 (그림 2)에 적절한 압력을 유지하는 것이 중요합니다.
- 0.2 % Trypsin/0.05 % EDTA/0.05 % 할머니 3 L를 포함하는 4 L의 비커를 놓고판을 저어 37에 따뜻하게에 ° C decellularization 과정의 준비 3 솔루션입니다.
2. 조직 린스
- 올바른 튜브 크기가 선택되어 있도록, 400 ML / 분의 유량으로 펌프를 설정합니다. 15-25 분 동안 I 물을 입력으로 마음을 플러시. 펌프가 시작되면서 마음은 팽창과 심실에서 혈액을 발산한다. 신선한 솔루션은 모든 5-10 분 대체, 또는 심장에서 제거 혈액의 양에 따라 필요합니다. 혈액은 심장에서 했소하지 않는 경우, 필요에 따라 튜브와 클램프를 조정합니다.
- 펌프를 중지하고 배 인산로 가득 별도의 비커에 마음을 전송할는 식염 (PBS)를 버퍼. 튜브는 솔루션에 잠수 한 후, 펌프를 시작하고 700 ML / 분으로 유량을 향상시킬 수 있습니다. 마음이 솔루션마다 5 분을 변경, 15 분에 대한 솔루션 유지됩니다. 각 솔루션 변경 사항은 조직과 튜브가 이동하는 동안 일시적으로 중지 할 펌프가 필요합니다새로운 비커합니다.
- 10 분에 I 물을 입력하고 750 ML / 분으로 유량을 증가 심장을 전송합니다.
3. Decellularization 및 솔루션 재관류
- 37 세 할머니 0.2 % Trypsin/0.05 % EDTA/0.05 %를 포함하는 비커에 마음을 전송 ° C. 1200 ML / 분에 펌프 속도를 증가하고 펌프를 시작합니다. 비커에 솔루션을 순환 할 수있는 비커의 바닥에 배치 저어 줄을 사용하십시오. 마음은 3 시간 총 37 ° C에서 0.2 % Trypsin/0.05 % EDTA/0.05 % 할머니 3 솔루션에 남아 있어야합니다. 1 시간 후, 1500 ML / 분에 펌프 속도를 향상시킬 수 있습니다. 추가 시간 후, 1800 ML / 분에 펌프 속도를 향상시킬 수 있습니다. 조직은 천천히 조건 조직을로 증가 관류 속도를 받게과 혈관의 파열을 방지합니다. 마음은 프로토콜이 단계에서 크기로 팽창 거의 두 번합니다. 조직 회에 걸쳐 심방에서 꼭대기까지 진행, 자연 색상을 잃게됩니다전자 프로토콜 (그림 3).
- 각 솔루션 재관류 후, 린스 두 단계는 세포 파편, 화학 잔류 물, 그리고 원조 세포 용해를 제거하는 수행됩니다. 각 린스은 10 분으로 구성되어 전 10 분 뒤에 물이 상온에서 2 배 PBS 솔루션을 씻어 유형에 씻어. 각 헛된 솔루션을 헹굼 추가, 침수 마음을 포함하고있는 비커 안에 perfusate를 순환, 원래 비커의 용액의 제거로 구성되어 있습니다. 다음 0.2 % Trypsin/0.05 % EDTA/0.05 % 할머니 3 해결책 후, perfuse 1900 ML / 분의 물과 1950 ML / 분에서 2 배 PBS를 perfuse.
- 3퍼센트 상온에서 튼 X-100/0.05 % EDTA/0.05 % 할머니 3의 솔루션으로 마음을 전송합니다. 2000 ML / 1 시간 분, perfuse 솔루션에 펌프 속도를 향상시킬 수 있습니다. 비커의 용액을 제거하고 신선한 솔루션으로 교체 2100 ML / 분에 펌프 속도를 높일 수 있으며, 추가 시간 반 동안 신선한 솔루션을 perfuse, 총 시간을 가져3퍼센트 튼 X-100/0.05 % EDTA/0.05 % 할머니 3 2.5 시간합니다.
- 2180 ML / 10 분 각각에 대한 분에 2150 ML / 분, 배 PBS에서 유형 I 물에 조직을 씻어.
- 실온에서 4 % 나트륨 Deoxycholate 솔루션에 마음을 전송합니다. 2200 ML / 분, 3 시간에 perfuse 솔루션에 펌프 속도를 향상시킬 수 있습니다.
- 에서 유형 I 물에 조직을 씻어 배 PBS 2200에서 각 솔루션 5-10 분 후 솔루션을 변경하는 15 분마다에 대한 ML / 분. 설명 재관류 단계는 두 번 헹굼 단계를 수행, 4 ° C에서 하루 아침에 첨부 된 튜브로 마음을 저장하여 여러 일 동안 분할 및 유형 I 물에 잠겨 할 수 있습니다.
- 다음 날, 5 분 ML / 분 1,500에서 1X PBS로 씻어 5 분 뒤에, 750 ML / 분에서 유형 I 물로 씻어 수행합니다. 프로토콜은 다음 적절한 솔루션에 설명 된 유속으로 계속 될 수 있습니다.
4. 소독 및 최종 처리
- 0.1 % perac로 마음을 전송etic 산 / 2200 ML / 분에서 4 %의 에탄올 솔루션과 1.5 시간에 대한 perfuse 솔루션입니다.
- 조직에 대한 최종 린스는 모두 2200 ML / 분에서 수행됩니다. 유형 I 물에 두 개의 5 분 세차 다음 15 분을 위해 1X PBS로 조직을 Perfuse. 린스의이 시리즈는 솔루션 재관류 절차를 완료하기 위해 한번 더 반복됩니다.
- 펌프를 끄고 마음을 배수하는 솔루션에서 마음을 제거합니다. 대동맥의 인연을 끊고, 모든 튜브를 제거하고 1 시간에 소모 할 수있는 빈 비커에 마음을 놓으십시오. 초과 액체는 정기적으로 배수해야합니다. 완전히 마음 (그림 4) 배수하기 위해 흡수 패드에 마음을 놓는다.
- 물 대부분이 제거되면 심장 세포 외 기질 (C-ECM)의 무게를 기록합니다. 심장은 decellularization 과정에서 초기 체중의 약 20~25%을 잃게 할 것으로 예상 할 수 있습니다.
- 오른쪽과 왼쪽 심실뿐만 아니라, DNA quantificati에 대한 심실 중격을 관통 해부와 조직 학적 처리 위해서는 조직 전체 decellularization (그림 5) 확인합니다.
- lyophilization 전에 최소한 2 시간에 -80 ° C에서 C-ECM을 멈춰 봐.
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Representative Results
전체 돼지의 마음에 decellularization의 효과는 자연적으로 크기의 차이, 압력 및 선박 배열로 인해 다릅니다. 따라서 파생 된 세포 외 기질 공사장 공중 발판의 정확한 구성은 마음에서 마음으로 동일하지 않습니다. 설명 프로토콜의 완성은 세포 물질의 손실을 나타내는 흰색 또는 반투명 나타납니다 마음을 얻을 것입니다. 그러나, 널리 조직이 몇 양적 매개 변수 팔의 조합에 따라 "decellularized"로 간주 될 수 있다는 가능합니다. 성공적인 decellularization 프로토콜은 조직의 MG 당 두 번 좌초 DNA (그림 6)의 50 미만 NG와 함께 매트릭스를 생성합니다. 매트릭스의 주입시 호스트 면역 반응을 방지하기 위해, 나머지 DNA는 200m 미만의 기본 쌍 (그림 7)를 포함해야합니다. 이러한 연구 결과를 확인하려면 Hematoxylin과 Eosin 염색은 핵의 부재를 공개해야심실과 심실 간 중격 (그림 8)의 대표 섹션에 얼룩. Masson의 Trichrome은 또한 심장 근육의 번들과 콜라겐 네트워크의 유지 (그림 9)의 손실을 확인합니다.
그림 1. 튜브의 가시 끝은 기본 심장의 대동맥에 삽입됩니다. 튜브는 관상 동맥을 통해 재관류을 보장하기 위해 호스 클램프 또는 대동맥 밸브 위의 우편 유대 관계를 확보해야합니다.
그림 2. 마음 4L 비커와 기포에 물에 잠겨있다가 튜브에서 제거해야합니다. 거품이 튜브 근처의 대동맥에서 새로운 관찰하는 경우 추가 연결 고리는 t에 튜브를 보호하는 데 사용되어야합니다 조직에 적절한 압력을 유지하기 위해 그는 대동맥.
솔루션은 관상 동맥을 통해 perfused 아르 그림 3., 심장은 심방에서 coronaries 주변의 마음과 언어의 꼭대기에 진행의 기본 색을 잃게됩니다.
그림 4. 소독과 프로토콜의 단계를 씻어 완료 후 튜브가 제거되고 마음이 초과 물이 심장에서 배출 할 수 있도록 흡수 패드에 표시됩니다. 이 조직을 무게 때 정확한 측정을 보장하고 또한 조직이 sectioning 전에 휴식을 취할 수 있습니다.
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그림 5는. 왼쪽 심실 (LV), 우심실 (RV) 및 심실 중격은 모든 histologic 처리, 냉동과 lyophilization, 그리고 DNA의 양을 정함에 대한 decellularized 마음에서 제거됩니다.
그림 6. 피코 녹색 분석을 사용하여 DNA 내용의 정량 분석. 원시 심실에 비해 cECM의 마음에서 심실은 DNA 내용에 상당한 감소를 보여줍니다. 이 프로토콜에서 발견 된 DNA 값은 decellularized의 조직을위한 50 NG / MG 표준에 또는 아래에 관찰됩니다.
그림 7. DNA 조각의 크기는 같은 ethidiu에 의해 결정방광 매트릭스 (UBM) 표준에 비해 m 브로마이드 젤은 decellularized 심실에 약간의 잔류 DNA을 보여 주었다.
그림 8. Hematoxylin과 Eosin의 착색은 decellularization 프로토콜 완료 후 심실에서 핵 물질의 완전한 제거를 보여 주었다.
그림 9.의 Masson의 Trichrome 염색) 기본 및 B) decellularized의 심실.
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Discussion
현재 연구는 돼지의 마음의 일관되고 효율적인 decellularization에 대한 방법론을 설명했다. 프로토콜은 이전에 다음 ID로 출판 보고서 1 변형 등의 반복적 인 결과를 제공 흐름에 더 이상 노출 증가 압력을, 포함되어 있습니다. 그 결과 decellularized 조직은 조직이 성공적으로 decellularization에 게시 된 기준을 모두 만났다. 자주 솔루션으로 변경되며, 변경된 사항은 조직에 세포 물질의 재 도입을 제한하기 위해 수행되었으며, 각 decellularization 에이전트에 노출 기간은 ECM에 부정적 영향을 줄이기 위해 최소화했다. 프로토콜의 시작 단계 동안, 재관류 율이 점차 조건 조직을로 증가하고 프로토콜의 이후 단계에서 높은 유량을 허용했다. 초기 단계에서 에어컨 조직을하지 않고 마음의 vasculature는 심장의 재관류가 불가능하고, 파열 할 수 있습니다. proto열은 그 효율성으로 인해 사용되었고, 어떤 주장이 다른 프로토콜을 통해 그 우수성 변경되지 않습니다. decellularization 에이전트 및 재관류의 속도의 정확한 구성은 이대로 더 나은 기계적 또는 생물학적 특성과 프로토콜을 얻을 수 있도록 다양한,하지만 마음 대리인의 제공을위한 일반 원칙이 적용됩니다 될 수 있습니다.
심장의 기본 입체 구조의 보존은 decellularization 프로토콜을 통해 수행 여러 절차에 기인했다. 첫째, 조직은 트리밍, 도착시 고정되었다. 냉동 세포 용해를 촉진하고 재관류주기위한 사전 에어컨 조직을 위해 중요합니다. 조직은 철저하게 대동맥 밸브에 뛰어난 상처 그대로 그대로 대동맥 2cm에 대해 검사되었습니다. 모든 심장 막 또는 심장 외막을 중단 한 경우, perfusate 마음의 하류 지역에 도달하지 않았기 때문에 장기가 폐기되고, 심장이 완전히 decellularized되지 않았습니다.다음으로, 조직은 완전히 사용하기 전에 유형 I 물에 해동되었다. 물은 심장 내에서 잔여 혈전의 제거를 해동 있으며 왔으며으로 조직 휴식을 취할 수있었습니다. 튜브가 삽입 된 것처럼 마지막으로,주의가 적절한 압력이 솔루션은 관상 동맥를 입력하는 유지되었다 있도록 튜브 주위에 물 - 방수 밀봉을 형성 있도록 대동맥 밸브가 그대로 남아 있도록 촬영했다.
각 decellularization 프로토콜이 완료 된 후, 품질 통제 조치의 일련의 세포 물질의 완전한 제거를 보장하기 위해 완료되었습니다. 프로토콜 세포 핵에 대한 histologic 얼룩을 제거한다는 사실이 확인 현재 연구는 어떤 DNA의 크기가 6 이하 200 BP 있다고 DNA의 50 미만 NG는 조직의 건조 무게의 MG 당 존재라고했다합니다. 심장 decellularization에 대한 이전에 다음 ID로 출판 방법은 DNA의 착색 및 정량화에 decellularization의 유사한 수준을 보여 주었다2,5,9,10. 전체 decellularization는 효소와 세제의 유사한 치료를 사용하여 이러한 연구를 수행했다. 그러나, 본 연구에서 각 화학 물질에 노출의 길이가 증가되었다가 더 많은 솔루션을 변경했고, 흐름 속도가 증가되었습니다. 현재 프로토콜은 또한 잠재적으로 세포 외 기질의 화학 잔류 물을보다 효율적으로 제거로 이어지는, 화학 린스의 길이를 증가했다.
심장 특정 세포로 decellularized 쥐의 마음 Recellularization는 체외 2,5에서 긍정적 인 결과를 굴복했다. 전체 장기 재관류의 decellularization은 조직의 recellularization의 중요 기본 vasculature의 유지 보수를 위해 허용됩니다. 고유 성장 요인, 매트릭스 단백질, 및 3 차원 섬유 아키텍처는 또한 적절한 세포 부착, 마이그레이션 및 reconstitute 수축성 심근 조직에 신호를 홍보했습니다. 돼지 심장 extracellu매트릭스는 골격의 크기와 적절한 세포 커뮤니케이션과 영양소 수송에 필요한 세포의 수에 의해 recellularize하는 것이 더 어려울 것입니다 고맙다. 그러나, 심장 매트릭스에서 잘라 패치는 생체 응용 프로그램에 유용 할 수 있습니다. 여러 연구 11-13 동물 모델에서 손상된 조직을 재건을위한 특정 사이트 매트릭스를 사용하는 잠재적 인 장점을 보여 주었다. 따라서 심장 조직에서 파생 된 세포 외 기질 발판은 심근 재건 응용 프로그램에 바람직하다. 심장 조직의 고유 한 아키텍처는 다른 장기 나 인공 biomaterial에서 파생 된 ECM 발판을 통해 이점을 제공 할 수 있습니다. 특정 사이트 비계는 숙주 세포 침투를 지원하고 반흔 조직 형성은 반대로 건설 리모델링 응답을 홍보 할 수 있습니다. 현재까지, 심장 ECM 패치는 심근 벽 14에서 생성 된 결함을 재구성하기 위해 생체에 조사되었습니다. 미래 스튜다이가 매트릭스에 놓는와 배양 심장 세포를 지원하는 발판의 능력을 조사하는 체외에서 수행됩니다. 여기에 설명 된 방법은 또한 인간의 마음의 decellularization에 적용 할 수 있습니다.
결론적으로, 돼지의 심장 decellularization가 가능하며 방법은 바로 - 앞쪽입니다. 이 자료의 지속적인 조사는 임상 사용의 가능성에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다.
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Disclosures
길버트 박사는 연구가 완료하는 동안 ACell 주식회사에서 과학 자문위원회에 있었는데, 최근 연구 및 개발의 부사장이되었다. ACell, Inc는 방광 매트릭스을 판매하고 본 연구에 상업적 관심이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 Brogan, 손님 미셸 위버, 그리고 순영이 Lippert을 인정하고 싶습니다. 본 연구를위한 기금은 NIH 그랜트 R03EB009237뿐만 아니라 국민의 생명 이미징 및 생물 공학 연구소와 T32HL076124-05에서 NIH 교육 교부금 T32EB001026-06에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
References
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