Summary
Un método para eliminar rápida y completamente los componentes celulares de un corazón porcino intacta a través de perfusión retrógrada se describe. Este método rinde un sitio específico cardíaco extracelular andamio matriz que tiene el potencial para su uso en diversas aplicaciones clínicas.
Abstract
Perfusión basada descelularización órgano completo recientemente ha ganado interés en el campo de la ingeniería de tejidos como un medio para crear un sitio determinado andamios de matriz extracelular, mientras que en gran medida se mantiene la arquitectura nativa del andamio. Hasta la fecha, este enfoque se ha utilizado en una variedad de sistemas de órganos, incluyendo el corazón, pulmón, hígado y 1-5. Los métodos anteriores para descelularización tejidos sin una red vascular fácilmente accesible se han basado en la exposición prolongada del tejido a soluciones de detergentes, ácidos, o tratamientos enzimáticos como un medio para eliminar los componentes celulares y nucleares del medio ambiente circundante extracelular 6-8. Sin embargo, la eficacia de estos métodos con bisagras en la capacidad de las soluciones para impregnar el tejido por medio de difusión. En contraste, la perfusión de órganos a través del sistema vascular natural, reduce eficazmente la distancia de difusión y transporte facilitado de decellularizatien agentes en el tejido y los componentes celulares de los tejidos. En este documento, se describe un método para decellularize completamente un corazón porcino intacta a través de perfusión retrógrada coronaria. El protocolo produjo un completamente descelularizado cardíaco matriz extracelular (ECM-c) andamio con la estructura tridimensional del corazón intacto. Nuestro método utiliza una serie de enzimas, detergentes y ácidos junto con enjuagues hipertónicas e hipotónicas para ayudar en la lisis y la eliminación de las células. El protocolo utilizado una solución de tripsina para separar las células de la matriz seguido por soluciones de Triton X-100 desoxicolato de sodio y para ayudar en la eliminación de material celular. El protocolo descrito también utiliza una velocidad de perfusión de más de 2 L / min durante largos períodos de tiempo. La alta velocidad de flujo, junto con los cambios solución permitió el transporte de agentes para el tejido sin contaminación de restos celulares y se aseguró eficaz enjuague del tejido. El método descrito eliminado todo el material nuclear de natiVE tejido cardíaco porcino, la creación de un sitio específico cardíaco ECM andamio que se puede utilizar para una variedad de aplicaciones.
Protocol
1. Preparación de tejidos y Experimento de instalación
- Harvest órgano porcino inmediatamente después de la eutanasia desde una instalación de matadero o de investigación y enjuagar el exceso de sangre. Recorte el corazón del exceso de grasa y tejido, manteniendo las aurículas y la aorta intacta. Recorte la grasa para separar la arteria pulmonar de la aorta. Si hay algunos cortes en el tejido, desechar apropiadamente.
- Envolver cada corazón individualmente en papel de congelador y almacenar todo el tejido en un congelador -80 ° C durante al menos 24 horas para asegurar la congelación completa.
- Cuando esté listo para su uso (generalmente menos de 3 meses), descongelar un corazón intacto congelado de porcino tipo 1 en agua durante la noche sumergido en un vaso de precipitados de 4 L a 4 º C.
- Después de que el corazón está completamente descongelado, acariciar el corazón seco, pesar el corazón, y registrar el peso. El corazón de un cerdo peso de mercado debe pesar aproximadamente 375-450 g.
- Conecte talla 18 a la tubería Masterflex ¼ "fin de un reductor de púas. Inserte el reductor de púas ytubo dentro de la aorta. Coloque 2 abrazaderas de manguera o los lazos zip seguras alrededor de la aorta, justo debajo del tronco braquiocefálico. El reductor y el tubo debe permanecer por encima de la válvula aórtica, así que las arterias coronarias pueden ser perfundidos (Figura 1).
- Usar una jeringa de 30 o 60 ml para llenar el tubo con agua Tipo I. Insertar el tubo dentro del cartucho de una bomba de rodillos Masterflex en su punto medio aproximado. Sumergir la afluencia extremo de la tubería en el fondo de un vaso de precipitados de 4 L con 2,5 L de agua y asegurar la tubería.
- Colocar el corazón en el vaso de precipitados lleno de agua, y cebar la bomba para eliminar burbujas de aire. Si se observan burbujas procedente de la aorta, donde se inserta el tubo, la aorta puede ser necesario reposicionar o fijarse con cintas adicionales. Un sello hermético es importante para mantener la presión adecuada durante el proceso de descelularización (Figura 2).
- Coloque el vaso de precipitados que contiene 3 L 4 L de un 0,2% NaN% Trypsin/0.05 EDTA/0.05%3 solución en una placa de agitación y se calienta a 37 ° C en el proceso de preparación de la descelularización.
2. Tejido Enjuagues
- Ajustar la bomba a una velocidad de flujo de 400 ml / min, asegurándose de que el tamaño del tubo correcto está seleccionado. Enjuague el corazón con agua de tipo I durante 15-25 min. Como se arranca la bomba, el corazón debe hincharse y efusión de sangre de los ventrículos. Solución fresca debe ser sustituido cada 5-10 minutos, o cuando sea necesario sobre la base de la cantidad de sangre que sale del corazón. Si la sangre no está derramada desde el corazón, ajustar el tubo y las abrazaderas según sea necesario.
- Detener la bomba y transferir el corazón a un vaso de precipitados separado lleno de fosfato 2X salino tamponado (PBS). Después de que el tubo se sumerge en solución, arrancar la bomba y aumentar la velocidad de flujo de 700 ml / min. El corazón debe permanecer en disolución durante 15 minutos, cambiando la solución cada 5 min. Cada cambio de solución requiere que la bomba se detiene temporalmente mientras que el tejido y el tubo se mueveal vaso de precipitados de nuevo.
- Transferir el corazón de tipo I de agua durante 10 minutos y aumentar la velocidad de flujo de 750 ml / min.
3. Descelularización y solución de perfusión
- Transferir el corazón al vaso de precipitados que contiene 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 a 37 ° C. Aumentar la velocidad de la bomba a 1.200 ml / min y arrancar la bomba. Usar una barra de agitación colocado en el fondo del vaso de precipitados para hacer circular la solución en el vaso de precipitados. El corazón debe permanecer en el 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 disolución a 37 ° C durante un total de tres horas. Después de 1 h, aumentar la velocidad de la bomba a 1.500 ml / min. Después de una hora adicional, aumentar la velocidad de la bomba a 1.800 ml / min. El tejido se lentamente sometido a velocidades de perfusión mayores para acondicionar el tejido y evitar la rotura de los vasos. El corazón se hinchará y casi el doble de tamaño durante este paso del protocolo. El tejido pierde su color natural, progresando desde las aurículas hasta el ápice a lo largo de thProtocolo E (Figura 3).
- Después de cada perfusión solución, una de dos pasos de enjuague se realiza para eliminar los desechos celulares, residuos de productos químicos, y la lisis celular ayuda. Cada enjuague se compone de un 10 min enjuague en agua de tipo I seguido por un enjuague de 10 minutos con 2X solución de PBS a temperatura ambiente. Cada lavado consiste en la eliminación de la solución en el vaso de precipitados original, añadiendo soluciones de enjuague, y circulando el líquido de perfusión en el vaso de precipitados que contiene el corazón sumergido. Después de que el 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 solución, el agua perfundir a 1.900 ml / min y, a continuación perfundir 2X PBS a 1950 ml / min.
- Transferir el corazón a una solución de 3% de Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 a temperatura ambiente. Aumentar la velocidad de la bomba a 2.000 ml / min y la solución de perfusión durante una hora. Quitar la solución del vaso de precipitados y reemplazar con solución fresca, aumentar la velocidad de la bomba a 2100 ml / min, y la perfusión de la solución fresca durante una hora adicional y un medio, con lo que el tiempo total en3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 a 2,5 horas.
- Enjuague el tejido en agua de tipo I en 2150 ml / min y PBS 2X a 2180 ml / min durante 10 min cada uno.
- Transferir el corazón a una solución de desoxicolato sódico 4% a temperatura ambiente. Aumentar la velocidad de la bomba a 2.200 ml / min y la solución de perfusión durante 3 horas.
- Enjuague el tejido en el tipo I y el agua en 2X PBS a 2.200 ml / min durante 15 min cada uno, el cambio de las soluciones después de 5-10 minutos para cada solución. Los pasos descritos perfusión se puede dividir en varios días mediante la realización de la etapa de aclarado dos veces y almacenar el corazón con una cánula adherida durante la noche a 4 ° C y se sumerge en agua de tipo I.
- El día siguiente, realizar un enjuague con 5 min de tipo I de agua a 750 ml / min, seguido de un enjuague 5 min en PBS 1X a 1.500 ml / min. El protocolo a continuación, se puede continuar a la velocidad de flujo se describe en la solución apropiada.
4. Desinfección y procesamiento final
- Transferir el corazón a un 0,1% peracácido etic / 4% de solución de etanol y la solución de perfusión durante 1,5 horas a 2.200 ml / min.
- Los enjuagues finales para el tejido se realizan todas en 2.200 ml / min. Perfundir el tejido con PBS 1X durante 15 min, seguido por dos lavados de 5 min en el tipo I de agua. Esta serie de aclarados se repite una vez más con el fin de completar el procedimiento de perfusión de solución.
- Apague la bomba y retire el corazón de la solución para drenar el corazón. Cortar los lazos de la aorta, eliminar todos los tubos, y colocar el corazón en un vaso de precipitados vacío para drenar durante 1 hora. El exceso de líquido tendrá que ser drenada periódicamente. Coloque el corazón en una almohadilla absorbente para drenar totalmente el corazón (Figura 4).
- Después de la mayor parte del agua se elimina, se registra el peso de la matriz extracelular cardiaca (C-ECM). El corazón se puede esperar que pierden aproximadamente 20-25% de su peso inicial durante el proceso de descelularización.
- Diseccionar los ventrículos derecho e izquierdo, así como el tabique ventricular para el ADN quantificatiy en el procesamiento histológico con el fin de confirmar la descelularización completa del tejido (Figura 5).
- Congelar la C-ECM a -80 º C durante al menos 2 horas antes de la liofilización.
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Representative Results
El efecto de la descelularización sobre corazones porcinos enteros, naturalmente, varía debido a las diferencias de tamaño, las presiones y disposición de los vasos. Por lo tanto, la composición exacta de los medios de andamiaje de la matriz extracelular derivados no será el mismo de corazón a corazón. La realización del protocolo descrito producirá un corazón que aparece blanco o translúcido, lo que indica la pérdida de material celular. Sin embargo, está ampliamente aceptado que un tejido puede ser considerado "descelularizado", basada en la combinación de unos pocos parámetros cuantitativos más 8. Un protocolo de descelularización exitoso producirá una matriz con menos de 50 ng de ADN de doble cadena por mg de tejido (Figura 6). Con el fin de evitar una respuesta inmune del huésped tras la implantación de la matriz, el ADN que queda también debe contener menos de 200 pares de bases (Figura 7). Para confirmar estos hallazgos, la tinción de hematoxilina y eosina debe revelar la ausencia de materiales nuclearestinción en secciones representativas de los ventrículos y el tabique ventricular (Figura 8). Tricrómico de Masson confirma, además, la pérdida de paquetes musculares cardiacas y la retención de las redes de colágeno (Figura 9).
Figura 1. El extremo de púas de la tubería se inserta en la aorta del corazón nativo. El tubo debe ser fijada con abrazaderas o bandas de sujeción por encima de la válvula aórtica para asegurar la perfusión través de las arterias coronarias.
Figura 2. El corazón se sumerge en agua en un vaso de precipitados de 4 l y burbujas de aire debe ser retirado de la tubería. Si se observan burbujas que salen de la aorta cerca de la tubería, los lazos adicionales debe ser utilizado para fijar el tubo a t él aorta con el fin de mantener la presión adecuada en el tejido.
Figura 3. Como soluciones se perfunde a través de las arterias coronarias, el corazón pierde su color nativo, progresando desde las aurículas a la punta del corazón y localizado alrededor de las coronarias.
Figura 4. Después de la terminación de la desinfección y enjuague etapas del protocolo, el tubo se retira y el corazón se coloca sobre una almohadilla absorbente para permitir que el exceso de agua drene fuera del corazón. Esto garantiza una medición exacta de pesaje cuando el tejido y también permite que el tejido se relaje antes de seccionar.
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Figura 5. El ventrículo izquierdo (VI), el ventrículo derecho (VD) y el tabique ventricular se eliminó todo desde el corazón descelularizado para el procesamiento histológico de congelación y liofilización, y la cuantificación de ADN.
Figura 6. El análisis cuantitativo del contenido de ADN usando un ensayo de Verde Pico. Los ventrículos del corazón CECM muestran una disminución significativa en el contenido de ADN en comparación con ventrículos nativos. Los valores observados de ADN a partir de este protocolo se observan en o por debajo del 50 ng / mg de estándar para tejidos descelularizados.
Figura 7. Tamaño de fragmento de ADN, tal como se determina por ethidium bromuro de gel, mostró poco ADN residual en los ventrículos descelularizados cuando se compara con una matriz de vejiga urinaria (UBM) estándar.
Figura 8. Hematoxilina y eosina tinción mostró la eliminación completa de materiales nucleares de los ventrículos después de la finalización del protocolo de descelularización.
Figura 9. Tinción tricrómica de Masson de A) y B nativo) ventrículo descelularizado.
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Discussion
El actual estudio se describe la metodología para la descelularización coherente y eficaz de un corazón porcino. El protocolo era una modificación de un informe publicado anteriormente 1, e incluyó una exposición más larga al caudal y la presión aumentada, que proporcionan resultados más reproducibles. El tejido resultante descelularizado cumplido con todos los criterios publicados por descelularización éxito de tejido 2. Los cambios frecuentes de solución se realiza para limitar la reintroducción de material celular para el tejido, y la duración de la exposición a cada agente descelularización se minimiza para reducir los efectos adversos en el ECM. Durante las etapas iniciales del protocolo, la tasa de perfusión se incrementó gradualmente a la condición del tejido y permiten velocidades de flujo más altas durante las etapas posteriores del protocolo. Sin acondicionado el tejido en las primeras etapas, la vasculatura del corazón se puede romper, por lo que la perfusión del corazón imposible. El protocol se utilizó debido a su eficiencia, y no se hacen afirmaciones de su superioridad sobre otros protocolos. La composición precisa de agentes descelularización y las tasas de perfusión concebiblemente puede variarse para producir un protocolo con mejores características mecánicas o biológicas, pero los principios generales para la entrega de los agentes para el corazón son aplicables.
La preservación de la nativa estructura tridimensional del corazón se atribuyó a varios procedimientos realizados en todo el protocolo descelularización. En primer lugar, el tejido se recortó y se congelaron a la llegada. Congelación promovido la lisis celular y era importante para pre-acondicionamiento del tejido para los ciclos de perfusión. El tejido fue inspeccionada cuidadosamente para cortes y 2 cm de aorta intacta intacta superiores a la válvula aórtica. Si cualquier pericardio o epicardio fue cortado, el órgano se descartó debido a que el perfusado no alcanzó abajo regiones del corazón, y el corazón no se descelularizado completamente.A continuación, el tejido fue descongelado completamente en el tipo I de agua antes de su uso. El agua que se permite que el tejido se relaje como se descongelaron y ayudado también la eliminación de los coágulos de sangre residual dentro del corazón. Finalmente, cuando el tubo se inserta, se tuvo cuidado para asegurar que la válvula aórtica se mantuvo intacto, de manera que se formó un sello hermético alrededor de la tubería, de modo que una presión adecuada y que se mantuvo la solución entró en las arterias coronarias.
Después de cada protocolo descelularización se completó, una serie de medidas de control de calidad fueron completados para asegurar la completa eliminación de material celular. El presente estudio verificó que el protocolo de tinción histológica para eliminar los núcleos celulares, mostró que menos de 50 ng de ADN estaba presente por mg de peso seco del tejido, y que cualquier ADN era inferior a 200 pb de tamaño 6. Métodos previamente publicados para descelularización cardíaca mostró niveles similares de descelularización en la tinción de ADN y cuantificación2,5,9,10. Descelularización completa se logró en estos estudios mediante tratamientos similares de enzimas y detergentes. Sin embargo, en el presente estudio, la duración de la exposición a cada producto químico se incrementó, hubo más cambios de solución, y los caudales se incrementaron. El presente protocolo también aumentó la longitud de enjuagues químicos, conduciendo potencialmente a una eliminación más eficiente de los residuos químicos de la matriz extracelular.
Recelularización de corazones de ratas descelularizados con células cardíacas específicas ha producido resultados prometedores in vitro 2,5. Descelularización toda la perfusión de órganos permitido para el mantenimiento de la vasculatura nativa, que es crítica en recelularización del tejido. Los factores de crecimiento inherentes, proteínas de la matriz, y arquitectura tridimensional de fibra también se promueve la unión celular apropiada, la migración, y la señalización para reconstituir tejido contráctil del miocardio. Porcino cardíaco extracelularlar matriz será más difícil de recellularize debido al tamaño del andamio y el número de células necesarias para la comunicación celular apropiado y transporte de nutrientes. Sin embargo, los parches cortadas a partir de la matriz cardiaca puede ser útil para aplicaciones in vivo. Múltiples estudios han demostrado la ventaja potencial de usar una matriz específica de sitio para la reconstrucción del tejido dañado en modelos animales 11-13. Por lo tanto, una extracelular andamio matriz derivada de tejido cardíaco es deseable para aplicaciones de reconstrucción de miocardio. La arquitectura inherente del tejido cardiaco puede presentar ventajas sobre un andamio ECM derivado de otro órgano o un biomaterial artificial. Un sitio específico de andamio puede apoyar la infiltración de células huésped y promover una respuesta remodelación constructiva, en oposición a la formación de tejido cicatricial. Hasta la fecha, parches cardíacos ECM han sido investigados in vivo para reconstruir un defecto creado en la pared del miocardio 14. Futuros estudiantestroqueles se pueden realizar in vitro para examinar la capacidad de la andamio para apoyar las células cardíacas sembradas y cultivadas en la matriz. Los métodos descritos en este documento también pueden ser aplicables a la descelularización de los corazones humanos.
En conclusión, la descelularización de corazón porcino es posible y los métodos son claros. Investigación continuada de este material permitirá conocer su potencial para el uso clínico.
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Disclosures
Dr. Gilbert estaba en el Consejo Asesor Científico de ACELL, Inc., mientras que el estudio se está haciendo, y recientemente se convirtió en el vicepresidente de Investigación y Desarrollo. ACELL, Inc. vende matriz vejiga urinaria y no tiene interés comercial en el presente estudio.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer Brogan invitados, Weaver Michelle, y Lippert Kristen. El financiamiento para este estudio fue proporcionado por el NIH Grant R03EB009237, así como subvenciones del NIH Formación T32EB001026-06 del Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería y T32HL076124 05-.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
References
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