קישור סיכוני טריפה, מתח פיסיולוגי אוכלי עשב ופירוק מיקרוביאלית המלטת צמח

Summary

אנו מציגים שיטות להערכת סיכון טריפה איך יכול לשנות את האיכות הכימית של טרף אוכלי עשב על ידי גרימת שינויים תזונתיים כדי לעמוד בדרישות מוגבר של לחץ, ואיך הריקבון של פגרים מאוכלי עשב הלחוצים אלה מאט פירוק המלטת צמח לאחר מכן על ידי חיידקי קרקע.

Abstract

הכמות והאיכות של פסולת הנכנסת לאדמה קובעות את קצב הפירוק על ידי קהילות של חיידקים, כמו גם שיעורי מחזור של חנקן (N) ^ו1,2 הפחמן (C) התפייס. המלטת צמח מהווה את הרוב מתוך ³ שאריות, ולכן הנחה הוא שהריקבון מושפע רק באופן שולי על ידי תשומות יומסה מבעלי חיים כגון אוכלי עשב וטורפי ^4,5. עם זאת, טורפים עשויים להשפיע על פירוק מיקרוביאלי של המלטת צמח דרך שרשרת של אינטראקציות שבו סיכון טריפה משנה את הפיסיולוגיה של טרפם אוכלי העשב שבתפקוד חיידקי קרקע משנה את הפנייה כאשר פגרי אוכלי עשב הם מפורקים ^6. תגובת לחץ פיזיולוגית על ידי אוכלי עשב לסיכון של טריפה יכולה לשנות את C: רכב יסודות N של ביומסה אוכלי עשב ^7,8,9 בגלל לחץ מסיכון הטריפה מגדילה דרישות אנרגית basal אוכלי עשב שאוכלי עשב בכוחות מערכות תזונתיות מוגבליםזה להסיט את הצריכה שלהם ממשאבים N-עשירים כדי לתמוך בצמיחה ורבייה למשאבי פחמימות C עשירים לתמוך בחילוף חומרים מוגבר ^6. אוכלי עשב יש יכולת המוגבלת לאחסון חומרי מזון עודפים, ולכן הדגישו אוכלי עשב מפריש N הם מעלים את פחמימות ^C-7 צריכה. בסופו של טרף על ידי הדגיש סיכון טריפה להגדיל גופם C: N יחס ^7,10, מה שהופך אותם משאבים באיכות טובה פחות לברכת חיידקי האדמה צפויה בשל זמינות נמוכה יותר של רפיף N לייצור אנזים החיידקי ^6. לכן, פירוק של פגרים של אוכלי עשב לחוצים יש השפעה יחול על התפקוד של קהילות מיקרוביאלי שמפחית את היכולת של חיידקים לאחר המלטה לפרק מפעל ^6,10,11.

אנו מציגים את המתודולוגיה להערכת קשרים בין סיכון טריפה ופירוק פסולת על ידי חיידקי קרקע. אנו מתארים כיצד: לגרום ללחץ באוכלי עשב מסיכון טריפה; meaבטוח אלה תגובות דחק, ולמדוד את התוצאות בפירוק של חיידקים. אנו משתמשים בתובנות ממערכת אקולוגית הכוללת מודל גראסלאנד ציד עכביש הטורף (Pisuarina מירה), אוכלי עשב חגב דומיננטיים (Melanoplus femurrubrum), ומגוון רחב של צמחים ודשא forb ^9.

Protocol

1. חרגולים נבעתים תחת לחץ ומתח תנאים חינם

1. השתמש 0.5 ² מ 'עגול, mesocosms הסגור כדי למנוע הגירה או הגירה של בעלי חיים (איור 1). לבנות mesocosms באמצעות אורכים 2.4 מ 'של 1.5 מ' גבוה ¼ "גדר רשת אלומיניום כפיגומים. כיסוי הגידור עם הקרנת 2.5 מ 'אורך 1.75 מ' גבוהה אלומיניום מקופלת מעל חלון העליון והתחתון של הגידור ומחוברת בסיכות לאורך קיפול. הצטרפות הגידור מסתיים, ויצר מעגל סגור ואז מצרך החלון החופף הקרנה יחד כדי ליצור חותם. גדר mesocosm לתוך האדמה בשטח על ידי חפירת 10 סנטימטרי עומק 4 סנטימטר בתעלה רחבה סביב בסיס mesocosom, שוקעים לתוך mesocosm תעלה ואז להדק את האדמה של התעלה סביב חלק השקוע mesocosm. סיכות פיסה מעוגלת של הקרנת חלון לראש mesocosm.
2. mesocosms מערך בdesig משוכפל לזווג ניסיוניn בתחום. מיקומי עלילה יש לבחור כדי להתאים את זהות מיני צמחים וכיסוי יחסי צמח. כיור כלובים 10 סנטימטרים לתוך האדמה באתר העלילה.
3. באמצעות נטו לטאטא, לאסוף מוקדמות (2 ^nd) נימפות instar חגב ומלאה אותם לmesocosms בצפיפויות שדה טבעיות.
4. באמצעות נטו לטאטא, ללכוד פרטים מציד דומיננטי לשבת ולחכות, (לא רשת אריגה) מיני עכבישי טורפים. הדבק סגר את עכביש chelicerae (איברי פה המשמשים להכניע טרף) עם המלט מתייבש במהירות לתופעות סיכון decoupled מבחירת הישרדות בפועל העדפת חגבים בודדים עם יכולות טובות יותר להתחמק טריפת עכביש. מניות העכבישים בצפיפות שדה לmesocosm אחד מכל זוג. זה יהיה טיפול לחץ. Mesocosms ללא עכבישים יהיה הטיפול ללא מתח.
5. אפשר נימפות חגב לפתח ל( 4 ^{וה ה} 5) שלבי instar מאוחרים. לאסוף את כל האנשים מהכלובים וrandomly להקצות אנשים מכל כלוב לאחת משלוש הקבוצות הבאות: assay (1) אימות של מצב דחק פיסיולוגי; (2) אימות של שינוי בStoichiometry יסודות הגוף; (3) פירוק של חיידקים.

2. מדינה ממתינה לאישור חגב מתח

1. למדוד את קצב חילוף חומרים של חגב סטנדרטי (SMR), כמו שיעור הפליטה דו תחמוצת הפחמן ( ) בזרימה דרך מערכת respirometry עם קצב זרימת אוויר של 200 מ"ל / דקת incurrent. הסר אדי מים על ידי עובר אוויר זורם דרך חומר מייבש.
2. בעקבות מחסור באוכל של 16 שעות (מים צריכים להיות זמינים), שוקל חגבים בודדים (± 0.1 מ"ג), ולמקם אותם ב50 מ"ל שקוף (9.2 סנטימטרים x 2.0 סנטימטר L D) תאי respirometer ולאפשר להם להתאושש מטיפול לפחות 10 דקות לפני המדידה תחלנה.
3. תחת הסביבה TEM הממוצע הקבוע תנאי מזג אוויר (טמפרטורת ± 1% וריאצית שגיאה סטנדרטית) בתוך תא respirometer, לנתח אוויר respired באמצעות ₂ מנתח CO אינפרא אדום (למשל רזולוצית קיוביט דקת S151-1). מדוד את המצב יציב ממוצע מינימאלי למשך 10 דקות.
4. המנתח מספק CO ₂ שבר ריכוז (חלקים למיליון), עדיין יש לדווח SMR כשיעור, ולכן יש להפוך את ההקלטות כ = FR _i ( - ) / {1 - [1 - (1/RQ)]}, כאשרiles/ftp_upload/50061/50061eq3.jpg "fo: src =" / files/ftp_upload/50061/50061eq3highres.jpg "/> = ריכוז השבר incurrent של CO _2; = ריכוז excurrent שבר של CO _2; = שיעור FR זרימה (מיליליטר דקות ^-1); RQ = מנת נשימה, הניח שווה ל -0.85 בבעלי חי אוכלי עשב.

3. Shift אימות בStoichiometry Elemental גוף

1. להעריך פחם: חנקן (C: N) תוכן של מדגם של חגבים הנגבים מmesocosms השדה.
2. להפחית וריאציה ב-C: N עקב צריכת מזון האחרונה על ידי הסרת תוכן מעי חגב תחת מיקרוסקופ לנתח.
3. להקפיא לייבש בטן והגוף הריק במשך 48 שעות ולאחר מכן טוחן את הפגר ובטן הפרט לאבקה הומוגנית.
4. מדוד C: תוכן N של האבקה באמצעות CNH autoanalyzer.

4.פירוק מיקרוביאלי

1. מקום משוכפל זוגות של צווארוני PVC (קוטר 15.4 סנטימטר., הוכנס ~ 4 סנטימטרים לתוך האדמה) באתר השדה (האיור 3C). הסר את כל הצמחייה בתוכם באמצעות קיטוע בשטח האדמה. קולרים אלה משמשים לצעדי פירוק. בנוסף, יקים קבוצה של קולרי PVC ברחבי אתר השדה לפעול ^כ13 C פקדים טבעי שפע (ראה להלן), כדי שלא חגבים ולא דשא חול נוספו.
2. לקולר אחד בכל זוג מוסיף 2 פגרים שלמים, שנקרשו חגבים (להקליט יומסה הוסיפה) שגדלו עם סיכון טורף כפי שתואר לעיל באמצעות שדה כלובים. בכל זוג לצווארון האחר מוסיף 2 פגרים שלמים שנקרשו גודלו ללא סיכון טורף.
3. לכסות את קולרי PVC עם מסך כדי למנוע הסרת חגב על ידי אוכלי נבלות מהמגרשים ולתת את פגרי החגב מתפרקים במשך 40 ימים.
4. בעוד פגרים נרקבים, תווית דשא-Liבכושר עם ¹³ ג
   1. לבנות תא פרספקס ברור (60 סנטימטרים X 60 סנטימטרי X 1.5 מ ') עם כניסה ויציאת שסתום (איור 3 ב').
   2. להשקיע בה 60 סנטימטרים רבועים x 60 סנטימטרי מסגרת עץ עם אטם גומי מצופה בגריז סיליקון 5 סנטימטר באדמה (איור 3 ב ').
   3. חלק את התא על גבי מסגרת העץ, כדי שהתא הופך חתום על ידי הגומי (איור 3 ב ').
   4. מחברים את פתחי הכניסה הקאמרית לבלוני גז דחוסים המכילים% 99 אטום ¹³ CO _2. צמחים בתוך התא יופיעו עם ¹³ C, שבו ריכוזי CO ₂ נשמרים ברמות הסביבה (כי ריכוזי הפחמן מרומם מחיצות צמח משנה). רמות סביבה מתוחזקים על ידי פועם CO ₂ שכותרתו רק לפרקי זמן קצרים. כמו כן, טמפרטורות קאמריות מנוטרות ותאים יוסרו אם טמפרטורות להגיע 5 ° Cבוב הסביבה.
   5. שבוע לאחר תיוג, להשוות ¹³ C δ של דשא החול עם ערכי שפע טבעיים שנאספו ממדגם אקראי של מיני דשא זהים באמצעות Thermo DeltaPlus איזוטופ יחס מסת ספקטרומטר (Thermo, סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב).
5. אחרי 40 ימים, להוסיף 10 גרם אוויר יבש ¹³ דשא המלטת C מתויגת לכל צווארון שהיה בעבר תוקן עם פגרי חגב.
6. לפקח על קצב מינרליזציה של דשא ההמלטה באתר על פני 75 ימים במכסת כל צווארון ומעקב גם נשימת קרקע כוללת וההנשמה של ¹³ CO _2. המטרה זו מושגת באמצעות זרימה באמצעות טכניקת חדר שבו דגימות גז מכל צווארון מנוטרות, בזמן אמת, לכל 8 דקות חלל באמצעות טבעת ירדה ספקטרוסקופיה (CRDS; Picarro Inc, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב; דגם: G1101 I-). CRDS מאפשר לאדם בו זמנית לעקוב גם אחר מוחלט וδ ¹³ Cנשימת אדמה.
7. להעריך את התרומה של ¹³ דשא המלטת C המסומן לנשימת אדמה כוללת באמצעות משוואות איזוטופ ערבוב. כמות דשא ההמלטה נובעת CO ₂ מחושבת כדלקמן: (. Δ ¹³ C _נשימה - δ ¹³ C _{nat.abn) נגזר} C _{דשא ההמלטה} = C _הכולל × / (δ ¹³ C _{דשא אשפה} - δ ¹³ C _{נת . ABN),} כאשר C _הכולל הוא הסכום הכולל של C respired במהלך מדידה נתונה, δ _נשימה היא ¹³ C ¹³ C δ של respired-C לצווארונים מתוקנים עם המלטת דשא שכותרת, δ ¹³ C _nat.abn. הוא ¹³ C δ הממוצע של C respired בשלושת צווארוני השפע הטבעיים (כלומר אלה שלא תוקנו באשפה), וδ ¹³ C _{דשא המלטה} הוא ¹³ C δ של המלטת הדשא הוסיף לשיתוףllars.
8. לפקח גם טמפרטורת קרקע ולחות על פני הניסוי באמצעות בדיקות ידניות לתיקון להבדלים בנשימת אדמה, בשל הבדלים בטמפרטורה ובלחות.
9. למרות מיועד לשימוש שטח, מכשיר חלל טבעת כלפי מטה ספקטרוסקופיה (Picarro Inc, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב; דגם: G1101-i) הקריאה רגיש לתנועה. לכן, יש להקים תחנת מדידת בסיס מרכזית לכל החלקות המכילות קולרי PVC, ולחבר את המכשיר לצווארונים עם אורכים של צינורות PVC.

Representative Results

עלילת דוגמה לקצב חילוף חומרים הרגיל של חגב בתנאי לחץ ומתח בחינם מוצגת באיור 2. בשל הבדלי מסת גוף בין חגבים בודדים, והעובדה שקצב חילוף חומרים משתנה עם מסת גוף, חלקות צריכות להציג את קצב חילוף חומרים ביחס למסת גוף חגב. מגמות מקבילות לטיפולים השונים מצביעות על כך שקצב חילוף חומרים עולה כמכפלה מתמדת של קצב חילוף חומרים סטנדרטי (כלומר אין אינטראקצית מסת גוף x שיעור חילוף חומרים) לכל האדם הלחוץ.

תכולת יסודות N בסיכון ותנאי נאמנות חגב הגוף C ומוצגים בטבלת 1. ראוי לציין כי קיים הבדל קטן מאוד (4%) בגוף C: יחסי N בין טיפולים. עם זאת, ההבדלים הקטנים האלה יכולים לתרגם הבדלים גדולים בפירוק המלטת דשא שעל שפת הברכה של חיידקי הקרקע (איור 3). הוספת חול לדשא קולרי PVC המתוקנים בעבר עם חגבים לחוצים או ללא מתח מובילה לדרגות שונות של פירוק פסולת, כפי שמשתקפת בעקומות המתארות צבור ₂ לשחרר CO מהקרקע בשל נשימת חיידקים (איור 3). ניסויים צריכים להיות במעקב עד צברו עקומות מתחילות להרוות.

	לחץ	מתח חינם
פחמן (%)	48.44 ± 0.32	44.73 ± 0.46
חנקן (%)	12.11 ± 0.08	11.62 ± 0.12
פחמן: חנקן	4.00 ± 0.03	3.85 ± 0.04

טבלת 1. השוואה של ההרכב הכימי של מכונית של אוכלי עשב חגבcasses מתנאים שבם עמד בפני סכנת טריפה (מתח) ושבו סיכון טריפה נעדר (מתח בחינם). ערכי ממוצע ± סטיית התקן 1.

איור 1. איור של העיצוב של שדה mesocosms השתמש בניסוי והערכה כוללת של ההערכה הניסויית של תופעות סיכון בפירוק פסולת.

איור 2. עלילה של קצב חילוף חומרים של אוכלי עשב הסטנדרטי ביחס למסת גוף אוכלי עשב. הנתונים מתחלקים לשני סוגים, לפי טיפול ניסיוני: חגבים מmesocosms המכיל טורפים (טריפה) לעורר בלחץ, וmesocosms ללא טורפים (שליטה) ולכן אין מתח מושרה. נתונים הם מד Halwenaג'יי ומיץ 2010, לא פורסם.

איור 3. עקומות המתארות ₂ לשחרר CO מצטבר על שפת הברכה של החיידקים תוך נרקב תשומות חול דשא ניסיוניות בצווארוני PVC. ערכים זממו הם מתכוונים ± שגיאה סטנדרטית 1. הגרף מראה כי קרקעות דרוכות עם פגרי חגב לחוצים (טורף) מניב 19% נמוכים יותר (ANOVA F = _1,6 9.06, P <0.05) שיעורי פירוק פסולת צמחיים מהקרקעות דרוכות עם פגרי חגב ללא מתח (שליטה). ההבלעה מראה את מנגנון צווארון PVC בתחום. איור לשכפל מHawlena et al. ⁶ Cick כאן לצפייה בדמות גדולה.

Discussion

הרצף של שיטות שהוצגו כאן צריך לאפשר מדידה שיטתית של לחץ הדרך במינים המרכיבים את קורי מזון מעל הקרקע יכולות קהילות מיקרוביאלי קרקע ממשלה בדרכים המובילות לשינוי של הפירוק הבא של המלטת צמח. השיטות הן אידיאליות ללימוד מערכות אקולוגיות מורכבות מצרכני חרקים וצמחים עשבוניים, כי יכולים להיות מוגבלות קורי מזון שלמים מרחבית והכילו בתוך mesocosms.

שונות מרחבית עשויות להתקיים עקב שיפועים בלחות קרקע רקע, טמפרטורת קרקע, צמח תוכן תזונתי וכו 'תכנון המחקר מאפשרת לאדם mescosms מערך וצווארוני PVC לחסום לאורך גרדיאנטים סביבתיים במרחב ובכך להסביר את השונות סביבתיות כגון בעת ניתוח לאפקטים.

למרות מיועד לשימוש שטח, מכשיר חלל טבעת כלפי מטה ספקטרוסקופיה (Picarro Inc, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב; דגם: G1101-i) הקריאות הם sensitive לתנועה. לכן, יש להקים תחנת מדידת בסיס מרכזית לכל החלקות המכילות קולרי PVC, ולחבר את המכשיר לצווארונים עם אורכים של צינורות PVC.

פירוק פסולת קרקע באופן מסורתי נמדד על ידי סגירת כמויות ידועות של המלטה לתוך שקיות רשת פיברגלס, הפקדת הצ'קים על פני הקרקע בתחום ומדי פעם מחדש מדידה-השקיות לכמת שיעור היעלמות המלטה (פירוק). המגבלה של שיטה זו היא שאינה מסוגל לעקוב אחר גורלו של העניין המפורק או לקבוע את התרומה לCO ₂ מינרליזציה של תיקון האדמה (המלטה הוסיפה) מ ₂ מינרליזציה CO אדמת הרקע. שיטת המעקב באמצעות כותרת CO ₂ שהוצגה כאן עוזרת להקל על אילוץ זה לוגיסטי.

אקולוגית מערכת אקולוגית וbiogeochemistry פעלו תחת הפרדיגמה העבודה שבגלל צמח שלא נאכל-המלטה מהווה את הרוב של פסולת, תהליכי מערכת אקולוגית מתחתיה מושפעים רק באופן שולי על ידי תשומות יומסה מרמות גבוהות יותר trophic ברשתות מזון עילי, כגון אוכלי עשב עצמם ^6. עם זאת, יש ראיות הולכים ומצטבר כי מינים ברמות גבוהות יותר של מערכות אקולוגיות trophic יכולים להיות השפעה עמוקה על תהליכים מתחתיה ^1,4,5. השיטה שהוצגה כאן עומדת גם כדי לשפר את הכימות של התרומה של רמות trophic גבוהות יותר, ישירות באמצעות ביומסה מתצהיר פגר ^{(12 לדוגמה, 13)} או הפרשה וegestion (למשל ^{14, 15),} או באופן עקיף באמצעות שינוי בהרכב קהילת צמח ⁽⁹ למשל ) ברכיבה על אופניים תזונתיות מערכת אקולוגית. כימות כזה יכול לעזור לחשוף את המנגנונים שבאמצעותם חיות בקרת דינמיקת מערכת אקולוגית כחלק ממאמץ מרוכז כדי לשפר ולשנות את הפרדיגמה העבודה הנוכחית של שליטה ביוטיים על תפקוד מערכת אקולוגית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cavity ring down spectroscope	Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA	Model # G1101-i
CO2 respirometer	Qubit Systems, Kingston, ON, Canada	Model # S151
13C	Sigma-Aldrich	372382
Spectrophotometer	Thermo, San Jose CA, USA	Model: Delta V Plus Isotope Ratio Mass Spectrophotometer