Summary
Vi presenterer en
Abstract
Denne metoden er basert på den intravenøse injeksjon av Evans Blue i mus som testen dyremodell. Evans blå er et fargestoff som binder albumin. Under fysiologiske betingelser endotelet er ugjennomtrengelig til albumin, så Evans Blue bundet albumin restene begrenset innenfor blodkar. I patologiske forhold som fremmer øket vaskulær permeabilitet endotelceller delvis miste sine nære kontakter og endotelet blir gjennomtrengelig for små proteiner som albumin. Denne tilstanden tillater ekstravasasjon av Evans Blue i vev. En sunn endothelium hindrer ekstravasering av fargestoffet i de nærliggende vaskularisert vev. Organer med økt permeabilitet vil vise betydelig blå farge i forhold til organer med intakt endotel. Nivået av vaskulær permeabilitet kan vurderes ved enkle visualisering eller ved kvantitativ måling av fargestoffet innlemmet per milligram vev av kontroll versus forsøksdyr / vev. To powerful aspekter ved denne analysen er dens enkelhet og kvantitative karakteristika. Evans Blue fargestoff kan utvinnes fra vev ved inkubering av en bestemt mengde vev i formamid. Evans Blue absorbans maksimum er på 620 nm og absorbans minimum er ved 740 nm. Ved å bruke en standard kurve for Evans Blue, kan optiske tetthetsmålinger bli omdannet til milligram fargestoff fanget per milligram av vev. Statistisk analyse bør brukes til å vurdere signifikante forskjeller i permeabilitet.
Introduction
Dannelse og vedlikehold av selektive permeable barrierer er avgjørende for riktig organ utvikling og ytelse 1,2. Endotelceller linje blodkaret lumen og danne en semi-permeabel barriere som er vesentlig i selektiv transport mellom blod og den interstitielle rommet av alle organer. En tilstrekkelig permeabilitet barriere opprettholdes gjennom trange celle-til-celle kryss som er strengt kontrollert av vekstfaktorer, cytokiner og andre stressrelaterte molekyler 3. Forstyrrelse av endotelcelle barriere kan føre til økt permeabilitet og vaskulær lekkasje. Disse effektene er sett i ulike sykdomstilstander og forståelse av understrekingen molekylære signaler krever tverrfaglig metoder 4,5. I denne artikkelen beskriver vi en in vivo metode for å måle fartøyets permeabilitet ved hjelp av en mus modell.
Analysen vi beskriver, også kjent som Miles analysen, er en godt established metode for å teste vaskulær permeabilitet in vivo. Forsøket er basert på det faktum at under basale fysiologiske betingelser, ikke albumin ikke krysse endoteliale barrieren. Evans Blue, et azo fargestoff med høy affinitet for albumin, blir injisert i blodstrømmen av et forsøksdyr, og under fysiologiske betingelser, er det forventet å være begrenset i blodkar. Når en vaskulær permeabilitet stimulans tilsettes enten topisk eller systemisk, blodkar begynner å lekke protein og således, også Evans blått som er bundet til albumin. Dette resulterer i en hurtig blålig farge av vev som har permeable fartøy.
Vellykket injeksjon av fargestoffet i musen lateral halevenen er kritisk for godt resultat av forsøket. Halevenen injeksjonsteknikk trenger omfattende praksis og bør mestret før start av eksperimentet.
Fartøy permeabilitet er avhengig av alder og vekten av enimal, så når man sammenligner ulike musestammer er det viktig at de mus eller andre forsøkspersoner har nærmere identiske fødselsdatoer og vekt. Andre faktorer som påvirker permeabilitet endothelial barrieren er miljømessige forhold som temperatur, fuktighet, og svært viktig, håndtering stress av musen. På grunn av de mange faktorene som kan påvirke utfallet av eksperimentet er det alltid tilrådelig at forsøket gjentas minst tre ganger og statistisk analyse utført.
Denne analysen kan brukes eller sammenligne fartøy permeabilitet av mus som er blitt genetisk modifisert, samt mus med ulike genetiske bakgrunn. Permeabilitet kan vurderes i nærvær eller fravær av en stimulans, avhengig av funksjonen av genet som er modulert. Denne analysen kan også bli brukt, eller å teste effekten av forskjellige forbindelser på fartøyet permeabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Intravenøs injeksjon av Evans Blue i Mouse Lateral halevenen
- Forberede en 0,5% steril løsning av Evans blå i PBS. Om nødvendig, filter-sterilisere løsningen for å fjerne eventuelle partikler som ikke har løst seg opp.
- Aspirer 200 ul Evans Blue løsning i en sprøyte. Unngå alle luftbobler som kan ha rømt inn i sprøyten.
- Sted mus som er 8-12 uker gamle i en tilbakeholdenhet enheten slik at dyret ikke er fritt mobil, men halen kan håndteres.
- Plasser musen tilbakeholdenhet enhet på sin side så den laterale halevenen er lett synlig og vender oppover.
- Hold på halen med den ikke-dominerende hånd mellom tommel og pekefinger.
- Sett nålen (liten sporvidde, 27-30) på en 10-15 graders vinkel, skråkant opp, rykke inn i laterale halevenen mot retning av hodet. Hold nålen og sprøyten parallelt med halen.
- Do ikke gjelde mottrykk for å bekrefte riktig plassering som dette kan kollapse venen.
- Injiser sakte 200 ul Evans Blue løsning i halevenen til musen.
- Observere hvor lett stemplet fremskritt, da dette er beviset på riktig plassering av nålen i venen.
- Sett musen tilbake i buret sitt og observere det i 30 min.
2. Organ Innsamling og Utvinning av Evans Blue fra organer
- Ofre musene gjennom cervical forvridning. For Miles analysen formål cervical forvridning er anbefalt som det begrenser signifikant interferens med vaskulær permeabilitet. Ofre alle musene samtidig, så fort som mulig. Arbeid med årskull av 6 mus eller mindre, fordi kort tid etter døden blodårene blir mer gjennomtrengelig.
- Plasser mus på ryggen og pin føttene på en hvit bord.
- Åpne mage-og brysthula å avsløre thoracic og abdominal organer.
- Ta representative bilder for å vise forskjeller i Evans Blue ekstravasasjon. Inkludere alle mus i samme felt for å ha identiske lysforhold for alle mus.
- Samle organer av interesse og sette dem i 1,5 ml rør
- Vei en tom tube og bringe balanse til null.
- Overfør vevsprøve og vekt det. Gjenta for alle vevsprøver. Vev kan være lufttørket eliminere vanninnholdet variabilitet mellom ulike organer.
- . Tilsett 500 pl formamid til hver vevsprøve rør.
- Overføre alle rørene i et 55 ° C vannbad eller varme blokk. Inkuber i 24-48 timer for å trekke Evans Blue fra vev.
3. Kvantifisering av Evans Blue extravasated i Interstitiell Tissue
- Sentrifuger formamid / Evans Blue blandingen til pellet eventuelle gjenværende vev fragmenter.
- Mål absorbansen ved 610nm. Bruk 500 ul formamid som tomme.
- Beregn ng Evans Blue ekstravasert per mg vev.
- Plotte alle data i en graf.
- Utføre statistisk analyse for å fastslå betydelige forskjeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brukte en in vivo permeabilitet analyse for å teste fartøyet lekkasje i mus 8-12 uker gamle. Denne testen er nyttig i å sammenligne den relative permeabilitet mellom dyr av forskjellig genetisk bakgrunn eller i en enkelt stamme av mus utsatt for behandlinger som påvirker vaskulatur. Våre resultater viser at en stamme av genmodifiserte mus vi opprettet i vårt laboratorium har en mer gjennomtrengelig endotel sammenlignet med vill-type mus. Disse endringene er tydelig ved makroskopisk nivå i mange organer (Figur 1).
Vi var i stand til å kvantifisere forskjellen i skipet permeabiliteten ved spectophotometricaly måle Evans Blue som ble tatt til fange per gram vev i ulike organer. Som vi har observert i figur 2 forskjellige organer viser forskjellig respons på permeabilitet induser signaler og dermed vise annen farge akkumulering. Dette er også en funksjon av nivået av vaskularisering i ulike vev.
Figur 1. Evans Blue Ekstravasasjon i vev. 30 minutter etter Evans blå injeksjon mus ble ofret gjennom cervical forvridning. Representative bilder av organer av interesse ble tatt.
Figur 2. Kvantitering av Evans Blue ekstravasasjon i forskjellige vev. 50-100 mg vev ble inkubert med 500 pl formamid å trekke ekstravasert Evans Blue. Optisk tetthet ble målt ved 610 nm og målinger konverteres til ng fargestoff ekstravasert per mg vev. Forsøket ble gjentatt tre ganger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vaskulær permeabilitet er en kritisk markør for blodkar status. Økt vaskulær permeabilitet er vist å være til stede i flere systemiske sykdommer, som diabetes, hypertensjon og autoimmune sykdommer 6,7,8. Økt vaskulær permeabilitet er vist å være mediert av skjærspenning, vekstfaktorer som vaskulær endotelial vekstfaktor og fibroblast vekstfaktor, inflammatoriske mediatorer som serotonin, histamin og bradykinin 9. Ekstravasasjon av vann og små molekyler er tenkt å skje gjennom små åpninger mellom endotelceller. Styrken i celle-til-celle kryss er strengt regulert ved interaksjon mellom molekyler 10.
I fysiologiske tilstander endotel er gjennomtrengelig for vann og ioner, og ugjennomtrengelig for proteiner. Således i fravær av inflammatoriske stimuli, er albumin begrenset til blodstrømmen og flyttes ikke i det ekstracellulære fluidum. Ved å injisere Evarebiler Blue, et fargestoff som binder albumin, kan vi overvåke graden av protein lekkasje fra blodstrømmen inn i interstitiell vev.
En modifisert versjon av denne analysen benytter fluorescerende-merket mikrokuler. Ved å bruke forskjellig størrelse mikrokuler eller forskjellige molekylvekt fluorescerende-merket dekstran (4-70 kDa) kan man bedre vurdere omfanget av endotelisk skade. Men eliminerer dette alternativet enkel visualisering og det krever fikse vev og fluorescerende mikroskopi bildebehandling, eller måling med en fluorescens plateavleseren.
In vitro studier av fartøy permeabilitet har blitt brukt med hell i litteraturen 11. En viktig ingrediens i noen in vitro permeabilitet studien er en intakt, konfluent celle monolayer. Disse assays bruke en klassisk dobbel kammer hvor endotelceller dyrkes i et monosjikt på en permeabel membran som ligger i det øvre kammer. Et fargestoff påføres øvrekammer og endotelcelle permeabilitet vurderes ved å måle mengden av fargestoff som når det nedre kammer. Resultatene etterligne i de fleste tilfeller i vivo analyseresultatene. Men de mangler den riktige fysiologisk sammenheng, og er dermed komplisert av kompleksiteten av resultater. In vitro tilnærmingen eliminerer også rollen pericytes, celler som, i levende vev, er i nær kontakt med endotelceller og sende signaler for endotelcelleproliferasjon, fartøy vekst og forgrening.
De Miles testresultatene bør ideelt sett være ledsaget av molekylære studier som ytterligere undersøke hypotesen som blir testet. Som nevnt, i en hel organisme, er vaskulær permeabilitet avhengig av mange variabler, og dermed resultater av en in vivo-permeabilitet assay må tolkes i lys av kompleksiteten i systemet analyseres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikt eller konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Institutes of Health, R01CA142928.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 | |
References
- Beck, K. F., et al. Inducible NO synthase: role in cellular signaling. J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).
- Bertglia, S., Giusti, A. Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).
- Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs. J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).
- Weis, S. M. Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer. Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).
- Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation. Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).
- Scheppke,, et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability. J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).
- Dvorak, A. M. Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle. Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).
- Le Guelte, A., Gavard, J. Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability. Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).
