Summary
Stiamo presentando un
Abstract
Questo metodo si basa sulla iniezione endovenosa di Evans blu in topi come modello animale di prova. Blu di Evans è un colorante che si lega all'albumina. In condizioni fisiologiche l'endotelio è impermeabile all'albumina, in modo da Evans blu resti albumina legata restrizioni all'interno dei vasi sanguigni. In condizioni patologiche che promuovere un aumento della permeabilità delle cellule endoteliali vascolari parzialmente perdono i loro contatti stretti e l'endotelio diventa permeabile alle proteine di piccole dimensioni come l'albumina. Questa condizione consente per lo stravaso di Blu di Evans nei tessuti. Un endotelio sano impedisce stravaso del colorante nei tessuti circostanti vascolarizzati. Organi con aumento della permeabilità mostrerà significativamente aumentata colorazione blu rispetto a organi con endotelio intatto. Il livello di permeabilità vascolare può essere valutata mediante semplice visualizzazione o misurazione quantitativa del colorante incorporato per milligrammo di tessuto di controllo contro animale sperimentale / tessuto. Due PoweRFUL aspetti di questo test è la sua semplicità e le caratteristiche quantitative. Evans blu colorante può essere estratto dai tessuti incubando una quantità specifica di tessuto in formammide. Evans Blue è massima assorbanza a 620 nm e minimo assorbimento è a 740 nm. Utilizzando una curva standard per Evans blu, misure di densità ottica può essere convertito in colorante milligrammo catturato per milligrammo di tessuto. Analisi statistica dovrebbe essere utilizzato per valutare le differenze significative nella permeabilità vascolare.
Introduction
Formazione e il mantenimento di barriere permeabili selettive sono essenziali per lo sviluppo di organi corretto e 1,2 prestazioni. Cellule endoteliali linea lume del vaso sanguigno e formano una barriera semipermeabile che è essenziale per il trasporto selettivo tra sangue e lo spazio interstiziale di tutti gli organi. Una barriera di permeabilità adeguata è mantenuta attraverso stretti cellula-cellula giunzioni che sono strettamente controllate da fattori di crescita, citochine e molecole correlate allo stress altri 3. Deterioramento della barriera endoteliale può causare aumentata permeabilità vascolare e perdite. Questi effetti sono visti in diversi stati patologici e la comprensione della segnalazione sottolineatura molecolare richiede metodi multidisciplinari 4,5. In questo articolo, si descrive un metodo in vivo per misurare la permeabilità nave che utilizza un modello di topo.
Il saggio stiamo descrivendo, anche noto come saggio Miles, è una ben establmentata metodo per testare la permeabilità vascolare in vivo. Il saggio è basato sul fatto che, in condizioni fisiologiche basali, albumina non attraversa la barriera endoteliale. Evans blu, un colorante azoico con alta affinità per l'albumina, viene iniettato nel flusso sanguigno di un animale sperimentale, e in condizioni fisiologiche, esso dovrebbe essere limitato entro vasi sanguigni. Quando uno stimolo permeabilità vascolare è aggiunto, sia a livello topico o per via sistemica, i vasi sanguigni iniziano a perdere proteine e, quindi, anche il blu Evans che è legato all'albumina. Ciò provoca una colorazione bluastra rapida dei tessuti che hanno vasi permeabili.
Iniezione di successo del colorante nella vena laterale della coda del mouse è fondamentale per il buon esito dell'esperimento. Vena tecnica Tail iniezione richiede pratica estesa e deve essere masterizzato prima di iniziare l'esperimento.
Permeabilità vasale è fortemente dipendente dall'età e dal peso del l'IMAL, così quando si confrontano diversi ceppi di topi è imperativo che i topi o dei soggetti di prova diversi da avere vicino date di nascita e peso identici. Altri fattori che influenzano la permeabilità della barriera endoteliale sono condizioni ambientali come temperatura, umidità, e molto importante, lo stress manipolazione del mouse. A causa del gran numero di fattori che possono influenzare l'esito dell'esperimento è sempre consigliabile che l'esperimento viene ripetuto almeno tre volte e analisi statistica effettuata.
Questo test può essere utilizzato o per confrontare permeabilità vasale di topi che sono stati geneticamente modificati, nonché topi con differenti background genetico. Permeabilità può essere valutata in presenza o assenza di uno stimolo, a seconda della funzione del gene che è modulato. Questo dosaggio può anche essere utilizzato o per testare l'effetto di composti differenti permeabilità vasale.
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Protocol
1. Iniezione endovenosa di Evans Blue in the Vein laterale coda di topo
- Preparare una soluzione allo 0,5% sterile di blu di Evans in PBS. Se necessario, filtro sterilizzare la soluzione per rimuovere particelle che non è dissolto.
- Aspirare 200 ul Evans soluzione di blu in una siringa. Evitare tutte le bolle d'aria che possano esser sfuggite nella siringa.
- Luogo topi che sono 8-12 settimane di vita in un dispositivo di ritenuta in modo che l'animale non è liberamente mobile, ma la coda può essere gestito.
- Posizionare il dispositivo di ritenuta del mouse sul fianco con la vena caudale laterale è facilmente visibile e sono rivolti verso l'alto.
- Tenere su la coda con la mano non dominante tra il pollice e l'indice.
- Inserire l'ago (calibro piccolo, 27-30) in un anticipo 10-15 gradi, smussata, nella vena caudale laterale verso la direzione della testa. Tenere il parallelepipedo ago e la siringa alla coda.
- Do non si applica la contropressione per confermare il corretto posizionamento in quanto ciò potrebbe comprimere la vena.
- Iniettare lentamente 200 microlitri soluzione Evans blu nella vena della coda del topo.
- Osservare la facilità con cui gli anticipi stantuffo, poiché questa è la prova di corretto posizionamento dell'ago nella vena.
- Ponga il mouse di nuovo nella sua gabbia e osservare per 30 minuti.
2. Organo Raccolta ed estrazione di Evans Blue dagli organi
- Sacrifica i topi tramite dislocazione cervicale. Ai fini del test Miles dislocazione cervicale è raccomandato in quanto limita la grave interferenza con la permeabilità vascolare. Sacrificare tutti i topi al tempo stesso, il più velocemente possibile. Lavora con coorti di 6 topi o meno, perché poco dopo la morte i vasi sanguigni diventano più permeabili.
- Mettere i topi sulla schiena e il pin i piedi su un bordo bianco.
- Aprire la cavità addominale e toracica per esporre thororgani ACIC e addominale.
- Scatta foto rappresentative per mostrare le differenze di stravaso Evans Blue. Includere tutti i topi nello stesso campo in modo da avere condizioni di luce identiche per tutti i mouse.
- Raccogliere gli organi di interesse e metterli in provette da 1,5 ml
- Pesare un tubo vuoto e portare il valore di bilancio a zero.
- Trasferire il campione di tessuto e peso. Ripetere l'operazione per tutti i campioni di tessuto. Tessuti può essere essiccato per eliminare la variabilità contenuto di acqua tra diversi organi.
- . Aggiungere 500 microlitri formammide in ogni provetta campione di tessuto.
- Trasferire tutte le provette in un bagno d'acqua ° 55 C o di un blocco di calore. Incubare per 24-48 ore per estrarre i Blu di Evans dal tessuto.
3. Quantificazione di Evans Blue travasato nel tessuto interstiziale
- Centrifugare la formammide / Evans miscela blu per far sedimentare i frammenti di tessuto rimanenti.
- Misurare l'assorbanza a 610nm. Usare 500 microlitri Formammide come bianco.
- Calcola ng Evans Blue stravaso per mg di tessuto.
- Tracciare tutti i dati in un grafico.
- Eseguire l'analisi statistica per determinare differenze significative.
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Representative Results
Abbiamo utilizzato un saggio di permeabilità in vivo per verificare perdite nave in topi 8-12 settimane di vita. Questo test è utile per confrontare la relativa permeabilità vascolare tra animali di diverso background genetico o in un singolo ceppo di topi sottoposti a trattamenti che colpiscono il sistema vascolare. I nostri risultati mostrano che un ceppo di topi geneticamente modificati che abbiamo creato nel nostro laboratorio ha un endotelio più permeabile rispetto ai topi wild-type. Questi cambiamenti sono visibili a livello macroscopico in molti organi (Figura 1).
Siamo stati in grado di quantificare la differenza di permeabilità nave da parte spectophotometricaly misurando il Blu Evans che è stato catturato per grammo di tessuto in diversi organi. Come abbiamo osservato in Figura 2 diversi organi mostrare diversa risposta ai segnali induttore di permeabilità, mostrando così l'accumulo di colorante diverso. Questo è anche funzione dei livelli di vascolarizzazione in differenti tessuti.
Figura 1. Evans stravaso blu nei tessuti. Evans 30 min dopo iniezione i topi sono stati sacrificati blu attraverso dislocazione cervicale. Immagini rappresentative degli organi di interesse sono state prese.
Figura 2. Quantificazione di stravaso Evans blu in diversi tessuti. 50-100 mg di tessuto è stato incubato con 500 microlitri di estrarre formammide stravaso Evans blu. La densità ottica è stata misurata a 610 nm e le misurazioni convertiti in colorante ng stravaso per mg di tessuto. L'esperimento è stato ripetuto tre volte.
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Discussion
Permeabilità vascolare è un indicatore fondamentale per lo stato dei vasi sanguigni. Aumento della permeabilità vascolare ha dimostrato di essere presente in numerose malattie sistemiche, compreso il diabete, ipertensione e malattie autoimmuni 6,7,8. Aumento della permeabilità vascolare ha dimostrato di essere mediata da shear stress, fattori di crescita come il fattore di crescita vascolare endoteliale e fattore di crescita dei fibroblasti, mediatori infiammatori quali serotonina, istamina e bradichinina 9. Stravaso di acqua e piccole molecole si pensa che avvenga attraverso piccole aperture tra le cellule endoteliali. La forza di cellula-cellula giunzioni è strettamente regolato dalla interazione tra molecole 10.
In condizioni fisiologiche endotelio è permeabile all'acqua e ioni, e impermeabile alle proteine. Pertanto, in assenza di stimoli infiammatori, l'albumina è limitata al flusso sanguigno e non si sposta nel fluido extracellulare. Con l'apporto di Efurgoni blu, un colorante che si lega all'albumina, possiamo monitorare il grado di perdita di proteine dal flusso di sangue nel tessuto interstiziale.
Una versione modificata del saggio utilizza marcatore fluorescente microsfere. Utilizzando diverse dimensioni microsfere o diverso peso molecolare marcatore fluorescente destrano (4-70 KDa) si può meglio valutare l'entità del danno endoteliale. Tuttavia, questa opzione elimina la facilità di visualizzazione e richiede che fissa i tessuti e di imaging, microscopia a fluorescenza o di misura utilizzando un lettore di fluorescenza piatto.
In vitro studi di permeabilità vasale sono stati utilizzati con successo in letteratura 11. Un ingrediente essenziale di uno studio in vitro la permeabilità è un intatto, monostrato di cellule confluenti. Questi saggi usare una camera doppia classica dove vengono coltivate cellule endoteliali in un monostrato su una membrana permeabile situata nella camera superiore. Un colorante viene applicato alla tomaiacamera e permeabilità endoteliale viene valutata misurando la quantità di colorante che raggiunge la camera inferiore. I risultati imitano nella maggior parte dei casi, il risultati del test in vivo. Tuttavia, manca il contesto appropriato fisiologico e sono così complicata dalla complessità dei risultati. L'approccio in vitro elimina anche il ruolo di periciti, cellule che, in tessuti viventi, sono in stretto contatto con le cellule endoteliali e inviare segnali di proliferazione di cellule endoteliali, la crescita dei vasi e ramificazione.
Il test Miles risultati dovrebbero idealmente essere accompagnata da studi molecolari che un ulteriore esame l'ipotesi che si sta testando. Come detto, in un organismo, permeabilità vascolare dipende da molte variabili, e quindi i risultati di un test in vivo permeabilità devono essere interpretati alla luce della complessità del sistema analizzato.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto o in competizione interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health, R01CA142928.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 | |
References
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