Summary
Wij presenteren een
Abstract
Deze methode is gebaseerd op de intraveneuze injectie van Evans Blue in muizen als proefdier model. Evans blauw is een kleurstof die bindt albumine. Onder fysiologische omstandigheden het endotheel is ondoordringbaar voor albumine, zodat Evans blauw gebonden aan albumine blijft beperkt binnen de bloedvaten. Onder pathologische omstandigheden die verhoogde vasculaire permeabiliteit endotheelcellen via gedeeltelijk verliezen hun nauwe contacten en het endotheel permeabel voor kleine eiwitten zoals albumine. Deze voorwaarde maakt extravasatie van Evans Blue in weefsels. Een gezonde endotheel voorkomt uitstorting van de kleurstof in de naburige gevasculariseerde weefsels. Organen met een verhoogde permeabiliteit zal aanzienlijk toegenomen blauwe kleur ten opzichte van organen met intacte endotheel. Het niveau van vasculaire permeabiliteit kan worden vastgesteld door eenvoudige visualisatie of kwantitatieve meting van de kleurstof opgenomen per milligram weefsel van proefdieren versus controle / weefsel. Twee powerful aspecten van deze assay zijn eenvoud en kwantitatieve kenmerken. Evans Blue kleurstof kan worden geëxtraheerd uit weefsels door het incuberen van een bepaalde hoeveelheid weefsel in formamide. Evans Blue absorptiemaximum is bij 620 nm en absorptie minimum is 740 nm. Door een standaardcurve voor Evans Blue, kunnen optische densiteitsmetingen worden omgezet in milligram kleurstof per gevangen milligram weefsel. Statistische analyse worden gebruikt om significante verschillen in vasculaire permeabiliteit beoordelen.
Introduction
Vorming en instandhouding van selectieve permeabele barrières essentieel zijn voor het orgaanontwikkeling en prestaties 1,2. Endotheelcellen lijn het bloedvatlumen en vormen een semi-permeabele barrière die essentieel in het selectieve transport tussen bloed en de interstitiële ruimte van alle organen. Een adequate barrière wordt gehandhaafd door nauwe cel-cel verbindingen die streng worden gecontroleerd door groeifactoren, cytokines en andere stress gerelateerde moleculen 3. Verstoring van de endotheliale barrière kan resulteren in verhoogde permeabiliteit en vasculair lekken. Deze effecten worden gezien bij diverse ziektebeelden en het begrip van de onderstreping moleculaire signalering vereist multidisciplinaire methoden 4,5. In dit artikel beschrijven we een in vivo methode om vat permeabiliteit met behulp van een muis-model te meten.
De assay we beschrijven, ook bekend als Miles assay is een goed establchine methode vasculaire permeabiliteit in vivo te testen. De assay is gebaseerd op het feit dat, onder basale fysiologische omstandigheden albumine niet de endotheliale barrière. Evans Blue, een azokleurstof met hoge affiniteit voor albumine, geïnjecteerd in de bloedstroom van een proefdier, onder fysiologische omstandigheden wordt verwacht te worden beperkt binnen bloedvaten. Wanneer een vasculaire permeabiliteit stimulus wordt toegevoegd, lokaal of systemisch, bloedvaten gaan lekken eiwit en dus ook de Evans blauwe die is gebonden aan albumine. Dit resulteert in een snelle blauwe kleuring van weefsels die doorlatend schepen.
Succesvolle injectie van de kleurstof in de muis laterale staartader is essentieel voor de goede afloop van het experiment. Staartader injectie techniek vereist veel oefening en moeten voor worden beheerst het starten van het experiment.
Vaartuig permeabiliteit is sterk afhankelijk van de leeftijd en het gewicht van de eeniMAL, dus bij het vergelijken van verschillende muizenstammen is het noodzakelijk dat de muizen of andere proefpersonen hebben bijna identieke geboortedata en gewicht. Andere factoren die de doorlaatbaarheid van de endotheliale barrière beïnvloeden zijn omgevingsomstandigheden zoals temperatuur, vochtigheid, en zeer belangrijk, de behandeling stress van de muis. Vanwege het grote aantal factoren die de uitkomst van het experiment kunnen beïnvloeden is het altijd wenselijk dat de experiment wordt herhaald ten minste driemaal en statistische analyse uitgevoerd.
Deze test kan worden gebruikt of vaartuig permeabiliteit van muizen die genetisch gemodificeerd zijn, en muizen met verschillende genetische achtergronden vergelijken. Permeabiliteit kan worden beoordeeld in de aanwezigheid of afwezigheid van een stimulus, afhankelijk van de functie van het gen dat is gemoduleerd. Deze test kan ook worden gebruikt of om het effect van verschillende verbindingen op vaartuig permeabiliteit testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Intraveneuze injectie van Evans Blue in de muis laterale staartader
- Bereid een 0,5% steriele oplossing van Evans blauw in PBS. Indien nodig, filter-steriliseren de oplossing voor alle deeltjes die niet is opgelost te verwijderen.
- Verstuif 200 pi Evans Blue oplossing in een spuit. Vermijd alle luchtbellen die kunnen zijn ontsnapt in de spuit.
- Plaats muizen die 8-12 weken oud zijn in een terughoudendheid apparaat, zodat het dier niet vrij mobiel, maar zijn staart kan worden behandeld.
- Plaats de muis terughoudendheid apparaat op zijn kant, zodat de laterale staartader goed zichtbaar is en naar boven gericht zijn.
- Houd u vast aan de staart met de niet-dominante hand tussen duim en wijsvinger.
- Steek de naald (gauge kleine, 27-30) op een 10-15 graden, bevel up, vooraf in de laterale staartader in de richting van het hoofd. Houd de naald en spuit parallel aan de staart.
- Do niet van toepassing tegendruk om de juiste plaatsing te bevestigen, omdat dit zou kunnen de ader instorten.
- Injecteer langzaam 200 ui Evans Blue oplossing in de staartader van de muis.
- Neem het gemak waarmee de plunjer vooruitgang, aangezien dit het bewijs van juiste plaatsing van de naald in de ader.
- Plaats de muis in zijn kooi en observeren gedurende 30 minuten.
2. Orgel en extractie van Evans Blue van de organen
- Offer de muizen door middel van cervicale dislocatie. Voor Miles test doeleinden cervicale dislocatie wordt aanbevolen als het beperkt significante interferentie met vasculaire permeabiliteit. Offeren alle muizen op hetzelfde moment, zo snel mogelijk. Werken met cohorten van 6 muizen of minder, want kort na de dood van de bloedvaten meer doorlaatbaar.
- Plaats de muizen op hun rug en pin hun voeten op een wit bord.
- Open de buik-en borstholte te thor blootACIC en buikorganen.
- Representatieve foto's om verschillen in Evans Blue extravasatie te tonen. Alle muizen op hetzelfde gebied om dezelfde lichtomstandigheden hebben voor alle muizen.
- Verzamel organen van belang en leg ze in 1,5 ml buizen
- Weeg een lege buis en breng het saldo op nul.
- Breng het weefselmonster en wegen het. Herhaal dit voor alle weefselmonsters. Weefsel kan lucht gedroogd om het watergehalte variabiliteit tussen verschillende organen elimineren.
- . Voeg 500 ul formamide aan elk weefselmonster buis.
- Breng alle buizen tot 55 ° C waterbad of warmteblok. Incubeer gedurende 24-48 uur aan Evans Blue onttrekken weefsel.
3. Kwantificering van Evans Blue geëxtravaseerd in bindweefsel
- Centrifugeer de Formamide / Evans Blue mengsel resterende pellet weefselfragmenten.
- Meet absorptie bij 610nm. Gebruik 500 ul Formamide als blanco.
- Bereken ng Evans Blue extravasatie per mg weefsel.
- Teken alle gegevens in een grafiek.
- Uitvoeren van statistische analyse om significante verschillen vast te stellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We gebruikten een in vivo assay permeabiliteit naar vat lekken testen in muizen 8-12 weken oud. Deze test is nuttig in het relatieve vasculaire permeabiliteit tussen dieren van verschillende genetische achtergrond of in een stam van muizen blootgesteld aan behandelingen die het vaatstelsel beïnvloeden. Onze resultaten tonen aan dat een stam van genetisch gemodificeerde muizen hebben we in ons laboratorium een permeabel endotheel in vergelijking met wild-type muizen. Deze veranderingen zijn duidelijk op macroscopisch niveau in vele organen (figuur 1).
We waren in staat om het verschil in vat permeabiliteit door spectophotometricaly meten Evans Blue werd dat per gram weefsel opgenomen in verschillende organen kwantificeren. Zoals we gezien in figuur 2 verschillende organen tonen verschillende reactie op permeabiliteit inducerende signalen en daarmee tonen verschillende kleurstof accumulatie. Dit is ook een functie van het niveau van vascularisatie in verschillende weefsels.
Figuur 1. Evans Blue extravasatie in weefsels. Na 30 min Evans blue injectie muizen werden opgeofferd door cervicale dislocatie. Vertegenwoordiger foto's van organen van belang werden genomen.
Figuur 2. Kwantificering van Evans Blue extravasatie in verschillende weefsels. 50-100 mg weefsel werd geïncubeerd met 500 pi formamide tot extravasatie Evans Blue extraheren. Optische dichtheid werd gemeten bij 610 nm en de metingen omgezet in ng kleurstof extravasatie per mg weefsel. Het experiment werd driemaal herhaald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vasculaire permeabiliteit is een kritische marker voor bloedvat status. Verhoogde vasculaire permeabiliteit is aangetoond aanwezig zijn in verschillende systemische ziekten, zoals diabetes, hypertensie en auto-immuunziekten 6,7,8. Verhoogde vasculaire permeabiliteit is aangetoond worden gemedieerd door schuifspanning, groeifactoren zoals vasculaire endotheliale groeifactor en fibroblastgroeifactor, ontstekingsmediatoren zoals serotonine, histamine en bradykinine 9. Extravasatie van water en kleine moleculen wordt verondersteld op te treden via kleine openingen tussen endotheelcellen. De kracht van cel-cel verbindingen strikt geregeld door interactie tussen moleculen 10.
In fysiologische omstandigheden endothelium doorlaatbaar is voor water en ionen, en ondoordringbaar voor eiwitten. Dus in afwezigheid van inflammatoire stimuli wordt albumine beperkt tot de bloedstroom en niet verplaatsen naar de extracellulaire vloeistof. Door het injecteren van Evans Blue, een kleurstof die bindt albumine, kunnen we de mate van eiwitlekkage bewaking van de bloedstroom in het bindweefsel.
Een aangepaste versie van deze assay gebruikt fluorescent-gelabelde microsferen. Door het gebruik van verschillende grootte microsferen of verschillende moleculair gewicht fluorescent gelabelde dextran (4 tot 70 kDa) kan men beter oordeel te vormen van endotheliale schade. Echter, deze optie verwijdert het gemak van visualisatie en het vereist de vaststelling van de weefsels en fluorescentie microscopie beeldvorming, of metingen met behulp van een fluorescentie-plaat lezer.
In vitro studies van het vaartuig permeabiliteit zijn met succes gebruikt in de literatuur 11. Een essentieel ingrediënt van een in-vitro permeabiliteit studie is een intacte, samenvloeiende celmonolaag. Deze testen gebruiken een klassieke dubbele kamer waar endotheelcellen in een monolaag gekweekt op een permeabel membraan gelegen in de bovenste kamer. Een kleurstof wordt aangebracht op het bovenstekamer en endotheelcellen permeabiliteit wordt bepaald door meten van de hoeveelheid kleurstof die de onderste kamer bereikt. De resultaten bootsen in de meeste gevallen in vivo assay resultaten. Zij echter niet de geschikte fysiologische context en dientengevolge gecompliceerd door de complexiteit van de resultaten. De in vitro benadering elimineert ook de rol van pericyten, cellen die in levende weefsels, in nauw contact met endotheelcellen en zenden signalen voor endotheliale celproliferatie, vaatgroei en vertakking.
De Miles testresultaten idealiter vergezeld te gaan van moleculaire studies die verder de hypothese dat wordt getest te onderzoeken. Zoals vermeld in een geheel organisme, vasculaire permeabiliteit is afhankelijk van diverse factoren, en dat de resultaten van een in vivo assay permeabiliteit moeten worden geïnterpreteerd in het licht van de complexiteit van het systeem geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflict of concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health, R01CA142928.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 | |
References
- Beck, K. F., et al. Inducible NO synthase: role in cellular signaling. J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).
- Bertglia, S., Giusti, A. Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).
- Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs. J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).
- Weis, S. M. Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer. Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).
- Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation. Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).
- Scheppke,, et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability. J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).
- Dvorak, A. M. Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle. Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).
- Le Guelte, A., Gavard, J. Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability. Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).
