Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

قياس عمر في doi: 10.3791/50068 Published: January 7, 2013

Summary

ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا هو كائن نموذج قوية لاستكشاف الأساس الجزيئي للتنظيم طول العمر. وهذا البروتوكول مناقشة الخطوات المتبعة في توليد استنساخه، على أساس السكان قياس طول العمر وكذلك المزالق المحتملة وكيفية تجنبها.

Abstract

الشيخوخة هي ظاهرة في ذلك من تدهور مطرد في الكائنات الفسيولوجية جميع تقريبا التي تم فحصها، مما أدى إلى انخفاض الأداء البدني وزيادة خطر المرض. الشيخوخة الفردية هو واضح في مستوى السكان وزيادة في العمر التي تعتمد على وفيات، والتي غالبا ما يتم قياس في المختبر بواسطة عمر الرصد في الأفواج كبير من الأفراد في سن المتطابقة. التجارب التي تسعى لتحديد مدى وراثية أو بيئية التلاعب في الكائنات أثر عمر نموذج بسيط نجحت بشكل ملحوظ لفهم جوانب الشيخوخة التي من الحفظ عبر الأنواع واستراتيجيات جديدة لالملهم لتمديد عمر ومنع الأمراض المرتبطة بالسن في الثدييات .

الطاير الخل، ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا، هو كائن حي نموذج جذاب لدراسة آليات الشيخوخة بسبب بقائه قصيرة نسبيا، وتربية مريحة، وعلم الوراثة السهل.ومع ذلك، التدابير الديموغرافية للشيخوخة، بما في ذلك سن محددة البقاء وفيات، هي عرضة للتغيرات غير عادية حتى طفيفة في التصميم التجريبي والبيئة، ومطلوب الحفاظ على الممارسات المختبرية صارمة لمدة من التجارب الشيخوخة. هذه الاعتبارات، إلى جانب الحاجة لممارسة السيطرة حذرا من الخلفية الوراثية، ضرورية لتوليد قياسات قوية. في الواقع، هناك العديد من الخلافات البارزة المحيطة الاستدلال من التجارب طول العمر في الخميرة والديدان والذباب والفئران التي تم ارجاعها الى التحف البيئية أو الوراثية 1-4. في هذا البروتوكول، ونحن تصف مجموعة من الإجراءات التي تم الأمثل على مدى سنوات عديدة لقياس طول العمر في ذبابة الفاكهة باستخدام قارورة المختبر. وصفنا أيضا استخدام البرنامج dLife، الذي تم تطويره من قبل مختبر لدينا، وهي متاحة للتحميل ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / سوفت وير). dLife يسرع ويعزز الإنتاجية حسب التصميم الممارسات الجيدة إدماج التجريبية الأمثل، وتبسيط التعامل مع ذبابة وجمع البيانات، وتوحيد تحليل البيانات. وسوف نناقش أيضا كثير من المزالق المحتملة في تصميم وجمع وتفسير البيانات وعمر، ونحن نقدم خطوات لتجنب هذه المخاطر.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

نوصي تخزين الأطعمة التجريبية، ومعجون الخميرة، وأجار لوحات العنب التي تظهر في البروتوكول في C ° 4 و استخدامها في غضون 1-2 أشهر طالما العفن وجفاف لم نحدد فيها الظروف البيئية القياسية لكل من اليرقات والكبار تنظيم تنطوي صيانة الذباب في حاضنة في C ° 25 مع دورة الضوء 12:12 ساعة الظلام والرطوبة النسبية 60٪.

1. إعداد تجريبية من السلع الغذائية

  1. للنمو اليرقات، نستخدم معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا معدلة متوسطة الذي هو مختصر في هذا البروتوكول CT.
  2. نوصي اتباع نظام غذائي لذبابة الفاكهة الكبار (SY) التي تتكون من السكر (السكروز) والخميرة (خميرة البيرة كله مجفف بالتجميد) في قاعدة أجار 2٪، الذي سبق غليه، على أن تستكمل مع المضادات الحيوية والأدوية المضادة للفطريات، وتوزيع (10 مل لكل قنينة) 6. وينبغي أن يسمح لترسيخ والغذاء لمدة 12-24 ساعة تتبخر قبل التخزين. لأنه لا يمكن البيئة المغذيات substanطول العمر tially أثر، والاتساق في عمليات الطبخ أمر ضروري سواء داخل تجربة وللمقارنة بين التجارب.
  3. إذا هو وكيل الدوائية التي يمكن ان تضاف الى الغذاء الكبار، ويمكن أن تكون مختلطة في هذا الدواء دفعة صغيرة من الطعام والطبقات (2 مل) على سطح المواد الغذائية، مع قارورة تحتوي على طبقات شاهدة تتلقى السيارة وحدها.

2. إعداد عجينة الخميرة لايف

الجمع بين 5-6 مل من الماء مع 3 غرام من الخميرة الجافة النشطة وتخلط جيدا. ينبغي للاتساق عجينة الخميرة التي تكون من زبدة الفول السوداني على نحو سلس.

3. إعداد لوحة آجار العنب

  1. إضافة حزمة من خلائط جاهزة أجار العنب في 500 مل من الماء المقطر في دورق مل 1000 واتبع التعليمات التي تظهر على الحزمة إلى حل مزيج أجار العنب.
  2. صب بعناية طبقة سميكة من الخليط في أطباق بتري 100 ملم مع تجنب تشكيل فقاعة. حزمة واحدة من الخلطة الجاهزة وتنتج حوالي 14 جرالوحات أجار بي.
  3. اسمحوا تبرد وسائل الإعلام في ترسيخ ودرجة حرارة الغرفة مع الأغطية لمدة 15 دقيقة. يمكن أن تظل لوحات في 4 درجات مئوية، ملفوفة في غلاف بلاستيكي، أو استخدامها على الفور.

4. جمع البيض المتزامنة

ينبغي لجميع وسائل الإعلام المستخدمة في هذا البروتوكول، أي الخميرة، لوحات أجار العنب، CT و 10٪ الغذاء SY، يكون في درجة حرارة الغرفة.

  1. نشر قطره سم 2-3 طبقة من الخميرة لصق على لوحة أجار العنب وتوضع جانبا.
  2. وضع مجموعة بيضة كبيرة القفص على لوحة 2 CO-مع الجانب وصولا الى شبكة تخدير الذباب. النيتروجينية التخدير هو بديل لCO وتستخدم من قبل بعض المختبرات، التي يمكن أن تسفر عن نتائج ذات جودة عالية 7.
  3. باستخدام القمع، ونقل 150-200 أزواج من الذباب في قفص البيض المجموعة.
  4. وضع لوحة أجار العنب لتغطية نهاية مفتوحة من القفص وتأمين غطاء مع نهاية.
  5. وضع القفص على جانبها حتى الذباب يستيقظون.ثم، والحفاظ على القفص، لوحة أجار العنب الجانب السلبي، في الحاضنة بين عشية وضحاها.
  6. في اليوم التالي، لوحة تبديل العنب العنب مع لوحة yeasted حديثا. فقط وضع حوالي 1 سم قطر من معجون الخميرة على سطح اللوحة. تجاهل عيد القديس 1 لوحة العنب.
  7. السماح لجمع الأجنة على سطح لوحة أجار العنب ل16-22 ساعة. وبمجرد القيام به، وجمع لوحة أجار العنب وتجاهل الذباب الأصل.
  8. غسل السطح من لوحات أجار العنب مع 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). يمكن تعبئتها عن طريق كشط بلطف البيض مع مسحة القطن. والحرص على عدم الضرر، الصفر، أو كشط قطعة رقيقة من أجار قبالة سطح اللوحة. مع المعونة من القمع، صب البيض غسلها في أنبوب 15 مل المخروطية.
  9. السماح للبيض تستقر في قاع الأنبوب وتصب قبالة طاف، والحرص على ألا تفقد أي البيض. يجب أن يكون حجم ما تبقى حوالي 2-3 مل.
  10. إضافة 8-10 مل من برنامج تلفزيوني للأنبوب وكرر ما سبق خطوة مور 2-3ه مرات لغسل بدقة البيض حتى طاف واضحة. التخلص من الخميرة المتبقية هو المفتاح في هذه الخطوة.
  11. بعد غسل وتجفيف جميع طاف حتى حجم 2 مل المتبقية. قسامة 32 ميكرولتر من البيض في زجاجات CT باستخدام تلميح ماصة واسعة الجوف. يجب البيض في الطرف ماصة تكون مدمجة، مع قليل من السائل لا يستنشق. ويمكن تحقيق هذا عن طريق إدراج غيض ماصة في عمق تسوية البيض والإفراج عن الغطاس بسرعة لنضح.
  12. مكان المصنفة CT زجاجات مرة أخرى في جميع أنحاء حاضنة التنمية الطاير.

5. مجموعة من العمر المطابقة الكبار الذباب

  1. سوف البالغين eclose عادة من يوم 9 فصاعدا. تجاهل الذباب التي ظهرت في اليوم الأول والزجاجات المكان مرة أخرى في ليلة وضحاها الحاضنة. وهذه الممارسة غير مقصود لتجنب اختيار يميرغينتس المبكر وتسمح لجمع أكبر عدد ممكن من الذباب متزامنة.
  2. 16-22 ساعة في وقت لاحق، نقل الكبار يوما الذباب الباحثس الغذائية SY 10٪ الزجاجات. إذا لزم الأمر، يمكن جمعها دفعة أخرى في اليوم التالي.
  3. عودة يطير مرة أخرى في حاضنة والسماح الذباب لتصل إلى مرحلة النضج الجنسي وزميله لمدة يومين. تسجيل يوم لنقل زجاجات SY 10٪ كما في اليوم الأول من مرحلة البلوغ.

6. الذباب الفرز وإعداد التجربة طول العمر

  1. تخدير مجموعات صغيرة من الذباب على لوحة مخدر، ثم الذكور والإناث نوع إلى مجموعتين باستخدام الفرشاة. في حالة استخدام CO فمن الأهمية بمكان للحد من التعرض لتجنب احتمال القضايا الصحية طويلة الأمد التي يمكن أن تعرض للخطر سلامة التجربة طول العمر.
  2. الذباب الفترة من 30 من نفس الجنس في قارورة الفردية. افتراض عدم وجود الصبغيات موازن في عدد السكان وآله صحية، ينبغي لكل زجاجة تنتج نحو قارورة 3-4 من كل جنس. يجب Aliquoting الذباب في قارورة الفردية يستغرق الامر أكثر من دقيقة 3-4، بحيث، في المجموع، ويتعرض للتخدير فقط الذباب لمدة أقصاها9-10 دقيقة.
  3. كرر الخطوات من 6،1-6،2 حتى هناك قارورة 8-10 مكررات لكل نوع الجنس والعلاج التجريبي.

7. إنشاء جداول البيانات إكسل لتتبع التجربة طول العمر

  1. نوصي التعشءه موقف فيال بدلا من قوارير تجميع من حالة تجريبية من أجل تجنب التحيز المرتبطة الموقع فيال في الحاضنة وإخفاء هوية فيال لالمجرب. للقيام بذلك، أولا تعيين ID العشوائية العددية لكل قنينة في برنامج جدول بيانات، ثم ترتيب وقارورة في الصواني من حيث عدد ID. إذا كنت تستخدم إدارة البرامج dLife التجربة، اتبع البرنامج التعليمي على إعداد التجربة لتوليد رقم لكل قنينة.
  2. (اختياري) إذا كنت تستخدم قارئ RFID أو قارئ الباركود بالتعاون مع dLife، إرفاق RFID أو علامة الباركود على كل قنينة وربط البطاقة مع رقم القارورة والعددية في dLife. سيقوم البرنامج التعرف على بعضها فيال عندما تفحص مع قارئوتوجيه واحد لتسجيل البيانات في الموقع الصحيح في جدول بيانات. استخدام قارئ البطاقات بالتزامن مع dLife يخفف كثيرا من البيانات في الوقت الخطأ جمع وتسجيل.

8. الحفاظ على التجربة طول العمر

قارورة ينبغي أن تحتوي على المواد الغذائية الطازجة تكون على درجة حرارة الغرفة لكل عملية تحويل.

  1. خلال الفترة التجريبية، والذباب على نقل قوارير جديدة تحتوي على كل المواد الغذائية الطازجة 2 يوم (الشابات)، أو 3 مرات في الأسبوع (ذكور أو إناث> 3 أسابيع من العمر). وهذه الخطوة ضمان عدم تعطل البيئة التغذية للشابات من خلال وجود اليرقات. وينبغي استكمال هذا النقل بدون تخدير، والتي يمكن أن تحدث وفيات الحادة، وخاصة في كبار السن الذباب (Pletcher والملاحظات الشخصية).
  2. خلال كل فيال نقل وتسجيل عمر، عد الذباب الميت في القارورة القديمة، والذباب الميت التي تقوم على القارورة الجديدة. تسجيل هذه المعلومات بشكل منفصل فيعمودين في جدول بيانات (إما أو جدول dLife الخاصة بك). وسوف يضمن هذا الذباب التي لا تحصى نقرا مزدوجا. (قامت القتلى +) العدد الإجمالي للوفيات ينبغي على الأقل يساوي عدد الذباب نقلها من نقل السابقة. طرح عدد من الذباب التي سبق من العدد الإجمالي للوفيات لتحديد عدد وفيات جديدة.
  3. ويعتبر الطيران بزر الماوس الأيمن رقابة اذا تركت التجربة قبل الوفاة الطبيعية أو الوفاة من خلال الهروب من قبيل الصدفة. يجب إدخال الحيوانات الخروج من التجربة بهذه الطريقة في عمود منفصل في اليوم الذي الطاير خرجت من التجربة. لم يتم تسجيل الذباب رقابة في عداد الموتى (انظر أدناه).
  4. تواصل كرر الخطوات 8،1-8،2 حتى آخر الناجين ميت. كما أن ندرك أن عمر الذباب، الذباب بعض قد تقع على ظهورهم والموات التي تظهر الخمول بهم. ولذلك عندما قامت عد الذباب (ميت)، اضغط على الجانب من قوارير لتحديد ما إذا كانت هناك حركات الساق. إذا كان الأمر كذلك، تساه الذباب لا تزال على قيد الحياة. في الحالة حيث لا تزال عالقة الذباب إلى الطعام في القارورة القديمة ولكن على قيد الحياة، لا ينبغي أن تحسب في عداد الموتى، وينبغي إنقاذهم من خلال استغلال مزيد من القارورة لطرد الطاير. وينبغي أن تستخدم هذه الرقابة الذباب بحذر لأنها قد تؤدي إلى التحيز التجريبية.

9. تحليل البيانات

  1. منحنى البقاء على قيد الحياة احتمال أن يعرض الفرد على قيد الحياة إلى سن معينة، وعادة ما يتم حساب باستخدام نهج كابلان ماير (الشكل 1) 8. يتم تحديد في عدم وجود بيانات بزر الماوس الأيمن رقابة، يمكن تبسيط الصيغة بحيث البقاء على قيد الحياة لسن معينة في عمر x (S خ) عن طريق قسمة عدد الأفراد على قيد الحياة في بداية التعداد في وقت عمر x (N X) على العدد الكلي من الذباب في التجربة (N 0)؛ S = N X X / N 0. 9،2 منحنيات الوراثة) هي الشكل الأكثر شيوعا من عرض البيانات، وأنهاويمكن اختبار من أجل المساواة بين المجموعات باستخدام اختبار سجل رتبة. ويمكن استخلاص استنتاج معقول من عدد قليل من الأفراد 50-100 في الفوج. البقاء على قيد الحياة هو مقياس التراكمي، ومع ذلك، وبالتالي الوفيات التي ليست المتصلة بالشيخوخة، مثل تلك في وقت مبكر من الحياة، والبقاء على قيد الحياة سوف تخفض في مختلف مراحل العمر مما يجعل من الصعب التأكد من الآثار الخاصة الشيخوخة.
  2. A التصور البيانات الثاني طريقة هي وظيفة وفيات الفئة العمرية المحددة، والتي تعرض لخطر الموت خلال كل فترة العمر ويقدم وصفا أكثر دقة للبيانات البقاء على قيد الحياة 9،10. تدابير وفيات مستقلة من عصر إلى آخر، وشكل المنحنى وفيات مفيد لاستنتاج حول ديناميات الشيخوخة، وخاصة عندما يتم تعديل العلاجات في سن متقدمة. تقديرات الوفيات في الفئة العمرية المحددة، ومع ذلك، تفتقر كل من الدقة والدقة مع أحجام عينة صغيرة، وغالبا ما تتطلب عدة لكثير من الأفراد في مئات فوج لES موثوق بهاtimate 11.
  3. طرق أخرى لتقدير الاختلافات تشمل طول العمر حدودي (مثل جومبرتز) وشبه بارامترية النماذج (مثل كوكس الانحدار). يمكن لهذه النماذج أن تكون قوية ولكن ينبغي أن تطبق بحذر بسبب الافتراضات حول شكل منحنيات وفيات وطبيعة الآثار العلاج، مما قد يؤدي الى الاستنتاج غير صحيح 11،12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويرد مخطط مبسط للبروتوكول في الشكل 1، حيث ترد الخطوات الرئيسية. ويمكن استخدام الجزء تزامن بروتوكول للفحوصات التي تتطلب مختلف الذباب الكبار بالسن المتطابقة.

وتظهر منحنيات البقاء على قيد الحياة البرية نموذجية من نوع الذباب في الشكل 2A، وذلك باستخدام البرمجيات dLife إدارة تجربة (الشكل 2B، ج). الذكور البالغين تعيش عادة أقصر، مع كل من سكان تحقيق طول العمر يعني وسيطة من 50 يوما> على الغذاء SY 10٪ في C. ° 25 نلاحظ أن البقاء على قيد الحياة لا يزال مرتفعا في الجزء الأول من التجربة ومن ثم ينخفض ​​باطراد.

ويتأثر عمر ذبابة الفاكهة من الظروف البيئية، مثل درجة الحرارة والنظام الغذائي. 3A الشكل يدل على أن الذكور البالغين يعيشون عادة أقصر بشكل ملحوظ كما هو زيادة درجة الحرارة. وبالمثل، يتم تقديم تأثير النظام الغذائي على الشكل 3B في عمر

يمكن للكثافة الأفواج خلال التأثير التنمية الكبار وتغيير توقيت عمر التنموية. هنا نعرض مثالا على كيفية كثافة مختلفة من البيض متزامنة تؤثر نمو اليرقات. كما هو موضح في الشكل 4، البالغ العائد ذبابة سيئة وسطح الغذاء عرضة للجفاف عندما يكون عدد البيض منخفض جدا. على الطرف الآخر من الطيف، اليرقات التنمية المتخلفين في زجاجات مزدحمة، ويتم تقليل العائد من الذباب الكبار.

ويمكن أن يتأثر منحنى البقاء على قيد الحياة من الفوج ككل بشكل كبير من آثار قارورة الشاذة، كما هو موضح في الشكل 5. قد بيانات غير النظامية للبقاء قارورة الفردية لها أسباب عديدة، مثل نوعية الطعام رديئة أو جرثومية / فطرية تراكم والعدوى. بينما الوفيات الشاذة مثل جوتحرف التدبير البقاء على قيد الحياة السكان، وليس هناك مقياس بسيط لتحديد مناسب التي ينبغي استبعادها قارورة من التجربة. ولذلك فإن هذه الحالات من الأفضل تجنبها الممارسات حسن التعامل والتخفيف منها باستخدام حجم عينة كبير.

ويبين الشكل 6 أمثلة على الظروف التي يمكن أن تؤدي فيال في وفيات الشاذة. بشكل عام، يجب تجنب أي حالة يمكن أن تؤدي إلى الصدوع الصغيرة حيث قد تتعثر الذباب والموت. ومن الأمثلة على ذلك: تظهر فقاعات في جفاف والغذاء في الطعام الذي يؤدي إلى تقلص بعيدا عن الجدار قارورة، وتكسير في المواد الغذائية في الشكل 5A (مثال خفيفة مع فقاعة واحدة)، 5B الشكل، والشكل 5C، على التوالي . يجب أن المواد الغذائية الجافة بشكل مفرط، كما هو مبين في الشكل 5B 5C الشكل وتكون انقلبت بعناية خلال التحويلات، والمواد الغذائية وطرد يمكن أن تنهار على الذباب في نEW القارورة. يمكن نمو البكتيريا على سطح الطعام يؤدي إلى الإصابة أو فخ المادية، وبالتالي قد تزيد الوفيات. بعض أنواع البكتيريا على سطح الطعام تظهر شفافة وبراقة كما لو كان هناك عرق من الغذاء (لا يظهر)، في حين أنواع أخرى من البكتيريا سوف تظهر المستعمرات والأبيض (الشكل 5D). وتجدر الإشارة إلى قارورة اظهار أي من هذه الشروط ونظرت كذلك عندما يتم تفسير البيانات. يمكن بشكل عام، ونحن نؤكد أن الاهتمام الدقيق لتربية في مراحل اليرقات على حد سواء والكبار دعم طول العمر والصحة من الذباب الكبار والحد من وقوع مشاكل تؤدي إلى أسباب الوفاة الغامضة في الحياة في وقت لاحق.

الشكل 1
الشكل 1. التخطيطي المبسطة لفحص عمر ذبابة الفاكهة.

الشكل 2 (A) الممثل منحنيات عمر الإناث ث السيطرة 1118 (الدوائر) والذكور البالغين (المربعات) يطير في C ° 25 على الغذاء SY10٪. (B، C) لقطات الشاشة الممثل من البرنامج dLife.

الشكل 3
الشكل 3. آثار درجة الحرارة (A) والنظام الغذائي (B) على عمر الكبار. A. السيطرة الكبار (كانتون S) كان مسك الذباب الذكور خلال مرحلة البلوغ عند 18 ° C تعرضت، 25 ° C، 29 ° أو CB تحكم الكبار 1118) الذباب الإناث إلى SY إما 15٪ أو 5٪ SY النظام الغذائي.

الشكل 4
الشكل 4. يوم 9 من التنمية (في 25 ° C) من البيض متزامنة، aliquoted في زجاجات الطعام CT. Vوكما هو مبين olume من قسامة المحتوية على الجنين تحت كل زجاجة.

الشكل 5
الشكل 5. مؤامرة الممثل من برنامج البقاء على قيد الحياة من قبل dLife تظهر قارورة. السهم يشير إلى قنينة واحدة الشاذة ضمن مجموعة.

الشكل 6
الشكل 6. أمثلة على نوعية الغذاء دون المستوى الأمثل. A. فقاعات على سطح المواد الغذائية. B. الغذاء تقلصت بعيدا عن حافة القارورة. C. الشقوق في المواد الغذائية. البكتيريا D. تراكم على سطح الطعام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

بروتوكول المعروضة هنا يصف طريقة لإنتاج قياسات متكررة طول العمر الكبار في ذبابة الفاكهة التي هي قابلة للتكيف لتقييم التدخلات والجينية الدوائية، والبيئية. الجوانب الحاسمة للبروتوكول تتضمن التحكم بعناية في بيئة نمو اليرقات، والتقليل من الإجهاد الكبار، والتقليل من التحيز عبر المجموعات التجريبية والضابطة. نقدم أيضا استخدام برنامج إدارة عمر dLife التجربة. عن طريق ربط ببساطة رمز شريطي أو علامة RFID على كل قنينة، سيقوم البرنامج dLife مساعدة في الحصول على البيانات لكل قياس ورسم منحنى في البقاء على قيد الحياة. في حين أنه من الأنسب حاليا لدراسات الطيران باستخدام قارورة عمر، يمكن تجربة هذه الأداة الإدارية تكييفها بسهولة للاستخدام في الكائنات الحية الأخرى، مع أنواع مختلفة من الغرف السكان، أو لاتخاذ تدابير إضافية من البقاء على قيد الحياة، بما في ذلك مقاومة الإجهاد وسمية الدواء.

Prior لبدء أي تقييم طول العمر، يجب التحكم بعناية الأول إنتاج مخزونات الوالدين. التباين الوراثي هو عامل مهم، كما هو صحة سلالات الوالدين. وقد أدت هذه العوامل إلى الجدل العام كبرى ترتبط الدراسات المبكرة التي أبلغت المنظمين طول العمر المفترض 13. الباحث لديه عدة خيارات لتقليل الآثار المنسوبة إلى التغير في خلفية الوراثية. لتلاعب الجيني، ينبغي لجميع سلالات معدلة وراثيا أن تكون الخلفية من خلال التحكم إما backcrossing لسلالة تحكم (على الأقل 6 مرات) أو باستخدام أنظمة محرض (مثل درجة الحرارة الأليلات، حساسة أو المخدرات محرض التعبير التحوير). وGeneSwitch وتيت على أنظمة 14،15 شعبية وتسمح بالمقارنة المباشرة من الذباب مع الخلفية الجينية نفسها التي يسببها إما التحوير أو لا يسببها. لجميع أنظمة محرض، يطلب من الضوابط المناسبة لتجنب معاصرة confouNDS المرتبطة محفز. الفشل في السيطرة على الخلفية الوراثية دائما تقريبا النتائج في قوة الهجين، التي يمكن أن تمتد عمر في الجيل F1 من تقاطع بين اثنين من سلالات مختلفة لأسباب لا علاقة لها التلاعب المقصود 13. هذا العامل يثير القلق بصفة خاصة عند استخدام نظام GAL4-UAS. للتدخلات البيئية (على سبيل المثال، العلاج من تعاطي المخدرات، والنظام الغذائي، ودرجة الحرارة، وما إلى ذلك)، فإنه من المستحسن لدراسة الآثار المترتبة على التدخل على أكثر من سلالة واحدة. وأخيرا، يمكن كل 16 عمر الوالدين والتوتر تؤثر على طول العمر 17 من الجيل F1، ولهذا السبب، ينبغي اختيار الشباب الأصحاء لإنتاج البيض.

جوانب هامة من السيطرة على البيئة اليرقات / العذراء تشمل منع الازدحام والحفاظ على بيئة تسيطر عليها مع تنظيم صارم من ضوء الظلام فترات والرطوبة ودرجة الحرارة. وهذه العوامل تؤثر على كل من توقيت ديفelopment ونوعية المادي للأشخاص الناتجة عن ذلك. بيئات اليرقات الضارة، مثل كثافة اليرقات عالية، قد تؤدي إلى تفعيل عوامل الإجهاد محرض (على سبيل المثال، التعبير الحرارة البروتين صدمة) التي هي معروفة للتأثير على طول العمر الكبار 18.

خلال مرحلة الكبار، عناية فائقة للبيئة لا يزال ضروريا. يمكن اختيار النظام الغذائي وحده تؤثر بشكل كبير وعمر يمكن أن تتفاعل مع العوامل الوراثية لإنتاج الغذاء خاصة الآثار على طول العمر. وعلاوة على ذلك، يمكن لبعض المواد الغذائية الأساسية المشتركة البدائل (خلاصة الخميرة بدلا من خميرة البيرة كله مجفف بالتجميد في) بشكل كبير تقصير عمر 19، وترك الباب مفتوحا أمام إمكانية أن الطعام نفسه هو الذي يسبب الإجهاد العضوي قد تضر تقييم طول العمر. في هذه المقالة، ونحن قد أبرزت المصادر المحتملة للإجهاد في البيئة الغذائية بما في ذلك الشذوذ البدني في الأطعمة (مثل فقاعات، رغوة، والشقوق، والبكتيريا، وما إلى ذلك) التي يمكن أن عاصطاد hysically الحيوانات. يمكن استبدال العادية من المواد الغذائية القديم مع الأغذية الطازجة (ثلاث مرات على الأقل كل أسبوع) التغلب على الكثير من هذه الصعوبات. وعلاوة على ذلك، يمكن أن درجة حرارة 20، الرطوبة (الملاحظات الشخصية)، والإضاءة 21، ووجود conspecifics (البيئة الاجتماعية) 22 تعدل كل عمر، والانتباه إلى السيطرة على هذه العوامل في إطار التجربة المهم تجنب التحيز في النتائج. في حين أن عدد من الذباب داخل قارورة يتناقص مع الوقت، وجدنا أن استخدام التخدير لضبط عدد من الذباب يمكن أن تزيد من معدل وفيات بطريقة تعتمد على عمر (Pletcher والملاحظات الشخصية)، ونحن لا أوصى هذا الإجراء. الموقف الدقيق للقارورة في حاضنة هو أيضا عامل، حتى في بيئة تسيطر على ما يبدو. يمكن التوزيع المادي العشوائية من المجموعات التجريبية مع الضوابط تخفيف التحيز المرتبطة بوضعية القارورة ومطلوب من أجل الاستدلال الإحصائي السليم. حتى معظروف محكومة بعناية، يمكن ملاحظة اختلافات طفيفة بين التجارب واستخدام عناصر التحكم داخل التجربة أمر ضروري.

وقد اقترحت نهج بديلة لتحليل التغذية بما في ذلك اتباع نهج عمر المغذية الشعرية (طريقة CAFE) 23. هذه الطريقة تتفوق في القدرة على توفير قياسات دقيقة من استهلاك الطعام، ولكنه يؤدي في الذباب لم يدم طويلا بشكل ملحوظ 24. يجب النظر الضغوط المحتملة المرتبطة بالبيئة التغذية عند تقييم العلاقة المشتركة بين النظام الغذائي والعوامل الوراثية في طول العمر عموما.

تحليل الديموغرافي، بما في ذلك حساب البقاء على قيد الحياة والمنحنيات يمكن أن تكشف عن وفيات الكثير من المعلومات عن ديناميات السكان المتقدمين في السن. سوف البقاء على قيد الحياة منحنى نموذجي يظل ثابتا نسبيا لفترة طويلة في وقت مبكر من الحياة وزيادة معدل الانخفاض في الأعمار المتقدمة، والتي تتطابق مع مدة و وفيات منخفضةollowed من فترة زيادة هائلة في معدل الوفيات. وهناك عادة مرهقة البيئة واضح وجود فائض من الوفيات المبكرة في عدد السكان وتراجع الشاذة في منحنى البقاء على قيد الحياة. بينما مثل هذه النتيجة قد تشير إلى اختلافات كبيرة بين المعالجات، وانها لن تكون عادة قوية لتكرارها. ولذلك نوصي يتم تنفيذها اثنين على الأقل (أي غير معاصرة) تكرار التجارب مستقلة يتم رسمها قبل أي استنتاج الشركة. قد يكون هذا الجهد إضافية نحو زيادة حجم العينة، والسيطرة على ظروف تربية، وتحسين مطلوب صحة الأسهم الوالدين.

ينبغي بزر الماوس الأيمن الرقابة تطبيقها (إزالة الحيوانات من التجربة أن الهروب أو اعتبروا في عداد القتلى من أسباب عارضة) من الحيوانات التي تموت من الظروف البيئية المجهدة بحذر شديد. بالمعنى الدقيق للكلمة، يجب فرض رقابة تحدث عشوائيا عبر علاجات تجريبية، وإذا كان interventi التجريبيةعلى حساسية الضغط ينظم، يمكن للمرء أن يطبق دون قصد العلاج على مستوى التحديد إلى السكان. وكقاعدة عامة، وتجنب وجود العوامل التي يمكن أن تنتج الوفاة المبكرة غامضة (المرتبطة أساسا مصدر الغذاء) هو أفضل من الرقابة، ويجب فقط فرض الرقابة على تطبيقها على الكائنات الحية التي لوحظت في الموت أو الهرب أثناء التداول الفعلي.

وهناك اعتبار أخير هو تقييم ذات دلالة إحصائية. بينما أحجام العينات كبيرة الفوج توفير الطاقة للإعجاب للتمييز الفروق الصغيرة بين المعالجات، يجب أيضا على أهمية البيولوجية المحتملة من مثل هذه الفرق أخذها بعين الاعتبار. مع التجارب طول العمر معقول الحجم، والاختلافات منخفضة تصل إلى 1-2٪ وغالبا ما تكون ذات دلالة إحصائية عالية، ولكن التأثير العام للتدخل في الحالة الصحية قد تكون طفيفة. ولذلك، يجب النظر على حد سواء دلالة إحصائية والبيولوجية عند تفسير النتائج الإجمالية لهذه التجربة. Infeيمكن زيادة rence عن عملية الشيخوخة من التجارب البقاء على قيد الحياة عن طريق اتخاذ تدابير من العمر ذات الصلة انخفاض في تدابير الصحة السلوكية أو الفسيولوجية، بما في ذلك القدرة تسلق الجدار المعوي 25 و السلامة 7.

وباختصار، فإن النموذج الحي ذبابة الفاكهة خيارا جذابا لدراسة آليات الشيخوخة. مع تقنية تجريبية حذرا، يمكن أن التحليل الديموغرافي القوي توفير نظرة ثاقبة على تأثير العوامل الوراثية على الدوائية وعملية الشيخوخة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من خلال تمويل من مؤسسة إليسون الطبية (SDP، http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp )، NIH K01AG031917 (NJL، http://www.nih.gov/ )، NIH-35 5T32GM007315 (JR) وNIH R01AG030593 (SDP). استخدام هذا العمل لموارد الأساسية الشيخوخة ذبابة الفاكهة (DAC) من مركز صدمة ناثان التميز في البيولوجيا الشيخوخة الممولة من قبل المعهد الوطني للشيخوخة P30-AG-013283 ( http://www.nih.gov/ ). فإن الكتاب أود أن أشكر مختبر لإجراء مناقشات مفيدة Pletcher وتشونغ خاصة بريان لقراءة نقدية للمخطوطة. نود أن نعترف نيك آشر وBorowicz كاثرين لمساعدتها في جمع البيانات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active Dry Yeast Fleishmann’s Yeast 2192
Grape Agar Powder Premix Genesee Scientific 47-102
Large Embryo Collection Cages Genesee Scientific 59-101
Large Replacement End Caps Genesee Scientific 59-103
6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene Genesee Scientific 32-130
Flugs Closures for Stock Bottles Genesee Scientific 49-100
Drosophila Vials, Wide, Polystrene Genesee Scientific 32-117
Flugs Closures for Wide Vials Genesee Scientific 49-101
Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul Denville Scientific P1105-CP
Flystuff Flypad, Standard Size Genesee Scientific 59-114
BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; Fisher Scientific 08-757-12
Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow Fisher Scientific 10-200-47
PBS pH 7.4 10x Invitrogen 70011044
Gelidium Agar Mooragar n/a
Brewer's Yeast MP Biomedicals 0290331280
Granulated Sugar Kroger n/a
Tegosept Genesee Scientific 20-266 Fly Food Preservative
Propionic Acid, 99% Acros Organics 149300025 Fly Food Preservative
Kanamycin Sulfate ISC BioExpress 0408-10G
Tetracycline HCl VWR 80058-724

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toivonen, J. M., et al. No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects. PLoS Genet. 3, e95 (2007).
  2. Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. Testing an 'aging gene' in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background. Aging Cell. 2, 123-130 (2003).
  3. Burnett, C., et al. Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila. Nature. 477, 482-485 (2011).
  4. Bokov, A. F., et al. Does reduced IGF-1R signaling in Igf1r+/- mice alter aging? PLoS One. 6, e26891 (2011).
  5. Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosophila Information Service. 34, 117-118 (1960).
  6. Skorupa, D. A., Dervisefendic, A., Zwiener, J., Pletcher, S. D. Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster. Aging Cell. 7, 478-490 (2008).
  7. Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metab. 14, 623-634 (2011).
  8. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 53, 457-481 (1958).
  9. Pletcher, S. D. Mitigating the Tithonus Error: Genetic Analysis of Mortality Phenotypes. Sci. Aging Knowl. Environ. 2002, pe14 (2002).
  10. Pletcher, S. D., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Why do life spans differ? Partitioning mean longevity differences in terms of age-specific mortality parameters. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 381-389 (2000).
  11. Promislow,, Tatar,, Pletcher,, Carey, Below-threshold mortality: implications for studies in evolution, ecology and demography. Journal of Evolutionary Biology. 12, 314-328 (1999).
  12. Pletcher, Model fitting and hypothesis testing for age-specific mortality data. Journal of Evolutionary Biology. 12, 430-439 (1999).
  13. Partridge, L., Gems, D. Benchmarks for ageing studies. Nature. 450, 165-167 (2007).
  14. Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 12602-12607 (2001).
  15. Ford, D., et al. Alteration of Drosophila life span using conditional, tissue-specific expression of transgenes triggered by doxycyline or RU486/Mifepristone. Exp. Gerontol. 42, 483-497 (2007).
  16. Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, 927-935 (2002).
  17. Smith, E. M., et al. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J. Nutr. 137, 2006-2012 (2007).
  18. Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. J. Insect Physiol. 47, 1301-1307 (2001).
  19. Bass, T. M., et al. Optimization of dietary restriction protocols in Drosophila. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1071-1081 (2007).
  20. Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1976).
  21. Pittendrigh, C. S., Minis, D. H. Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1537-1539 (1972).
  22. Joshi, A., Mueller, L. D. Adult crowding effects on longevity in Drosophila melanogaster: Increase in age-dependent mortality. Current Science. 72, 255-260 (1997).
  23. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 8253-8256 (2007).
  24. Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2498-2503 (2008).
  25. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
قياس عمر في<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (71), e50068, doi:10.3791/50068 (2013).More

Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (71), e50068, doi:10.3791/50068 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter