Summary
Une technique pour manipuler génétiquement les cellules épithéliales au sein de l'ensemble
Abstract
Morphogenèse de ramification se produit pendant le développement de nombreux organes, et la glande sous-maxillaire embryonnaire de souris (SMG) est un modèle classique pour l'étude de la morphogenèse de ramification. Dans la GSM développement, ce processus itératif implique des mesures de bourgeon épithélial et conduit la formation, en fin de compte à donner naissance à un réseau ramifié de complexe acini et des canaux, qui servent à produire et à modifier / transport de la salive, respectivement, dans la cavité buccale 1 - 3. La membrane basale épithéliale associée et les aspects du compartiment mésenchymateux, y compris les cellules mésenchymateuses, facteurs de croissance et la matrice extracellulaire, produites par ces cellules, sont essentiels pour le mécanisme de branchement, bien que la façon dont les événements cellulaires et moléculaires sont coordonnés reste mal comprise 4 . L'étude des mécanismes moléculaires de conduite avancées morphogenèse épithéliale notre compréhension des mécanismes du développement et donne un aperçu possible régénérerapproches de médecine Ative. Ces études ont été entravées par le manque de méthodes efficaces pour la manipulation génétique de l'épithélium salivaire. À l'heure actuelle, la transduction adénovirale représente la méthode la plus efficace pour cibler les cellules épithéliales des glandes adultes in vivo 5. Toutefois, dans des explants embryonnaires, mésenchyme dense et la membrane basale entourant les cellules épithéliales entrave l'accès virale dans les cellules épithéliales. Si le mésenchyme est supprimée, l'épithélium peuvent être transfectées en utilisant des adénovirus, et rudiments épithéliales peut reprendre la morphogenèse de ramification en présence de Matrigel ou la laminine-111 6,7. Mésenchyme croissance sans rudiment épithélial nécessite également un supplément additionnel de facteurs de croissance solubles et n'est pas totalement récapituler morphogenèse de ramification comme cela se produit dans les glandes intactes 8. Nous décrivons ici une technique qui facilite la transduction adénovirale des cellules épithéliales et de la culture de l'e transfectéespithelium avec mésenchyme associé. Après microdissection des PM embryonnaires, l'enlèvement du mésenchyme, et l'infection virale de l'épithélium avec un adénovirus GFP contenant, nous montrons que l'épithélium se recombine spontanément avec mésenchyme non infecté, récapitulant intacte la structure SMG glandulaire et morphogenèse de ramification. La population de cellules génétiquement modifiées épithéliale peut être facilement contrôlé en utilisant les méthodes classiques de microscopie par fluorescence, si étiquetées par fluorescence constructions adénovirales sont utilisés. Le procédé de recombinaison tissu décrit ici est actuellement la méthode la plus efficace et accessible pour la transfection de cellules épithéliales avec un vecteur de type sauvage ou mutant dans une construction complexe tissu 3D qui ne nécessite pas la production d'animaux transgéniques.
Protocol
Le protocole comporte quatre grandes étapes, comme le montre la figure 1. Toutes les étapes sont décrites en détail. Construction d'adénovirus et de purification virale doit être effectuée avant la collecte d'organes destiné à être utilisé dans la transduction génétique des ébauches découpées épithéliales. Toutes les précautions de sécurité standard BSL-2 doivent être suivies lorsque l'on travaille avec des adénovirus.
1. Embryonnaires de souris glande sous-maxillaire (SMG) Récolte et Microdissection
- Euthanasier timed-souris femelles enceintes (souche consanguine CD-1 ou ICR) utilisant le CO 2 narcose, suivie par dislocation cervicale et les chaînes de récolte des embryons de souris au jour embryonnaire 13 (E13, 3-5 bourgeons épithéliaux) les procédures suivantes, approuvées par le IACUC institutionnelle comité. La journée de découverte bouchon vaginal est désigné comme E0. Glandes salivaires peuvent également être récoltées et cultivées à l'étape E12 quand il ya un seul bourgeon principal et la tige avec des fentes débutantà lancer. SMG avant ce stade nécessitent des conditions de culture différentes de celles indiquées ici.
- Transfert chaînes embryon dans stériles boîtes de 10 cm de culture de tissus remplis avec 25 ml de DMEM / Ham 's Medium F12 (F12) manque le rouge de phénol (Life Technologies) et additionné de 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine (pen-strep, Life Technologies).
- L'aide d'un scalpel stérile (# 11 lames) et une pince (# 5, Outils Fine Science, 11252-20), retirer les embryons des sacs séparés dans une boîte de 10 cm contenant 25 ml de DMEM/F12 + stylo-streptococcique.
- Couper les têtes d'embryons avec une coupe en biais juste en dessous de la mâchoire inférieure.
- Isoler les mandibules inférieures des têtes sous un microscope à dissection stéréo avec une base de lumière transmise (Nikon SMZ645 ou équivalent) à l'aide d'un coupe-dessous de la mâchoire supérieure. Placez les tissus au-dessus d'une pièce supplémentaire de verre plutôt que directement sur le composant en verre de la base du microscope.
- Recueillir les mandibules inférieures dans 3 ml de DMEM/F12 + stylo-strep dans un stérile boîte de 35 mm de culture tissulaire.
- Déposer une tranche de la mandibule sur la platine du microscope disséquant sorte que la languette se trouve en bas de la tranche, mais est orienté vers la position 12:00 heures.
- Utilisation d'un côté de deux pinces croisées dans un mouvement de ciseaux, retirez et jetez le troisième 1/3 inférieur de la tranche mandibule.
- Mettez la tranche de 90 ° vers la droite (si droitier) et, à l'aide d'un ciseau coupe avec la pince, couper la partie supérieure de la tranche mandibule (sans couper la langue) à mi-chemin dans la tranche.
- Pelez l'excès de tissu et retirez-le de suite pour exposer les mitraillettes dessous. Il y aura une de chaque côté à proximité de la base de la langue.
- En utilisant une paire de pinces pour maintenir le tissu par la langue, utilisez la pince pour taquiner les autres SMG loin de la langue. Répétez l'opération pour l'autre glande.
- Recueillir les glandes salivaires microdisséqués dans 3 ml de DMEM/F12 + stylo-strep dans un nouveau tissu stérile 35 mmboîte de culture. Remarque: les glandes sous-maxillaires plus grands (3-5 bourgeons épithéliaux) le long de la glande sublinguale connecté petite (1 bouton) peuvent être cultivées intactes en accédant directement à l'étape 4 et l'exécution des étapes 4.1, 4.3, et 4.4, comme décrit précédemment 2,8.
2. SMG séparation Rudiment épithéliale
- Lieu 5 (ou plus) des glandes salivaires dans un fond de verre, 50 mm de diamètre micropuits plat (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) contenant 200 ul de solution saline équilibrée de Hank (HBSS dépourvu de Ca + +, Mg + +, Life Technologies) contenant 0,4% (v / v) dispase (Life Technologies, cat. no. 17105-041) et incuber pendant 15 min à 37 ° C.
- Après l'incubation, à l'aide d'une pipette stérile 200 pi, aspirer délicatement la solution dispase sans perturber les glandes. Immédiatement ajouter 200 ul de milieu contenant DMEM/F12 5% (p / v) de BSA (DMEM/F12-BSA, pré-stérilisé avec un filtre 0,22 pm) pour neutraliser la dispase. <li> Sous la loupe binoculaire, à l'aide d'une pince à pointes fines (# 5 Dumostar, Outils Fine Science, 11295-20), séparez doucement le mésenchyme desserré autour des bourgeons SMG épithéliales et les conduits, en prenant soin de laisser l'épithélium intact .
- Pré-humide et stérile pointe de la pipette 200 ul avec DMEM/F12-BSA médias et pipeter doucement sur les rudiments épithéliales dans un nouveau diamètre de 50 mm micropuits plat contenant 200 pi de DMEM/F12 + stylo-streptococcique. Utilisez une haute qualité 200 ul pointe de la pipette avec un bord lisse.
- Dans le plat qui contient les pièces mésenchyme, jeter tout tissu non-mésenchymateuse, y compris les glandes sublinguales et les bourgeons détachés des glandes sous-maxillaires.
3. L'infection adénovirale de Rudiments épithéliales
- Faire 200 ul de médias infection virale en diluant l'adénovirus d'intérêt en DMEM/F12 + stylo-streptococcique dans un microtube de sorte que le titre de la solution résultante est de 1x10 8 -10 9 PFU. Latitre optimal requis pour les différents virus peuvent varier. Il est important d'utiliser du chlorure de césium (CsCl)-purifiée préparations virales de l'efficacité d'absorption optimale.
- Retirez le support de la boite contenant les cinq rudiments épithéliales. Rapidement ajouter 200 ul des médias infection, en gardant les rudiments humide en tout temps. Prendre les précautions nécessaires lors de la manipulation du virus et l'élimination des embouts de pipettes contaminées. Désinfectez toutes les surfaces contaminées par des virus avec une solution javellisée à 10%.
- Déplacez les rudiments épithéliales loin les uns des autres avec des pinces pour les empêcher de coller ensemble et de leur permettre de se déposer au fond de la plaque. Incuber rudiments dans les médias viraux pendant 1 heure à température ambiante. Pendant l'incubation, séparer les rudiments, si elles se déplacent côte à côte. Balancement excessif ou mouvement permettra aux glandes à s'agglutiner.
- Après incubation, retirer délicatement les médias virale contenant et le jeter de façon appropriée, en prenant soin de ne pas perturber le rudiments. Ajouter 200 ul de DMEM/F12 + stylo-streptococcique. Répéter ce lavage au moins deux fois plus et remplacez-le par 200 pi de DMEM/F12 + stylo-strep médias. Ces lavages sont essentielles pour éliminer tout virus qui n'est pas très attaché à l'épithélium et à prévenir l'infection du mésenchyme.
- Incuber rudiments épithéliales avec 200 ml de DMEM/F12 contenant 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356 231) pendant 20 min. Nous constatons que cette incubation courte Matrigel minimise la régression des fentes existantes pendant la période de culture initiale, mais cette étape peut être supprimée si l'exposition à Matrigel n'est pas souhaitée.
4. Culture ex vivo de mitraillettes recombinés
- Placez chaque rudiment, un à la fois, en utilisant un pré-mouillage pointe de la pipette 200 ul, au sommet d'une encoche (petite coupure) 13 mm, 0,1 um Nuclepore membrane Track-Etch filtre (Whatman) flottant sur 200 pi de milieu de culture ( 5 / rudiments de filtre) dans une plaque de microtitration à fond de verre. Les milieux de cultureest la suivante: DMEM/F12 + stylo-strep contenant 50 ug / ml de transferrine et 150 l'acide ascorbique pg / ml, comme décrit précédemment 2,8. La transferrine est connue pour stimuler la survie et la morphogenèse de ramification des glandes salivaires et des explants d'organes autres 9. L'addition d'acide ascorbique a été montré pour stimuler la ramification SMG. 10 Il est connu pour agir comme cofacteur dans de nombreuses réactions d'hydroxylation de voies métaboliques (telles que l'hydroxylation de proline au cours de la formation de fibres de collagène 11) et stimule également la production de fibronectine et la laminine dans des explants d'autres organes 12.
- Retirez les médias comme beaucoup sur le dessus du filtre que possible après l'ajout de chaque rudiment épithélial. Trop de médias sur le dessus du filtre peut entraîner le filtre à couler, tandis que les moins médias rend le placement des rudiments et mésenchyme beaucoup plus facile. Les supports en excès peut être éliminé soit avec une pointe de pipette ou en utilisant une pince pour saisir le matériau entre les pointes.
- Placer les morceaux mésenchymateuses dérivées vientm trois à quatre glandes sur le dessus et / ou autour de chaque ébauche épithéliale. Retirez tous les supports supplémentaires qui entourent les glandes pour éviter tout mouvement du mésenchyme loin des rudiments. Mésenchyme provenant de plus de glandes n'est pas bénéfique, mais moins peut être préjudiciable à la croissance rudiment épithélial.
- Incuber SMGs recombinés dans un incubateur humidifié (95% d'air / 5% CO 2) à 37 ° C pendant 48 -72 heures, comme vous le souhaitez.
- Acquérir clair et / ou des images fluorescentes de glandes direct à 0 h (si désiré), 2 h après recombinaison et chaque h 24 par la suite sur un microscope optique inversé, debout, ou en stéréo équipé d'un appareil photo numérique en utilisant un objectif de grossissement 4x ou 5x à capturer toute la glande recombiné dans une seule trame de vue. Images de la glande salivaire montrer le meilleur contraste en utilisant soit le paramètre fond clair ou l'anneau de phase approprié placé à mi-chemin dans la voie de la lumière (ce qui n'est pas possible sur les microscopes entièrement automatisés). Contraste de phase standard n'estnécessaire t depuis la glande est épais et crée un contraste.
- À la fois des points désirés, SMGs recombinés peuvent être fixées pendant 20 minutes avec la solution de fixation en paraformaldéhyde 2% (PFA) dans du PBS 1X contenant 5% (p / v) de saccharose (pour mieux préserver la structure cellulaire interne en maintenant les cellules en un état isosmotique). Contrairement à 4% PFA, 2% PFA conservera une quantité importante du signal de la GFP, si le fixateur est complètement retiré après fixation. Glandes peuvent être stockées pendant 1 semaine dans du PBS 1X dans l'obscurité à 4 ° C jusqu'à ce que l'ensemble de montage immunocytochimie et microscopie confocale est effectuée, comme indiqué précédemment 3,6,13-15. Idéalement, immunocytochimie et d'imagerie doit être réalisée rapidement après la fixation d'obtenir des images de meilleure qualité. Glandes peuvent également être lysées dans un tampon RIPA pour SDS-PAGE suivie d'une analyse Western blot.
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Representative Results
Le flux des principales étapes expérimentales est présentée dans la figure 1. Un exemple d'une SMG intacte, un rudiment isolé épithéliale, et son mésenchyme correspondant sont présentés dans la figure 2. Images en fond clair de mitraillettes recombinés, qui continuent à subir morphogenèse de ramification lorsque cultivées ex vivo pendant les temps indiqués, sont présentés dans la figure 3. Glandes recombinés cultivées pendant 48 heures épithéliales exprimant la GFP sont illustrés à la figure 4. Images confocales de mitraillettes recombinés fixe et imagée après 72 h de culture suivie par immunocytochimie, sont présentés dans la figure 5. Le marqueur épithélial, la E-cadhérine, délimite la population exprimant la GFP de cellules épithéliales du mésenchyme environnant. La détection de la protéine de la membrane basale, perlecan, localisée à la périphérie de l'épithélium montre au moins la reconstitution partielle de la membrane basale dans les glandes recombinés. Figure 6. Parasympathique ganglions sous-maxillaires subissent la croissance des neurites et innervent les glandes dans les cultures de recombinaison tel que démontré antérieurement 19.
Figure 1. (A) Organigramme et (B) Schéma illustrant les principales étapes expérimentales.
Figure 2. Brightfield images de (A) une journée entière embryonnaire 13 (E13) des glandes salivaires montrant l'épithélium de la glande sublinguale (SL Epi) et l'épithélium de la glande sous-maxillaire (SMG Epi) entouré de mésenchyme (mes). (B) Isolé rudiment épithélial, et (C) Séparé mésenchyme. Barres d'échelle = 100 um.
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Figure 3. Brightfield images de rudiments épithéliales (définie par des lignes blanches pointillées) entourés par des pièces mésenchymateuses en culture ex vivo pendant les temps indiqués. Les cellules épithéliales subissent morphogenèse de ramification et la condensation mésenchymateuse est évident dès 24 h dans la culture. Barres d'échelle = 100 um
Figure 4. Brightfield (A), Lumière fluorescente (B) et superposées (C) des images de mitraillettes recombinés dans lequel seules les cellules épithéliales (décrites dans les lignes blanches pointillées) ont été infectées par l'adénovirus exprimant la GFP et cultivées ex vivo pendant 48 heures. Barres d'échelle = 100 um.
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Figure 5. Images confocales ou des images en fond clair (BF) de mitraillettes recombinés marqués avec (A) des noyaux (DAPI, bleu), adénovirus GFP (green), le marqueur épithélial. E-cadhérine (rouge), barres d'échelle = 250 um, ou, (B) des noyaux (DAPI, bleu), adénovirus GFP (green), le marqueur épithélial, la E-cadhérine (rouge), et le marqueur de la membrane basale, Perlecan ( cyan), barres d'échelle = 50 um. Pointillée blanche épithélium contour lignes. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 6. Ganglions sous-maxillaires subissent parasympathique la croissance des neurites et innervent les glandes dans les cultures de recombinaison, barres d'échelle = 250 um.
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Discussion
La technique ex vivo recombinaison épithélio-mésenchymateuse a d'abord été publié pour glandes salivaires sous-maxillaires en 1981 16. Dans ce protocole, on élargir la méthode d'origine, en utilisant une infection adénovirale de manipuler l'expression des gènes de cellules épithéliales dans le cadre d'une glande recombiné. Nous montrons que le pourcentage des cellules épithéliales infectées par l'adénovirus, alors que le pourcentage de cellules qui sont infectées dépend des propriétés du promoteur viral, titre viral, virale et la pureté. Nous avons constaté qu'il est nécessaire d'utiliser CsCl gradient purifiés des virus pour la transduction épithéliale efficace, dont la purification n'est pas décrite ici. Depuis, nous avons également été en mesure d'infecter les cellules mésenchymateuses avant la recombinaison (données non présentées), indépendante manipulation génétique de la population mésenchymateuse est également possible. Nous avons récemment utilisé cette méthode de recombinaison adénoviral transfection / tissu à identifier un rôlepour la protéine de polarité, PAR-1b, dans le contrôle de la mise en place de la membrane basale de l'épithélium dans le développement des glandes salivaires. Kinase-dead PAR-1b adénovirus de type sauvage et PAR-1b adénovirus ont été utilisés dans cette étude de 13 pour infecter les rudiments épithéliales et recombiné avec E13 mesenchymes. La possibilité d'utiliser des virus mutants d'interroger les fonctions des molécules spécifiques améliore grandement l'utilité de cette méthode.
Il ya actuellement un manque d'outils efficaces pour cibler des molécules spécifiques au sein de la population de cellules épithéliales dans les glandes salivaires intactes embryonnaires sans affecter le compartiment mésenchymateux. Bien que de nombreuses études ont utilisé des inhibiteurs pharmacologiques de manipuler la transduction du signal dans les cultures d'organes intacts, ces inhibiteurs affectent à la fois l'épithélium et le mésenchyme. D'évaluer directement les effets des inhibiteurs de l'épithélium, les rudiments épithéliales doivent être cultivées en l'absence de mésenchyme dans les deux Matrigel or laminine-111 6,7 gels. Les petits ARN inhibiteurs (siRNA) sont une méthode efficace pour réguler à la baisse l'expression du gène épithélial depuis siRNA sont préférentiellement absorbée par les cellules épithéliales en présence de la plupart des transporteurs de lipides 13,14,17,18. Cependant, aucune de ces méthodes pour interférer avec les niveaux de protéines ou de fonction permettent surexpression d'un gène de type sauvage ou mutant. Les tentatives de transfection traditionnelle (non virale) des cultures embryonnaires SMG entiers ont rencontré un succès limité en ce que seul un petit nombre de cellules épithéliales peuvent être ciblés (ML, données non publiées). En comparaison, la transduction adénovirale représente une méthode efficace pour transfecter spécifiquement les cellules épithéliales salivaires.
Les nerfs parasympathiques ont récemment été montré pour être critique pour la glande salivaire normale de branchement en maintenant une kératine 5-positif population de cellules progénitrices 19. Un avantage de cette méthode de recombinaison tissu sur le messageProcédé enchyme sans épithéliale culture ébauche est que le ganglion parasympathique peut être maintenue dans le système de culture de recombinaison. Attention, en assurant le suivi de la localisation approximative du ganglion parasympathique, qui est situé dans le mésenchyme adjacent au conduit principal 19 épithéliale, il est possible de faire en sorte que chaque ébauche finit par être associé à un ganglion. Toutefois, nous constatons que, en combinant les glandes 3-4 de dollars de mesenchymes avec chaque rudiment épithélial, chaque rudiment est associée à un ganglion suffisante pour innerver les bourgeons dans une certaine mesure (figure 6), mais pas toujours à la même chose que dans le non modifiée intacte glandes.
Il existe d'autres méthodes pour infecter l'épithélium dans le cadre de la glande intacte. Nous avons déjà indiqué que la micro-injection peut être utilisé pour introduire des adénovirus dans les cellules épithéliales des glandes intactes 20,21. Cependant, la micro-injection est difficile de control, peut physiquement endommager les glandes, et conduit généralement à une infection de seulement un sous-ensemble localisée de cellules 20. Virus adéno-associés (AAV) ont été montré pour être utile pour la transfection des populations cellulaires distinctes dans le cadre d'explants d'organes intacts SMG 22. Le scAAV2 sérotype a été montré pour être beaucoup plus efficace dans la transduction spécifique de l'épithélium des mitraillettes intactes par rapport aux autres vecteurs AAV recombinants 23. Depuis AAV ne sont pas largement disponibles dans le commerce, ni l'expertise pour préparer AAV existent dans la plupart des laboratoires, la transduction adénovirale et le protocole recombinaison tissu fourni ici est plus généralement accessibles à la plupart des laboratoires de l'utilisation de vecteurs AAV.
Bien que cette méthode de recombinaison récapitule les tissus épithélio-mésenchymateuse interactions dans une certaine mesure, il est également possible d'infecter l'épithélium avec l'adénovirus et la croissance de l'épithélium en dehors de son contexte d'origine.Comme mentionné précédemment, nous avons infecté intactes salivaires rudiments épithéliales par l'adénovirus, puis a grandi dans les cultures Matrigel avec des facteurs de croissance exogènes ajoutés 17,20,21. Salivaires explants d'organes glande peut aussi être cultivé sur des échafaudages de nanofibres, bien que ces échafaudages ne récapituler la fonction complète du mésenchyme dans leur forme actuelle 15. Bien qu'aucune de ces méthodes récapitule le mésenchyme natif, ces méthodes permettent à l'imitation des propriétés spécifiques du mésenchyme dans la culture ex vivo.
Chaque méthode ex vivo culture a ses propres avantages et inconvénients, mais est applicable pour aborder des questions scientifiques spécifiques. Alors que les glandes recombinés ne subissent pas autant morphogenèse de ramification comme le font intacts glande salivaire explants d'organes, des explants d'organes, en général, seulement récapituler in vivo morphogenèse de ramification pour quelques jours. Une solution à ce problème est bien sûr de créermangé des animaux transgéniques contenant l'expression du gène ciblé dans le compartiment épithélial. Comme il ya un manque de promoteurs connus qui sont activés en particulier dans le développement précoce épithélium SMG et de la technologie transgénique reste nettement plus cher que les méthodes décrites, les expériences de recombinaison des tissus décrits ici constituent un système modèle viable pour étudier à la fois des cellules épithéliales et mésenchymateuses de signalisation dans développement précoce des cellules des glandes salivaires dans leur contexte tissulaire.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Deirdre Nelson pour leurs précieux commentaires et pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été financé par des subventions du NIH DE019244, DE019197 et DE021841 à ML, F32DE02098001 au SSJ, et C06 RR015464 à l'Université d'Albany, SUNY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 Medium without phenol red | Life Technologies | 21041-025 | |
| Penicillin and Streptomycin | Life Technologies | 15070-163 | 10X stock |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | Freeze single use aliquots at -20C |
| BSA | Sigma | A2934-100G | Fraction V, low endotoxin |
| Adeno-X-GFP | BD Biosciences | 8138-1 | Should be high titer (1x1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay. |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v) |
| 1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | Prepared from 10X stock |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14175095 | no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red |
| Transferrin | Sigma | T8158 | 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma | A4403 | 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C |
| Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol. | |||
| 10 cm sterile plastic dishes | Corning | 430167 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo dissecting microscope with transmitted light base | Nikon | SMZ645 | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| 35 mm tissue culture dishes | Falcon | 353001 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm diameter microwell dishes | MatTek Corporation | P50-G-1.5-14F | |
| Nuclepore Track-Etch membrane filters | Whatman | 110405 | 13 mm diameter, 0.1 mm pore size |
| Widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss, USA | Axio Observer Z1 | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm | Fine Science Tools | 11252-20 | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm | Fine Science Tools | 11295-20 | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol. | |||
References
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