Summary
Vi presenterar en
Abstract
Denna metod är baserad på den intravenösa injektionen av Evans Blue i möss som provningen djurmodell. Evans-blått är en färg som binder albumin. Under fysiologiska förhållanden endotelet är ogenomtränglig för albumin, så Evans Blue bundna albumin fortfarande begränsad inom blodkärl. I patologiska förhållanden som främjar ökad vaskulär permeabilitet endotelceller delvis förlorar sina nära kontakter och endotelet blir permeabel för små proteiner såsom albumin. Detta tillstånd medger extravasation av Evans Blue i vävnader. En frisk endotel förhindrar extravasation av färgämnet i de närliggande vaskulariserade vävnader. Organ med ökad permeabilitet visar signifikant ökad blåfärgning jämfört med organ med intakt endotel. Nivån av vaskulär permeabilitet kan bedömas genom enkel visualisering eller genom kvantitativ mätning av färgämnet införlivat per milligram vävnad av kontroll kontra försöksdjur / vävnad. Två Powerful aspekter av denna analys är dess enkelhet och kvantitativa egenskaper. Evans Blue kan extraheras från vävnader genom att inkubera en specifik mängd vävnad i formamid. Evans Blue absorbansmaximum är 620 nm och absorbansen minst är 740 nm. Genom att använda en standardkurva för Evans Blue, kan optiska densitetsmätningar omvandlas till milligram färgämne fångas per milligram vävnad. Statistisk analys bör användas för att bedöma signifikanta skillnader i vaskulär permeabilitet.
Introduction
Bildning och underhåll av selektiva permeabla barriärer är nödvändig för korrekt orgel utveckling och resultat 1,2. Endotelceller linje lumen blodkärlet och bildar en semi-permeabel barriär som är viktigt i den selektiva transporten mellan blod och det interstitiella utrymmet för alla organ. En adekvat permeabilitetsbarriär upprätthålls genom trånga cell-till-cell-korsningar som strängt kontrolleras av tillväxtfaktorer, cytokiner och andra stressrelaterade molekyler 3. Rubbning av endotelcell barriären kan resultera i ökad permeabilitet och vaskulär läckage. Dessa effekter kan ses i olika sjukdomstillstånd och förståelsen av understrykningen molekylär signalering kräver tvärvetenskapliga metoder 4,5. I den här artikeln beskriver vi en in vivo metod för att mäta fartygets permeabilitet med en musmodell.
Analysen vi beskriver, även känd som Miles analys är en väl Etablished metod för att testa vaskulär permeabilitet in vivo. Analysen är baserad på det faktum att under basala fysiologiska förhållanden, inte albumin inte korsa endoteliala barriären. Evans Blue, ett azofärgämne med hög affinitet för albumin, injiceras i blodomloppet av ett försöksdjur, och under fysiologiska betingelser, förväntas vara begränsad inom blodkärl. När en vaskulär permeabilitet stimulans tillsätts, antingen topiskt eller systemiskt, blodkärl börjar läcka protein och därmed även Evans blå som är bundet till albumin. Detta resulterar i en snabb blåaktig färgning av vävnader som har permeabla fartyg.
Framgångsrik injektion av färgämnet i mus laterala svansvenen är avgörande för bra resultat av experimentet. Svansveninjektion teknik kräver omfattande praxis och bör bemästras innan du startar experimentet.
Kärl permeabilitet är starkt beroende på ålder och vikt av enimal så när man jämför olika musstammar är det absolut nödvändigt att de möss eller andra försökspersoner har nära identiska födelsedatum och vikt. Andra faktorer som påverkar permeabiliteten för endoteliala barriären är miljöfaktorer såsom temperatur, fuktighet, och mycket viktigt, hantering stress musen. På grund av de många faktorer som kan påverka resultatet av experimentet är det alltid klokt att experimentet upprepas minst tre gånger och statistisk analys.
Denna analys kan användas eller för att jämföra fartyg permeabilitet hos möss som är genetiskt modifierade, samt möss med olika genetiska bakgrunder. Permeabilitet kan bedömas i närvaro eller frånvaro av ett stimulus, beroende på funktionen av genen som är modulerad. Denna analys kan också användas eller för att testa effekten av olika föreningar på fartyg permeabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Intravenös injektion av Evans Blue i mus laterala svansvenen
- Bered en 0,5% steril lösning av Evans blått i PBS. Om nödvändigt, filter-sterilisera lösningen för att avlägsna eventuella partiklar som inte har lösts upp.
- Aspirera 200 pl Evans Blue lösning i en spruta. Undvik alla luftbubblor som kan ha undgått i sprutan.
- Placera möss som är 8-12 veckor gamla i en kvarhållande anordning så att djuret inte fritt rörlig men svansen kan hanteras.
- Placera enheten musen återhållsamhet på sidan så den laterala svansvenen är väl synlig och uppåt.
- Håll på svansen med den icke-dominanta handen mellan tummen och pekfingret.
- För in nålen (liten tjocklek, 27-30) vid en 10-15 graders vinkel, avfasning upp, avancera till den laterala svansvenen mot riktningen av huvudet. Håll nålen och sprutan parallellt med svansen.
- Do inte tillämpas mottryck för att bekräfta korrekt placering eftersom det kan kollapsa venen.
- Injicera långsamt 200 | il Evans Blue lösning i svansvenen på musen.
- Observera den lätthet med vilken kolven framåt, eftersom detta är ett bevis på korrekt placering av nålen i venen.
- Sätt musen tillbaka till sin bur och observera den under 30 min.
2. Organ Insamling och utvinning av Evans Blue från organ
- Offra mössen genom cervikal dislokation. För Miles analysändamål halsdislokation rekommenderas eftersom det begränsar betydande interferens med vaskulär permeabilitet. Sacrifice alla möss vid samma tidpunkt, så snabbt som möjligt. Arbeta med grupper av 6 möss eller mindre, eftersom strax efter döden blodkärlen blir mer genomsläpplig.
- Placera möss på ryggen och stift fötterna på en whiteboard.
- Öppna buk och brösthålan att exponera thoracic och bukorganen.
- Ta representativa bilder att visa skillnader i Evans Blue extravasering. Inkludera alla möss i samma område för att få samma ljusförhållanden för alla möss.
- Samla organ av intresse och lägg dem i 1,5 ml rör
- Väg ett tomt rör och bringa balans värdet till noll.
- Överför vävnadsprovet och vikt den. Upprepa för alla vävnadsprover. Vävnader kan vara lufttorkas att eliminera variabiliteten vattenhalten mellan olika organ.
- . Lägg 500 pl formamid till varje vävnadsprov rör.
- Överför alla rören till en 55 ° C vattenbad eller värmeblock. Inkubera 24-48 timmar för att extrahera Evans Blue från vävnad.
3. Kvantifiering av Evans Blue extravaserade i Interstitiell Tissue
- Centrifugera Formamid / Evans Blue blandning att pelletera eventuella kvarvarande vävnadsfragment.
- Mät absorbansen vid 610nm. Använd 500 pl formamid som blankprov.
- Beräkna ng Evans Blue extravasation per mg vävnad.
- Rita alla data i ett diagram.
- Utför statistisk analys för att bestämma signifikanta skillnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi använde en in vivo permeabilitet test för att testa fartygets läckage i möss 8-12 veckor gamla. Detta test är användbart vid jämförelse av den relativa vaskulära permeabiliteten mellan djur av olika genetisk bakgrund eller i en enda stam av möss som utsatts för behandlingar som påverkar vaskulaturen. Våra resultat visar att en stam av genetiskt modifierade möss som vi skapat i vårt labb har en mer genomsläpplig endotel än vildtyp möss. Dessa förändringar är uppenbara på makroskopisk nivå i många organ (figur 1).
Vi kunde kvantifiera skillnaden i kärlet permeabilitet genom spectophotometricaly mäta Evans Blue som fångades per gram vävnad i olika organ. Som vi observerat i figur 2 olika organ visar olika svar på signaler permeabilitet inducerare och därmed visa olika färg ackumulering. Detta är också en funktion av halterna av vaskularisering i olika vävnader.
Figur 1. Evans Blue Extravasering i vävnader. 30 min efter Evans blue injektion möss avlivades genom cervikal dislokation. Representativa bilder av organ av intresse togs.
Figur 2. Kvantifiering av Evans Blue extravasation i olika vävnader. Var 50-100 mg vävnad inkuberas med 500 pl formamid att extrahera extravasation Evans Blue. Optisk densitet mättes vid 610 nm och mätningarna omvandlas till ng färgämne extravasation per mg vävnad. Experimentet upprepades tre gånger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vaskulär permeabilitet är en kritisk markör för blodkärl status. Ökad vaskulär permeabilitet har visat sig vara närvarande i flera systemiska sjukdomar, däribland diabetes, högt blodtryck, och autoimmuna sjukdomar 6,7,8. Ökad vaskulär permeabilitet har visat vara förmedlad av skjuvspänning, tillväxtfaktorer såsom vaskulär endotelial tillväxtfaktor och fibroblasttillväxtfaktor, inflammatoriska mediatorer som serotonin, histamin och bradykinin 9. Extravasering av vatten och små molekyler tros ske genom små öppningar mellan endotelceller. Styrkan i cell-till-cell korsningar regleras strikt av växelverkan mellan molekyler 10.
I fysiologiska betingelser endotel är permeabelt för vatten och joner, och ogenomträngligt för proteiner. Sålunda, i frånvaro av inflammatoriska stimuli, är albumin begränsad till blodflödet och inte flytta in i den extracellulära vätskan. Genom att injicera Eskåpbilar blå, ett färgämne som binder albumin, kan vi följa omfattningen av protein läckage från blodflödet till interstitiella vävnaden.
En modifierad version av denna analys använder fluorescensmärkt mikrosfärer. Genom att använda olika storlek mikrosfärer eller olika molekylvikt fluorescensmärkt dextran (4-70 kDa) kan man bättre bedöma omfattningen av endotelskada. Men eliminerar detta alternativ hur lätt visualisering och det kräver fastställande av vävnader och fluorescensmikroskopi avbildning eller mätning med hjälp av en fluorescens plattläsare.
In vitro-studier av fartygets permeabilitet har använts med framgång i litteraturen 11. En väsentlig ingrediens i någon permeabilitet in vitro studie är en intakt, sammanflytande cellmonoskikt. Dessa analyser använder en klassisk dubbel kammare där endotelceller odlas i ett monoskikt på ett permeabelt membran som ligger i den övre kammaren. Ett färgämne appliceras på övrekammare och endotelcell permeabilitet bedöms genom att mäta mängden färgämne som når den undre kammaren. Resultaten efterliknar i de flesta fall i vivo analysresultat. De saknar dock den lämpliga fysiologiska sammanhang och därmed kompliceras av komplexiteten av resultaten. In vitro metod eliminerar också rollen av pericyter, celler som i levande vävnad, är i nära kontakt med endotelceller och sända signaler för endotelcellproliferation, kärltillväxt och förgrening.
Miles testresultaten bör helst åtföljas av molekylära studier som ytterligare undersöka hypotesen att testas. Som nämnts i en hel organism, är vaskulär permeabilitet beror på många variabler, och därmed resultaten av en in vivo-permeabilitet test måste tolkas mot bakgrund av komplexiteten i systemet analyseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen konflikt eller konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health, R01CA142928.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 | |
References
- Beck, K. F., et al. Inducible NO synthase: role in cellular signaling. J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).
- Bertglia, S., Giusti, A. Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).
- Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs. J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).
- Weis, S. M. Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer. Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).
- Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation. Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).
- Scheppke,, et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability. J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).
- Dvorak, A. M. Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle. Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).
- Le Guelte, A., Gavard, J. Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability. Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).
