Summary
我々は提示している
Abstract
このメソッドは、テストモデル動物としてマウスでのエバンスブルーの静脈注射に基づいています。エバンスブルーはアルブミンと結合する色素である。生理的条件下では内皮細胞は血管内に限定アルブミンので、エバンスブルーアルブミン結合した遺骨に対して不透過性である。増加した血管透過性内皮細胞を促進する病態では部分的にそれらの密接な接触を失い、内皮は、アルブミンのような小さなタンパク質に透過性になる。この条件は、組織中のエバンスブルーの漏出を可能にします。健康な内皮細胞は、隣接する血管化組織における色素の漏出を防ぐことができます。透過性の増大を持つ器官が無傷の内皮細胞と器官に比べて大幅に増加した青色呈色が表示されます。血管透過性のレベルは、単純な可視化によって、または実験動物/組織vsコントロールの組織のミリグラムあたり組み込ま色素を定量的に測定することによって評価することができる。二つポウこのアッセイのrful側面は、そのシンプルさと定量的な特性です。エバンスブルー色素をホルムアミドの組織の具体的な金額をインキュベートすることにより、組織から抽出することができます。 620 nmの吸光度の最小値である最大のエバンスブルーの吸光度は740 nmである。エバンスブルーの標準曲線を用いることで、光学濃度の測定は、組織のミリグラム当たりミリグラム捕捉色素に変換することができます。統計解析は、血管透過性の有意差を評価するために使用されるべきである。
Introduction
選択透過性障壁の形成と維持には、適切な臓器の開発と性能1,2のために不可欠です。内皮細胞ライン血管内腔と血液とすべての器官の間質空間との間の選択的輸送に不可欠である半透過性の障壁を形成する。十分な透過障壁は固く成長因子、サイトカインやその他のストレス関連分子3によって制御されているタイトな細胞から細胞への結合を介して維持されています。内皮細胞障壁の破壊は透過性の増大と血管漏出をもたらすことができます。これらの効果は、様々な疾患状態で見られると下線分子シグナルの理解が学際的方法は4,5が必要とされます。この記事では、我々はマウスモデルを用いて血管の透過性を測定するin vivo法について説明します。
またマイルスアッセイとして知られている我々が説明している検定は、よくestablですin vivoで血管透過性をテストするためのメソッドをished。アッセイは、基底の生理的条件下で、アルブミンは、内皮関門を通過しない、という事実に基づいている。エバンスブルー、アルブミンに対して高い親和性を有するアゾ色素は、実験動物の血流中に注入され、生理的条件下では、血管内に制限されることが期待されています。血管透過性の刺激が加えられると、どちら局所的または全身的に血管がアルブミンに結合しているエバンスブルーはまた、このようにタンパク質をリークし始めると。血管透過性を持っている組織の急速な青みがかった色でこの結果。
マウス外側尾静脈に色素の注射は成功した実験の良い結果のために重要である。尾静脈注射技術は広範囲の練習を必要とし、実験を開始する前に習得しなければならない。
血管の透過性は、年齢や体重に大きく依存しているimalので、異なるマウス系統を比較するときには、マウスまたは他の被験者が同じ誕生日と体重の近くに持っていることが不可欠です。内皮関門の透過性に影響を与えるその他の要素には、温度、湿度などの環境条件であり、非常に重要なのは、マウスのハンドリングストレス。それは実験を少なくとも3回実行される統計解析が繰り返されることを常に推奨されている実験の結果に影響を与えることができ、多数の要因に起因する。
このアッセイは、血管遺伝的に改変されたマウスの透過性だけでなく、さまざまな遺伝的背景を持つマウスを比較したり、使用することができます。透磁率が変調されている遺伝子の機能に応じて、刺激の有無で評価することができる。このアッセイは、血管透過性の異なる化合物の効果をテストするために使用したりすることができます。
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Protocol
1。マウス外側尾静脈内エバンスブルーの静脈注射
- PBS中のエバンスブルーの0.5％滅菌溶液を調製します。必要に応じて、溶解していない任意の粒子状物質を除去するためのソリューションをフィルター滅菌してください。
- シリンジに200μlのエバンスブルー溶液を吸引します。注射器の中に逃れた可能性のあるすべての気泡を避けてください。
- 動物が自由に携帯電話ではありませんが、その尾を扱うことができるように、拘束装置に8から12週齢場所マウス。
- 外側尾静脈が簡単に表示されるように、その側にマウスの拘束装置を置き、上向きに直面しています。
- 親指と人差し指の間の非利き手と尻尾にしがみつく。
- 10から15度の角度、ベベルアップ、ヘッドの方向に向かって横方向の尾静脈に事前に針（小ゲージ、27から30）を挿入します。尾に針と注射器を平行に保ってください。
- Doは、静脈を崩壊かもしれないように適切な配置を確認するために背圧を適用しない。
- ゆっくりマウスの尾静脈に200μlのエバンスブルー溶液を注入します。
- これは静脈に針の正しい配置の証拠であるように、プランジャーの進歩と使いやすさを守ってください。
- そのケージに戻ってマウスを置き、30分間それを観察します。
2。臓器から臓器コレクションとエバンスブルーの抽出
- 頚椎脱臼を介してマウスを生け贄に捧げる。それは血管透過性と有意な干渉を制限としてマイルズアッセイの目的のために頸椎脱臼が推奨されます。できるだけ速く、同時にすべてのマウスを生け贄に捧げる。死の血管はより透過性になるので、直後に、6匹のマウス以下のコホートで動作します。
- 背中にマウスを置き、ホワイトボードに自分の足を確保します。
- トールを公開するための腹部および胸腔を開くACIC腹部臓器。
- エバンスブルー溢出の違いを示すために代表的な写真を撮る。すべてのマウスの場合、同一の照明条件を持たせるために、同じフィールド内のすべてのマウスが含まれています。
- 興味のある臓器を収集し、1.5 mlチューブに入れ
- 空のチューブを計量し、ゼロにバランスの値を持って来る。
- 組織試料を移し、それを重み付けする。すべての組織試料について、この手順を繰り返します。組織は、さまざまな器官の間の水分含量の変動を除去するために乾燥空気とすることができます。
- 。各組織試料チューブに500μlのホルムアミドを追加します。
- 55℃の水浴またはヒートブロックにすべてのチューブを転送します。組織からエバンスブルーを抽出するために24〜48時間インキュベートする。
3。エバンスブルーの定量化は、間質組織に溢出
- ペレット残っている組織片へホルムアミド/エバンスブルーの混合物を遠心分離します。
- 610で吸光度を測定nmである。ブランクとして500μlのホルムアミドを使用しています。
- mgの組織ごとに溢出ngのエバンスブルーを計算します。
- グラフ内のすべてのデータをプロットします。
- 有意差を決定するために統計分析を実行します。
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Representative Results
我々は、8〜12週齢のマウスでは血管漏出をテストするために生体透過性アッセイに使用。このテストでは、異なる遺伝的背景や血管系に影響を与える処理を施したマウスの単一株の動物との間の相対的な血管透過性を比較するのに有用である。我々の結果は、我々は我々の研究室で作成された遺伝子改変マウスの株は野生型マウスと比較して、より透過性の内皮細胞があることを示している。これらの変化は、多くの臓器の肉眼的レベル（ 図1）で明らかにされています。
我々はspectophotometricaly異なる臓器で組織1g当たり捕獲されたエバンスブルーを測定することにより、血管透過性の違いを定量化することができました。我々は、 図で見てきたように、2つの異なる器官が透誘導信号に異なる応答を示すので、異なる色素の蓄積を示す。これはまた、異なる組織における血管新生のレベルの関数です。
図1。組織中のエバンスブルーは血管外漏出。エバンスブルー注入マウスを頚椎脱臼を通して犠牲にした30分後。興味のある臓器の代表的な写真を撮影した。
図2。エバンスブルー溢出の定量は、異なる組織インチ 50〜100 mgの組織を溢出エバンスブルーを抽出するために、500μlのホルムアミドと共にインキュベートした。光学密度を610 nmとmgの組織ごとに溢出ngの色素に変換測定で測定した。実験は3回繰り返した。
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Discussion
血管透過性は、血管の状態のための重要なマーカーである。増加した血管透過性は、糖尿病、高血圧症、自己免疫疾患6,7,8を含むいくつかの全身性疾患、に存在することが示されている。増加した血管透過性がせん断応力によって媒介されることが示されており、血管内皮細胞増殖因子と線維芽細胞増殖因子、セロトニン、ヒスタミン、ブラジキニン9のような炎症性メディエーターのような成長因子。水および小分子の血管外漏出は、内皮細胞の間の小さな開口部を介して起こると考えられている。細胞と細胞の接合部の強度が厳密に10分子間の相互作用によって調節されている。
生理的条件下では、内皮細胞は、水とイオン透過性、およびタンパク質に不透過性である。したがって、炎症性刺激の非存在下では、アルブミンは血流に制限され、細胞外液には移動しない。 Eを注入することにより、バン·ブルー、アルブミン結合する色素は、我々は間質組織への血流からの蛋白漏出の程度を監視することができます。
このアッセイの修正版は、蛍光標識した微小球を使用しています。異なるサイズの微小球または分子量の異なる蛍光標識デキストラン（4から70 kDa）を使うことによって、より良い内皮の損傷の程度を評価することができます。ただし、このオプションでは、可視化のしやすさを排除し、それが組織や蛍光顕微鏡イメージング、または蛍光プレートリーダーを用いて測定を固定する必要があります。
in vitroでの血管透過性の研究は、文献11に成功裏に使用されている。 in vitroでの透水試験における任意の必須成分はそのまま、コンフルエントな細胞単層である。これらのアッセイは、血管内皮細胞が上部チャンバーに位置透過性膜上の単層で培養され、古典的なダブルチャンバーを使用しています。染料は、上部に適用されますチャンバーと内皮細胞の透過性を、下部チャンバーに達し色素の量を測定することによって評価されています。結果は 、in vivoアッセイの結果で 、ほとんどの場合、模倣する。しかし、彼らは適切な生理学的な文脈を欠いており、それによって結果の複雑さによって複雑にされています。 in vitroでのアプローチでも、周皮細胞、生体組織において、内皮細胞と密接に接触している細胞の役割を排除し、内皮細胞の増殖、血管の成長や分岐のための信号を送信します。
マイルス·テストの結果は、理想的には、さらにテストされているという仮説を調べる分子生物学的研究を添付しなければならない。前述したように、生物全体で、血管透過性は、多くの変数に依存しており、従って生体透過性アッセイの結果は、分析し、システムの複雑さに照らして解釈する必要があります。
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Disclosures
著者らは、利害の衝突や競合する金融利害関係はありません。
Acknowledgments
この作品は、米国国立衛生研究所、R01CA142928からの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 | |
References
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