Summary
Wir präsentieren ein
Abstract
Dieses Verfahren basiert auf der intravenösen Injektion von Evans Blue in Mäusen als Versuchstiere Modell. Evans Blau ist ein Farbstoff, der Albumin bindet. Unter physiologischen Bedingungen das Endothel ist undurchlässig für Albumin, so Evans blue gebundene Albumin Überreste innerhalb von Blutgefäßen beschränkt. In pathologischen Bedingungen, die erhöhte Gefäßpermeabilität Endothelzellen fördern teilweise verlieren ihren engen Kontakt und das Endothel durchlässig wird, um kleine Proteine wie Albumin. Dieser Zustand ermöglicht Extravasation von Evans Blue in den Geweben. Eine gesunde Endothel verhindert Extravasation des Farbstoffs in den benachbarten vaskularisierten Geweben. Organe mit einer erhöhten Permeabilität deutlich erhöht Blaufärbung Vergleich zu Organen mit intaktem Endothel zeigen. Das Niveau der Gefäßpermeabilität kann durch einfache Visualisierung oder durch quantitative Messung der Farbstoff pro Milligramm Gewebe Kontrolle gegenüber Versuchstier / Gewebe eingebaut beurteilt werden. Zwei powerful Aspekte dieses Assays sind seine Einfachheit und quantitativen Merkmalen. Evans Blau-Farbstoff kann aus Geweben, die durch Inkubieren eines bestimmten Menge an Gewebe in Formamid extrahiert werden. Evans Blue Absorptionsmaximum liegt bei 620 nm und Absorption Minimum bei 740 nm auf. Durch die Verwendung einer Standardkurve für Evans Blue, können Messungen der optischen Dichte in Milligramm Farbstoff pro Milligramm Gewebe eingefangen umgewandelt werden. Statistische Analyse sollte verwendet werden, um signifikante Unterschiede in Gefäßpermeabilität zu beurteilen.
Introduction
Bildung und Erhaltung der selektiven permeablen Barrieren für die richtige Entwicklung der Organe und Leistung 1,2 unerlässlich. Endothelzellen Linie das Blutgefäßlumen und bilden eine semi-permeable Barriere, die wesentlich in den selektiven Transport zwischen Blut und dem interstitiellen Raum aller Organe ist. Eine ausreichende Permeabilitätsbarriere wird durch enge Zell-zu-Zell-Verbindungen, die ausschließlich durch Wachstumsfaktoren, Zytokine und andere stressbedingte Moleküle 3 gesteuert werden beibehalten. Störung der Endothelzelle Barriere kann in erhöhter Permeabilität und vaskuläre Leckage führen. Diese Effekte sind in verschiedenen Krankheitsstadien gesehen und das Verständnis der Unterstreichung molekularen Signalwegen erfordert multidisziplinäre Methoden 4,5. In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren zur In-vivo-Verwendung eines Gefäßpermeabilität Mausmodell messen.
Der Assay wir beschreiben, auch als Miles-Assay bezeichnet, ist ein gut establIshed Methode, um vaskuläre Permeabilität in vivo zu testen. Der Assay basiert auf der Tatsache, dass unter basalen physiologischen Bedingungen, Albumin passiert nicht die Endothelbarriere basiert. Evans Blue, ein Azofarbstoff mit hoher Affinität für Albumin, wird in den Blutstrom eines Versuchstiers injiziert werden, und unter physiologischen Bedingungen, so wird erwartet, dass sie innerhalb von Blutgefäßen beschränkt werden. Wenn ein Gefäßpermeabilität Reiz hinzugefügt wird, entweder lokal oder systemisch, beginnen die Blutgefäße zu Protein auslaufen und damit auch die Evans Blau, das an Albumin gebunden ist. Dies führt zu einem raschen bläuliche Färbung von Geweben durchlässigen Behälter haben.
Erfolgreiche Injektion des Farbstoffes in der Maus laterale Schwanzvene ist entscheidend für die gute Ergebnis des Experiments. Schwanzveneninjektion Technik erfordert umfangreiche Praxis und sollte vor dem Start des Experiments gemeistert werden.
Gefäßpermeabilität ist stark abhängig von dem Alter und dem Gewicht des eineimal, so beim Vergleich verschiedener Mausstämmen ist es unerlässlich, dass die Mäuse oder andere Probanden nahezu identisch Geburtsdaten und Gewicht haben. Andere Faktoren, die die Durchlässigkeit der Endothelbarriere beeinflussen Umgebungsbedingungen wie Temperatur, Feuchtigkeit, was sehr wichtig, die Handhabung Stress der Maus. Aufgrund der Vielzahl von Faktoren, die das Ergebnis des Experiments beeinflussen kann es immer ratsam, dass das Experiment wiederholt wird mindestens dreimal und statistische Analysen durchgeführt.
Dieser Assay kann oder verwendet werden, um Gefäßpermeabilität von Mäusen, die gentechnisch verändert wurden, sowie Mäuse mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen vergleichen. Permeabilität kann in Gegenwart oder Abwesenheit eines Reizes bewertet werden, in Abhängigkeit von der Funktion des Gens, das moduliert ist. Dieser Assay kann auch verwendet werden, oder um die Wirkung von unterschiedlichen Verbindungen auf Gefäßpermeabilität testen.
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Protocol
Ein. Intravenöse Injektion von Evans Blue in der Maus laterale Schwanzvene
- Bereiten Sie eine 0,5% sterile Lösung von Evans-Blau in PBS. Falls notwendig, Filter-sterilisiert die Lösung, um Partikel, die nicht aufgelöst hat, zu entfernen.
- Absaugen 200 ul Evans Blue-Lösung in einer Spritze. Vermeiden Sie alle Luftblasen, die in die Spritze entgangen sein könnte.
- Ort Mäusen, 8-12 Wochen alt sind in eine Rückhaltevorrichtung so dass das Tier nicht frei beweglich, sondern mit dem Schwanz gehandhabt werden kann.
- Die Maus Rückhaltevorrichtung auf die Seite, so dass die laterale Schwanzvene gut sichtbar und sind nach oben gerichtet.
- Halten auf das Endstück mit der nicht dominanten Hand zwischen dem Daumen und dem Zeigefinger.
- Sie mit der Nadel (kleine Spurweite, 27-30) bei einer 10 bis 15 Grad Winkel, Abschrägung, voraus in die laterale Schwanzvene in die Richtung des Kopfes. Halten Sie die Nadel und Spritze parallel zum Schwanz.
- Do nicht anwendbar Gegendruck auf die richtige Platzierung zu bestätigen, da dies die Vene zusammenbrechen könnte.
- Langsam spritzen 200 ul Evans-Blau-Lösung in die Schwanzvene der Maus.
- Beachten Sie die Leichtigkeit, mit der der Kolben Fortschritte, denn dies ist der Beweis für die korrekte Platzierung der Nadel in der Vene.
- Legen Sie die Maus wieder in seinen Käfig und beobachten Sie es für 30 min.
2. Orgel Sammlung und Extraktion von Evans Blue von den Organen
- Opfert die Mäuse durch Genickbruch. For Miles Assayzwecke Genickbruch wird empfohlen, da es wesentliche Beeinflussung begrenzt mit vaskulären Permeabilität. Opfern alle Mäuse gleichzeitig, so schnell wie möglich. Arbeiten Sie mit Kohorten von 6 Mäusen oder weniger, denn kurz nach dem Tod Blutgefäße durchlässiger geworden.
- Platzieren Sie die Maus auf den Rücken und setzen ihre Füße auf einer weißen Tafel.
- Öffnen Sie die Bauch-und Brusthöhle zu thor aussetzenACIC und Bauchorgane.
- Nehmen repräsentative Bilder von Unterschieden in Evans Blue Extravasation zeigen. Fügen Sie alle Mäuse in dem selben Gebiet, um identische Lichtverhältnisse für alle Mäuse haben.
- Sammle Organe von Interesse und steckte sie in 1,5 ml Röhrchen
- Wiegen Leerhülse und bringen den Saldowert Null.
- Übertragen der Gewebeprobe und gewichtet sie. Wiederholen Sie dies für alle Gewebeproben. Gewebe können luftgetrocknet werden, um den Wassergehalt Variabilität zwischen verschiedenen Organen zu eliminieren.
- . Fügen Sie 500 ul Formamid zu jeder Gewebeprobe Röhre.
- Übertragen Sie alle Rohre mit einem 55 ° C Wasserbad oder Heizblock. Inkubieren 24-48 h bis Evans Blue aus dem Gewebe zu extrahieren.
3. Quantifizierung von Evans Blue extravasierten in interstitiellen Gewebe
- Zentrifugieren Formamid / Evans Blue Mischung Pellet alle verbleibenden Gewebefragmente.
- Absorption bei 610nm aufweist. Verwenden Sie 500 ul Formamid als leer.
- Calculate ng Evans Blue pro mg Gewebe ausgetretenes.
- Zeichnen Sie alle Daten in einer Grafik.
- Statistische Analysen durchzuführen, um signifikante Unterschiede festzustellen.
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Representative Results
Wir haben eine in vivo Durchlässigkeit Assay zum Schiff Leck in Mäusen 8-12 Wochen alt zu testen. Dieser Test ist nützlich beim Vergleich der relativen Gefäßpermeabilität zwischen Tieren unterschiedlicher genetischer Hintergrund oder in einem einzelnen Stamm von Mäusen unterworfen Behandlungen, die das Gefäßsystem beeinflussen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass ein Stamm von genetisch veränderten Mäusen wir in unserem Labor erstellt eine durchlässige Endothel im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen hat. Diese Veränderungen sind im makroskopischen Ebene in vielen Organen (Abbildung 1) ersichtlich.
Wir waren in der Lage, den Unterschied in der Gefäßpermeabilität durch Messen der spectophotometricaly Evans Blue, die pro Gramm Gewebe in verschiedenen Organen erfasst wurde quantifizieren. Wie wir in Abbildung beobachtet 2 verschiedenen Organen zeigen unterschiedliche Reaktion auf Durchlässigkeit Induktor Signale und damit zeigen verschiedene Farbstoff Akkumulation. Dies ist auch eine Funktion des Gehalts an Vaskularisierung in verschiedenen Geweben.
Abbildung 1. Evans Blue Extravasation in Geweben. 30 min nach Evans blue Injektion wurden die Mäuse durch Genickbruch getötet. Repräsentative Bilder von Organen von Interesse aufgenommen wurden.
Abbildung 2. Quantifizierung von Evans Blue Extravasation in verschiedenen Geweben. 50-100 mg Gewebe wurde mit 500 ul Formamid extravasiert Evans Blue extrahieren inkubiert. Die optische Dichte wurde bei 610 nm und die Messungen in ng Farbstoff pro mg Gewebe extravasiert umgewandelt gemessen. Das Experiment wurde dreimal wiederholt.
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Discussion
Gefäßpermeabilität ist ein kritischer Marker für Blutgefäß-Status. Erhöhte Gefäßpermeabilität hat sich gezeigt, dass in mehreren systemischen Erkrankungen, wie Diabetes, Hypertension, und Autoimmunerkrankungen 6,7,8 vorliegt. Erhöhte Gefäßpermeabilität ist gezeigt worden, durch Scherbeanspruchung vermittelt werden, Wachstumsfaktoren wie vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor und Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Entzündungsmediatoren wie Serotonin, Histamin und Bradykinin 9. Extravasation von Wasser und kleinen Molekülen wird angenommen, dass durch kleine Öffnungen zwischen Endothelzellen vorkommen. Die Stärke der Zell-zu-Zell-Verbindungen wird streng durch Interaktion zwischen den Molekülen 10 geregelt.
Unter physiologischen Bedingungen Endothel ist durchlässig für Wasser und Ionen, und undurchlässig für Proteine. Somit wird in der Abwesenheit von Entzündungsreize wird Albumin eingeschränkt auf den Blutfluss und nicht in die extrazelluläre Flüssigkeit zu bewegen. Durch Einspritzen von ELieferwagen Blue, ein Farbstoff, der Albumin bindet, kann man das Ausmaß der Leckage Proteins aus dem Blutstrom in das interstitielle Gewebe zu überwachen.
Eine modifizierte Version dieses Assays verwendet fluoreszenzmarkierten Mikrokügelchen. Durch die Verwendung unterschiedlicher Größe Mikrosphären oder unterschiedlichem Molekulargewicht fluoreszenzmarkierten Dextran (4-70 kDa) kann man besser beurteilen das Ausmaß der endothelialen Schäden. Allerdings entfällt diese Option die einfache Visualisierung und es erfordert Fixierung der Gewebe und Fluoreszenzmikroskopie Imaging, oder die Messung mit einem Fluoreszenz-Reader.
In vitro-Studien der Gefäßpermeabilität wurden erfolgreich in der Literatur 11 verwendet. Ein wesentlicher Bestandteil jeder Permeabilität in vitro Studie ist eine intakte, konfluent Zellmonoschicht. Diese Assays verwenden eine klassische Zweikammer denen Endothelzellen in einer Monoschicht auf einer durchlässigen Membran in der oberen Kammer angeordnet sind, kultiviert. Ein Farbstoff ist mit dem oberen angewendetKammer und endothelialen Zellpermeabilität wird durch Messen der Menge an Farbstoff, die die untere Kammer gelangt beurteilt. Die Ergebnisse imitieren in den meisten Fällen in vivo Assay-Ergebnisse. Allerdings fehlt ihnen die entsprechenden physiologischen Kontext und werden dabei von der Komplexität der Ergebnisse erschwert. Die in vitro-Ansatz beseitigt auch die Rolle von Perizyten, Zellen, die im lebenden Gewebe, in engem Kontakt mit Endothelzellen und senden Signale zur Endothelzellproliferation, Gefäßwachstum und Verzweiger.
Die Miles Testergebnisse sollten idealerweise durch molekulare Untersuchungen begleitet werden, dass eine weitere Prüfung der Hypothese, die getestet wird. Wie bereits erwähnt, in einem ganzen Organismus, ist Gefäßpermeabilität hängt von vielen Variablen, und somit die Ergebnisse eines in vivo Permeabilität Assay müssen in Anbetracht der Komplexität des Systems analysiert auszulegen.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Konflikt oder konkurrierende finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health, R01CA142928 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 | |
References
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