Summary
私たちは、捕食リスクが高まりストレスの要求を満たすために食生活の変化を誘導することによって、草食動物の餌の化学的性質を変えることができるかを評価するための方法を提示し、どのようにこれらのストレス草食動物から死体の分解は土壌微生物によって後続の植物リターの分解が遅くなります。
Abstract
土壌に入るデトリタスの量と質は、微生物群集と同様に窒素（N）と炭素（C）隔離1,2のリサイクル料金で分解速度を決定します。植物リターはデトリタス3の大半を占めるので、それは分解がわずか4,5などの草食動物と肉食動物のような動物からのバイオマス入力によって影響されることが想定されます。しかし、肉食動物は捕食リスクはターンを変化させるの土壌微生物の機能に草食動物の死骸が6を分解していること、その草食動物を捕食の生理機能を変化させている相互作用の連鎖を介して植物リターの微生物分解に影響を及ぼす可能性がある。捕食の危険がある草食動物による生理ストレス反応は、Cを変更することができます：草食バイオマス7,8,9のN元素組成を捕食リスクからストレスが草食基底エネルギー需要が増大するため、その栄養を制限されたシステムを強制的に草食動物で高まり代謝6をサポートするために、Cの豊富な炭水化物のリソースへの成長と再生をサポートするために、N-豊富な資源から消費をシフトするの。彼らは炭水化物-C 7消費が増えるにつれ、草食動物が過剰な栄養分を蓄積する能力を制限してきたので、草食動物の排泄Nを強調した。結局、自分の体Cを増やす捕食リスクが強調捕食：N比7,10を 、それらの微生物酵素の生産6の不安定なNの低い可用性への可能性の高い原因は、土壌微生物のプール用の貧しい品質のリソースとなっています。したがって、ストレス草食動物の死体の分解が植物リター6,10,11を分解する微生物のに後続の能力を低下させる微生物群集の機能にプライミング効果を持っています。
我々は土壌微生物によって捕食リスクとリター分解の間の結合を評価するための方法論を提示する。捕食リスクから草食動物にストレスを誘導する; MEA：我々は、する方法を説明しますそれらのストレス応答を確認し、微生物分解に影響を測定します。我々は、狩猟クモ捕食者（Pisuarinaミラ ）、ドミナントバッタ草食動物（Melanoplus femurrubrum）、草や広葉草本植物9の様々なモデルを構成する草原生態系からの洞察を使用しています。
Protocol
1。ストレスとストレスのない条件下での飼育バッタ
- 移民や動物種の移民（ 図1）を防ぐために0.5メートルの円形2、クローズドmesocosmsを使用しています。足場として1.5メートル、高¼ "メッシュアルミフェンスの2.4メートルの長さを使用してmesocosmsを構築します。1.75メートル高いアルミニウム窓のスクリーニングはフェンシングの最上部と最下部に折り重ね、折り目に沿って一緒にホチキス2.5メートルの長さでフェンシングをカバー。フェンシングに参加黒丸を形成し、その後シールを作成するために一緒にスクリーニング重なったウィンドウ主食。mesocosomのベース約4センチ幅トレンチによる深10cmを掘ってフィールド内の土壌にメソコスムを設定し、メソコスムをに沈むこと終了トレンチその後はメソコスムのくぼんだ部分の周囲にトレンチのSODを固める。メソコスムのトップへウィンドウスクリーニングのステープルの円形部分。
- レプリケートされたペアの実験療のArray mesocosmsフィールドにあるn。プロット位置は、植物種のアイデンティティと植物相対カバーに一致するように選択されるべきである。プロットサイトで地面にケージ10センチ沈む。
- 捕虫網を用いて、（2 nd）が早期齢バッタの幼虫を集めて、自然界の密度でmesocosmsにそれらを仕入れとなります。
- 捕虫網を使って、（ないウェブ織り）シットアンドウェイト狩猟支配クモ捕食種の個体を捕獲。接着剤は、実際の生存選択は、クモの捕食を逃れるために、より良い能力を持つ個々のバッタを好むから切り離されたリスクの影響に速乾性のセメントでクモcheliceraの複数形（獲物を討伐するために使用される口器）をシャットダウンします。フィールド密度でクモ各ペアの1メソコスムの仕入れとなります。これは、ストレス処理となります。クモなしMesocosmsは、ストレスフリーの治療になります。
- バッタの幼虫（4 番目と5 番目 ）後期齢段階に開発することができます。ケージとRAからすべての個人を集めるndomly各ケージから以降3回のアッセイのグループのいずれかに個人を割り当てる：生理的ストレス状態の（1）の検証;体元素化学量論のシフト（2）の検証、（3）微生物分解。
2。検証バッタの応力状態
- 二酸化炭素排出量の割合としてバッタ標準代謝率（SMR）（測定
）水が流れ込むフロースルー呼吸計測システム200 ml / minの空気流量とインチ乾燥剤を流れる空気を通すことによって水蒸気を削除します。 - 16時間の絶食（水は使用可能でなければなりません）に続いて、個々のバッタを（±0.1 mg）の重量を量ると、透明50ミリリットル（9.2センチメートル長さx 2.0センチメートルD）にそれらを配置する呼吸室を、それらが少なくともに対する処理から回復できるよう測定前に10分開始。
- 一定の平均周囲温度下呼吸チャンバー内の温度（温度±1％の標準誤差変動）は、赤外線CO 2アナライザー（ 例えば量子ビットS151-1ppmの分解能）を用いて、呼吸空気を分析します。平均最小限の定常状態を測定 10分間。
- アナライザは、フラクショナルCO 2濃度（100万分の1）を提供し、まだSMRが率として報告されるべきであるので、一つとして録音を変換する必要があり = FR I（
- 
）/ {1 - [1 - （1/RQ）]}ここで、iles/ftp_upload/50061/50061eq3.jpg "のfo：SRC =" / files/ftp_upload/50061/50061eq3highres.jpg "/>のCO 2 =水が流れ込む分数濃度; = CO 2の突出形の分数濃度; FR =流量（ミリリットル分-1）; RQ =呼吸商は、草食動物では0.85に等しいと仮定した。
）水が流れ込むフロースルー呼吸計測システム200 ml / minの空気流量とインチ乾燥剤を流れる空気を通すことによって水蒸気を削除します。 
- 
）/ {1 - 3。ボディ元素化学量論で検証シフト
- 窒素（C：N）フィールドのmesocosmsから収集されたバッタのサンプルの内容カーボンを評価します。
- 解剖顕微鏡下でバッタの腸内容物を除去することにより、N近年の摂餌量へのC：のばらつきを低減。
- 48時間空腸と体を凍結乾燥してから均質の粉末に、個々の死骸や腸を挽く。
- CNHの自動分析装置を用いた粉体のN内容：Cを測定します。
4。微生物分解
- 場所は、現場（ 図3C）で（15.4センチ径、〜4センチメートル土壌に挿入）PVCの襟のペアを複製しました。土壌表面でのクリッピングを経由して、その中に全ての植生を削除します。これらのカラーは分解対策のために利用されています。さらに、13℃自然豊かコントロール（下記参照）として動作するように現場を横切ってPVCのカラーのセットを確立し、どちらにもバッタ草リットルが追加されます。
- フィールド·ケージを用いて上記のように捕食者のリスクと飼育バッタの2無傷、凍結乾燥した死骸（バイオマスが追加されたレコード）を追加し、それぞれのペアの一方の襟に。各ペア内の他の首輪に捕食リスクなしで飼育2無傷の凍結乾燥した死骸を追加します。
- プロットからのスカベンジャーでバッタ脱落を防止し、バッタの死骸が40日間分解できるように画面が付いているポリ塩化ビニールの襟をカバーしています。
- 死骸が分解されていますが、ラベル草里13 Cとtter
- 入口と出口弁（ 図3B）と明確なプレキシガラス室（60センチメートル×60センチメートル×1.5メートル）を構築。
- 地面にシリコングリース5センチメートル（ 図3B）でコーティングされたゴム製シールを持つx 60センチメートル木製フレーム正方形60センチメートルを沈める。
- チャンバーはラバー（ 図3B）によってシールになるように木枠の上にチャンバーをスライドさせます。
- チャンバー内の99原子％、13 CO 2を含む圧縮ガスボンベにチャンバーインレットに接続します。植物は（昇降濃度を変化させる植物の炭素のパーティショニングため）CO 2濃度は、周囲のレベルで維持されている13 Cで標識されています。周囲のレベルが短時間だけのために標識CO 2をパルスすることによって維持されています。気温が5℃に到達した場合にも、室内温度が監視され、チャンバーは削除されますボーブアンビエント。
- 一週間標識後、サーモDeltaPlus同位体比質量分析計（サーモ、サンノゼ、CA、USA）を用いて、同一の草種のランダムなサンプルから収集された自然豊かな値を持つ草リットルのδ13 Cを比較します。
- 40日後には、以前にバッタの死骸で修正されたそれぞれの首輪に空気乾燥させ13 C標識草リットルの10グラムを追加します。
- 各カラーをキャッピングし、合計土壌呼吸と13 CO 2の呼吸の両方を追跡することにより、75日を越え、in situで草リットルの無機化率を監視します。これは、8分間、リアルタイムでフロースルーチャンバー技法各襟からのガスサンプルが監視されている使用して達成される各使用キャビティリングダウン分光法（CRDS; Picarro社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国;モデル：G1101 -I）。 CRDSは、同時に合計とδ13 Cの両方を追跡するように、1つを可能に土壌呼吸の。
- 同位体混合方程式を用いて合計土壌呼吸への13 C標識草リットルの寄与を推定する。 CO 2を導出草ゴミの量は、次のように計算されます：C 草リットル派生 = C× 合計 （δ13 C 呼吸 - δ13 C nat.abn）/（δ13 C 草リットル - δ13 C NAT 。ABN）、Cの合計は、与えられた測定中における呼吸Cの合計量、δ13 Cの呼吸は、標識された草の落葉、δ13 C nat.abnと改正首輪用、呼吸-Cのδ13 Cです。平均δ3豊かな自然の首輪で、呼吸、Cの13 C（ すなわちごみと改正されなかったもの）、およびδ13 C 草リットル草ごみのδ13 Cは共同に追加されているllars。
- 温度や湿度の違いによる土壌呼吸の違いを補正するために、手持ちのプローブを用いて実験を横切って土壌温度と水分の両方を監視します。
- フィールドでの使用のために意図したものであるが、キャビティリングダウン分光法装置（Picarro社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国;モデル：G1101-I）の測定値が動きに敏感です。したがって、1はPVCの襟を含むプロットのすべての中央基地測定ステーションを建てると、PVCチューブの長さと襟に楽器を接続する必要があります。
Representative Results
ストレスとストレスのない条件下でのバッタの標準代謝率のプロット例を図2に示されている。ボディ·マス·個々のバッタの違い、代謝率は体重に応じて変化するという事実のため、プロットはバッタ体重との関係で代謝率を提示しなければならない。さまざまな治療法のための並列動向はその代謝率は、すべてのストレスを受けた個人のための標準代謝率の定数倍（ 即ち、身体の質量×代謝率の相互作用はありません）のように上昇することを示します。
バッタ本体Cとリスクとリスクフリーの条件でN元素の内容を表1に示す。治療間N比：それは本体Cが非常に小さい（4％）に差があることは注目に値する。それにもかかわらず、これらの小さな違いが土壌微生物のプールサイドで草リター分解の差が大きい（ 図3）に変換することができます。 記述の曲線に反映されているように以前にストレスやストレスのないバッタと改正のPVCカラーに草ゴミを追加すると、リターの分解の程度の違いにつながる微生物の呼吸（ 図3）による土壌からのCO 2放出を累計する。曲線が飽和し始めるまで、累計実験を監視する必要があります。
| ストレス | 無料ストレス | |
| カーボン（％） | 48.44±0.32 | 44.73±0.46 |
| 窒素（％） | 12.11±0.08 | 11.62±0.12 |
| 炭素：窒素 | 4.00±0.03 | 3.85±0.04 |
表1。バッタ草食動物車の化学物質含有量の比較彼らは捕食リスク（ストレス）および捕食リスクは、（ストレスフリー）欠席した直面している条件からcasses。値は平均値±1標準誤差である。
図1リター分解のリスクの影響の実験的評価の実験と全体的なスキームで使用されるフィールドmesocosmsのデザインのイラスト。
図2草食動物体重の関係で草食標準代謝率をプロットした。ストレスを誘導するために捕食（捕食）、したがって、捕食者（コントロール）と無誘導性ストレスなしmesocosmsを含むmesocosmsからバッタ：データは、実験的な治療に応じて2つのクラスに分けられます。データはD HalwenaからですそしてOJシュミッツ2010年、未公表。
図3：ポリ塩化ビニールの襟で実験草リター入力を分解する微生物の中にプールサイドでの累積CO 2放出を記述する曲線。プロットされた値は平均±1標準誤差。グラフは、土壌は19パーセントのストレスバッタの死骸（捕食者）結果ストレスフリーバッタの死骸（コントロール）で下塗りした土壌よりも低い（ANOVAはF 1,6 = 9.06、P <0.05）、植物リター分解率で下塗りしていることを示しています。挿入図は、フィールド内のPVCの襟装置を示している。 Hawlena らから再生された図6の 拡大図を見るときはここをCick 。
Discussion
ここで紹介する方法のシーケンスは、植物リターのその後の分解の変化につながる方法で地上の食物網を構成する種の応力ができますプライム土壌微生物群集の方法を体系的に測定できるようにする必要があります。無傷の食物網が空間外接とmesocosms内に収容することができるので、方法は節足動物の消費者や草本植物から成る生態系を研究するための理想的です。
空間的変動が背景土壌水分の勾配による存在していても、土壌の温度、植物栄養素含有量などが研究デザインは、効果を分析する際に、配列mescosmsとPVCの襟に1つがそのような環境変化の空間的な環境勾配に沿ってブロックすることにより、アカウントすることができます。
フィールドでの使用のために意図したものであるが、キャビティリングダウン分光法装置（Picarro社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国;モデル：G1101-i）の読みがSEである動きにnsitive。したがって、1はPVCの襟を含むプロットのすべての中央基地測定ステーションを建てると、PVCチューブの長さと襟に楽器を接続する必要があります。
土壌リター分解は、伝統的に、グラスファイバーメッシュの袋にごみの既知量を囲んでフィールド内の土壌表面にバッグを堆積させ、定期的にごみの消失率（分解）を定量化するために袋を再測定することによって測定されてきた。この方法の制限は、1つは分解物の運命をたどるか、バックグラウンドの土壌のCO 2石灰から土壌改良（追加リットル）の2石灰化をCOへの寄与を決定することができないということです。ここで紹介する標識されたCO 2を用いたトレーサー法は、この物流制約を緩和するのに役立ちます。
生態系生態学と生物地球化学、作業パラダイムの下で運営しているそのため、食べられていない植物リッターはデトリタスの大半を占める、地下生態系のプロセスはわずかにそのような草食動物は自分自身6などの地上の食物網における高い栄養レベル、バイオマスからの入力の影響を受けています。しかし、生態系の高い栄養レベルの種は地下1,4,5プロセスに大きな影響を持つことができることを成長の証拠がある。ここで紹介する方法は、直接枝肉蒸着（ 例えば 12、13）や排泄や排せつ物からバイオマス（ 例えば 14、15）を介して、または間接的に植物群落組成物（ 例えば、9の改変を通じ、より高い栄養レベルの寄与の定量化を強化するために立っている）生態系の栄養循環に。このような定量化は、動物が生態系の機能上の生物的防除の現在の作業パラダイムを強化し、修正する努力の一環として、生態系のダイナミクスを制御するメカニズムを明らかにするのに役立ちます。
Disclosures
我々は、開示することは何もない。
Acknowledgments
この研究は、イェール大学の気候·エネルギー研究所と米国国立科学財団からの資金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cavity ring down spectroscope | Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA | Model # G1101-i | |
| CO2 respirometer | Qubit Systems, Kingston, ON, Canada | Model # S151 | |
| 13C | Sigma-Aldrich | 372382 | |
| Spectrophotometer | Thermo, San Jose CA, USA | Model: Delta V Plus Isotope Ratio Mass Spectrophotometer |
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