Summary
黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）是一个功能强大的模式生物，探索长寿调控的分子基础。该协议将讨论生成一个以人群为基础的重现性好，测量的长寿以及潜在的缺陷和如何避免它们所涉及的步骤。
Abstract
老龄化是一个现象，就是在稳定的生理恶化，几乎所有的生物体中，它已审查的结果，减少物理性能和疾病的风险增加。个人老龄化是明显的年龄相关的死亡率增加，这往往是在实验室中测量的观测寿命在大样本的年龄相匹配的个人在群体水平上。实验，寻求量化的程度，遗传或环境的操作影响在简单的模型生物的寿命已经非常成功的理解方面的老化，延长寿命，预防与年龄有关的疾病在哺乳动物中是保守的类群和鼓舞人心的新战略。
飞醋， 黑腹果蝇（Drosophila melanogaster），是一个有吸引力老化的机制，由于其寿命相对较短，畜牧业方便，轻便遗传学研究的模式生物。然而，人口老龄化的措施，包括年龄特异性生存率和死亡率，即使是轻微的实验设计及环境的变化是非常敏感的，需要维护的持续时间老化实验，严格的实验室操作规范。这些考虑，一起实践需要仔细控制的遗传背景，用于产生强大的测量是必要的。事实上，有许多著名的推论寿命实验，酵母，蠕虫，果蝇和小鼠已追踪到环境或遗传的文物1-4的争议。在这个协议中，我们描述了一系列的程序进行了优化，经过多年的测量长寿果蝇的实验室瓶。我们还描述了使用的dLife软件，这是由本实验室开发的，并且是可用于下载（ http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab /软件）。 dLife，加速吞吐量和促进良好做法，通过整合优化的实验设计，简化飞处理和数据采集，规范数据分析。我们还将讨论很多潜在的隐患在设计，收集和解释的寿命数据，我们提供的步骤，以避免这些危险。
Protocol
我们建议存储实验食品，酵母膏，和葡萄的琼脂平皿上，出现在协议中，在4℃下，在1-2个月内，并使用它们，只要模具和干燥设置不英寸的标准环境条件下的幼虫和成虫阶段涉及维护一个12:12的人力资源光线暗的周期和60％的相对湿度在25°C的苍蝇孵化器。
1。制备实验性食品的
- 幼虫的生长，我们使用修改后的加州理工学院，这是简称为CT在本协议中的中等5。
- 我们建议成年果蝇 （SY），包括糖（蔗糖）和酵母（冻干整体啤酒商的酵母）在2％的琼脂基，即已经被煮沸，辅以抗生素和抗真菌剂的饮食，和分布（10毫升每瓶）6。食物应巩固和蒸发12-24小时之前存储。因为营养盐的环境substantially影响寿命，在烹饪过程中的一致性是至关重要的，在实验和实验之间的比较。
- 如果是要添加到成人的食物的药理活性剂，这种药物可以被混合成一小批粮食和分层（2毫升）在食品表面上，与接收含有车辆单独的层的控制小瓶。
2。一个活酵母膏的制备
结合5-6毫升的水，活性干酵母3克，拌匀。的一致性，酵母膏应该是一个光滑的花生酱。
3。的一个葡萄琼脂平板的制备
- 添加一个葡萄琼脂预混料的一包500毫升的蒸馏水在1000毫升容量瓶中，并按照包装上的说明，解散葡萄琼脂混合。
- 小心地倒了一层厚厚的混合物为100毫米的培养皿中，同时避免了泡沫的形成。预混料生产一包约14 GRA聚乙烯琼脂平板上。
- 让媒体冷却，并在室温下固化15分钟的盖子。板材可保持在4°C，包上保鲜膜，或立即使用。
4。收集同步蛋
在该协议中，使用的所有媒体即酵母，葡萄琼脂平皿上，CT和10％SY食品上，应该是在室温下。
- 铺2-3厘米直径在葡萄琼脂平板上的酵母膏层，并预留。
- 在CO 2焊垫的网格面朝下麻醉苍蝇，放置一个大鸡蛋收集笼。氮麻醉是CO 2的替代品，一些实验室使用，可以生产高品质的成果。
- 用漏斗，转让150-200对苍蝇的蛋收集笼。
- 将葡萄的琼脂平板上，以覆盖开口端的保持架和固定用的端部帽。
- 莱在其一侧的笼子里，，直到苍蝇醒来。然后，保持笼子里，葡萄琼脂平板上侧下，在孵化器中过夜。
- 第二天，交换葡萄板一个新yeasted的葡萄板。只放直径大约1厘米的酵母膏的板的表面上。丢弃的第一天葡萄板。
- 允许胚胎收集表面上的葡萄琼脂平板上16-22小时。一旦完成，收集的葡萄琼脂平板和丢弃父苍蝇。
- 葡萄琼脂平板的表面洗净用1x磷酸盐缓冲液（PBS）。鸡蛋可以用棉签轻轻刮动员。请小心不要划伤，损坏，或刮薄件琼脂，从表面板。与援助的漏斗，倒入到一个15毫升锥形管的洗涤过的蛋。
- 让鸡蛋定居管的底部，倒出上清，小心不要失去任何鸡蛋。剩余容量应约2-3毫升。
- 8-10毫升的PBS加入到试管中，并重复上述步骤2-3铁道部e时代的彻底清洗鸡蛋，直至上清液是明确的。摆脱残余酵母是在这一步的关键。
- 洗净后，沥干一切的上清液，直到剩余量为2毫升。分装到CT瓶使用大口径的移液器吸头32μl的鸡蛋。鸡蛋在吸头应紧凑，几乎没有液体吸气。这可以通过以下来实现插入移液管尖，深入到蛋沉降，并迅速释放柱塞吸。
- 广场种子，CT瓶在整个飞发展的孵化器。
5。收集的年龄相匹配的成人苍蝇
- 成人通常会从第9天开始E关闭。丢弃的第一天，地方瓶上的苍蝇出现在培养箱中培养过夜。这种做法将避免因疏忽而选择为早期emergents和允许的最大数量的同步苍蝇的集合。
- 16-22小时后，转让日龄的成蝇INTO 10％SY食品瓶。如果需要的话，可以收集一批又一批的第二天。
- 返回飞回孵化器，让苍蝇达到性成熟，交配，为期两天。记录转移到10％SY瓶作为成年的第一天的天。
6。排序苍蝇和长寿实验
- 麻醉麻醉垫的苍蝇，小团体的男性和女性进行排序，分成两组，用画笔。如果使用的是CO 2，这是至关重要的风险降至最低，以防止可能出现的持久的健康问题，可以妥协的完整的长寿实验。
- 将30苍蝇同性别的成单独的小瓶中。假设不均衡的人口和健康的后代的染色体，每一瓶应产生约3-4瓶了，每次性爱。成单独的小瓶等分苍蝇应该不超过3-4分钟，因此，在总，苍蝇只露出一个最大的麻醉9-10分钟。
- 重复步骤6.1-6.2，直到有8-10瓶重复，每个性别和实验性治疗。
7。设置Excel电子表格来跟踪长寿实验
- 我们建议使用随机化的实验条件下，为了避免与药瓶在孵化器中的位置的偏置，并掩盖样品瓶同一性实验者样品瓶位置，而不是分组小瓶。要做到这一点，首先分配一个随机的数字ID，每个瓶在电子表格程序，然后安排在托盘ID号瓶。如果您使用的dLife的实验管理软件，按照教程上的实验装置产生的ID号每小瓶。
- （可选）如果您使用的是与dLife的RFID读取器或条形码阅读器，RFID或条形码标签附加到每个小瓶和关联的标签的小瓶中的数字ID在dLife。该程序会识别扫描时，每小瓶与读者和引导记录在电子表格中的数据在正确的位置。结合dLife一个标签阅读器的使用，大大减少了数据收集时间和记录错误。
8。保持长寿实验
的小瓶含有新鲜食品应该是在室温下为每个传输。
- 在实验期间，转移到新的小瓶苍蝇含有新鲜的食物，每2天（年轻女性），或每周3次（男性或女性，年龄> 3周）。此步骤将确保年轻女性的饲养环境，不破坏幼虫的存在。应完成转让无需麻醉，可诱发急性死亡，尤其是在旧的苍蝇（普莱彻，个人意见）。
- 每小瓶传输，记录年龄，老瓶算死苍蝇，死苍蝇进行新瓶。记录此信息，分别在在电子表格中的两列（无论是dLife的或自己的电子表格）。这将确保进行苍蝇不重复计算。总的死亡人数（死亡+进行）应至少等于进行苍蝇的数量从以前的传输。减去先前进行的苍蝇从总死亡人数的多少来决定的新的死亡病例。
- 一只苍蝇被认为是正确的审查，如果离开实验之前通过逃生自然死亡或意外死亡的。在这样的实验动物退出应订立一个单独的列在当天的飞行退出实验。删失苍蝇不会被记录为死亡（见下文）。
- 继续重复步骤8.1-8.2，直到最后的幸存者死了。要知道，一些苍蝇，苍蝇年龄可能在于在他们的后面，出现死因为他们不积极。因此，当计数进行（死）的苍蝇，点击上侧的小瓶，以确定是否有腿的动作。如果是这样，THESË苍蝇还活着。在苍蝇的情况下，仍然坚持的老瓶，但活着的食物，他们不应该被算作死亡，应进一步挖掘的小瓶撞出飞救出。如苍蝇审查应谨慎使用，因为它可能会导致实验偏差。
9。数据分析
- 存活曲线显示一个人生存的概率，一个给定的年龄，通常计算用Kaplan-Meier法（ 图1）。在右删失数据的情况下，该公式可以简化这个年龄特有的生存年龄为x（S x）的数除以个人活着，在开始的人口普查时间的年龄为x（N×）在实验中的苍蝇的总数（N 0），S =的 N×/ N 0。 9.2）的存活曲线的数据呈现的最常见的形式，并且它们可以测试使用log-rank检验群体之间的平等。合理的推论，可以得出从50-100个人的队列中。存活是一个累积性的措施，但是，并因此死亡，不老化相关的，如那些在生命的早期，会抑制生存的整个生命周期难以确定的影响，具体的老化。
- 第二个数据可视化方法是特定年龄的死亡率功能，它会显示每个年龄区间，并提出了更细致入微的描述生存数据9,10死亡的风险。死亡率措施是独立从一个到另一个年龄，和死亡率曲线的形状推理有关的动态老化是有用的，特别是当治疗成年生活期间调整。特定年龄死亡率的估计，但是，缺乏小样本尺寸精度和准确度，而且往往需要数个到数百个的每个队列一个可靠的ES志盈11。
- 估计寿命差异的其他方法，包括参数（ 例如贡佩尔茨）和半参数（ 如 Cox回归）模型。这些模型可以是强大的，但应谨慎，因为假设的死亡率曲线的形状和性质的治疗效果，这可能会导致不正确的推论11,12。
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Representative Results
在图1中，列出关键步骤的简化方案的协议。同步协议的一部分，可用于各种检测，要求年龄匹配的成年家蝇。
野生型苍蝇的在图2a中所示的典型的存活曲线，使用dLife实验管理软件（ 图2b，三 ）。成年男性通常居住的时间较短，与这两个群体实现对10％SY食品的寿命> 50天的均值和中位数在25°C需要注意的是生存在早期的实验的一部分仍然很高，然后下降成倍。
果蝇寿命影响的环境条件，如温度和饮食， 图3a示出，成年男性通常生活显着较短的，随着温度升高。同样地，在图3b饮食对寿命的影响，提出
同伙在开发过程中的密度可以影响成人的寿命和，改变发育时间。在这里，我们将展示如何同步鸡蛋的不同密度的影响幼虫发育的一个例子。正如在图4中示出，成人飞收率差，和在食品表面易受干燥鸡蛋的数量太低时。在光谱的另一端，幼体发育迟缓在过度拥挤瓶，成蝇的产量减少。
队列作为一个整体的存活曲线可以由反常的小瓶效果显着的影响，如在图5中示出。为单个瓶的不规则的生存数据可能有多种原因，如食品质量差或细菌/霉菌的积累和感染。虽然这样的异常死亡Ç歪斜存活率的人口措施，没有适当地确定小瓶中应排除从实验的一个简单的度量。因此，最好避免这些情况是良好的处理方法，采用大样本量减轻。
图6示出了实施例的小瓶的条件下，可以导致异常死亡。在一般情况下，任何情况下，可导致小裂隙可能会卡住苍蝇和死亡是可以避免的。实施例包括：分别示于图5a（与一个单一的泡沫温和的例子）， 图5b和图5c，在食品，干燥食品，导致收缩离开从样品瓶壁，和在食品开裂气泡。过分干燥的食品，如在图5b和图5c中示出，应小心翻转，在转移过程中，食物可以去除在n到的苍蝇和折叠EW瓶。的表面上的细菌生长的食物可导致感染或物理包封，从而可能会增加死亡率。某些细菌的表面上的食物出现透明和有光泽的，好像有汗渍从食物（未示出），而其他种类的细菌将表现为白色菌落（ 图5d）。样品瓶，表现出任何这些条件应该指出，并进一步考虑当数据被解释。在一般情况下，我们强调的是，仔细注意畜牧业的幼虫和成虫阶段，可以支持成虫的寿命和健康状况，并减少发生问题，导致不明确的死亡原因，在以后的生活中。
图1 果蝇寿命试验的简化原理图。
图2（A）代表的 W 1118控制女性（圆圈）和男性（正方形）成人苍蝇的寿命曲线在25°C在SY10％食品。 （B，C）代表的dLife软件的屏幕截图。
图3。温度的影响（A）和（B）成虫寿命的饮食。 A.成人控制（广S）成年雄性果蝇都维持在18°C，25°C或29°CB成人控制（W 1118）雌性果蝇暴露为15％的SY或5％SY饮食。
的发展的图4，第9天（在25℃）为同步的鸡蛋，在CT食品瓶等分。 V每个瓶子下方所示的取胚胎含音量。
图5。代表从dLife软件生存的小瓶图。箭头表示一个单一的异常在一组之内的样品瓶。
图6。不理想的食品质量。 A.泡沫，对食品表面。 B.食物缩水远离边缘的小瓶。 C.裂缝的食物。 D.细菌的食品的表面上的积累。
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Discussion
这里提出的协议描述了一种方法，在果蝇成虫寿命产生可重复的测量，是适应评估遗传，药理，和环境干预。该协议的关键方面包括仔细控制幼虫发育环境，最大限度地减少成人的压力，并尽量减少在实验组和对照组的偏见。我们还提出了使用的dLife寿命实验管理软件。通过简单的连接条形码或RFID标签，每个小瓶中，dLife计划将有助于为每个测量数据采集和绘制存活曲线。虽然它是目前最适合研究飞寿命使用小瓶，这个实验的管理工具可以很容易地适应，在其他生物体中使用，与不同类型的人口室，或者需要额外的生存的措施，包括应激性和药物的毒性。
Prior在开始任何长寿的评估，必须先小心地控制生产父母的股票。遗传变异性是一个重要的因素，是健康的亲本菌株。这些因素都导致相当大的争议与早期的研究报告公认的长寿监管机构13。研究人员有几个选项，以减少变异遗传背景的影响。基因操作，所有改变基因的菌株应该是后台控制，或者通过回交对照菌株（至少6次），或使用诱导系统（ 如温度敏感基因或药物诱导的基因表达）。 GeneSwitch和Tet系统上14,15很受欢迎，可以直接比较的苍蝇具有相同遗传背景的转基因诱发或诱导。对于所有诱导系统，需要适当的同期控制，以避免confouNDS与导流。未控制的遗传背景几乎总是在杂种优势，它可以延长寿命，在F1代的两个不同的原因无关的操作13株之间的交叉。此因素是使用GAL4-UAS系统时特别关注。对于环境的干预（ 例如 ，药物治疗，饮食，温度等），它是最好的影响进行研究的干预对不止一个应变。最后，父母的年龄16和压力17，可以影响寿命的F1代，因为这个原因，应选择健康的青壮年，蛋生产。
控制幼虫/蛹环境的重要方面，包括防止过度拥挤和维护的黑暗时期，湿度和温度受控制的环境与严格的监管。这些因素都将影响的开发时间elopment和身体素质所产生的成年人。不良的幼虫的环境中，，如幼虫密度高，可能会导致激活的应力诱导因子（ 如热休克蛋白的表达）是众所周知的影响成虫寿命18。
在成人阶段，仔细注意环境仍然非常重要。单靠饮食的选择可以极大地影响寿命，并可以与遗传因素，饮食对长寿的影响。此外，一些常见的食物的基地替代品（酵母抽提物，而不是冷冻干燥啤酒酵母）可以显着缩短寿命19日 ，离开开放的可能性，食品本身造成的有机体的压力，可能会损害评估长寿。在这篇文章中，我们已经强调了潜在的压力来源中的饮食环境，包括物理异常的食物（ 例如 ，泡沫，泡沫，裂缝，细菌等），可以Physically截留动物。定期更换旧的食品与新鲜食品（每星期至少三次），可以克服这些困难。此外，照明21，温度20℃，湿度（个人的观察）的存在下，同种（社会环境）22都可以调节的寿命，并注意控制这些因素，在实验结果中，重要的是要避免偏见。一小瓶中的苍蝇数量虽然随着时间的推移而降低，我们发现，使用麻醉调整苍蝇的数量可以增加死亡率的年龄依赖性（普莱彻，个人意见），我们不建议此过程。孵化器的小瓶中的精确位置也是一个因素，即使是在一个看似控制的环境中。随机物理实验组与对照组的分布可以减轻偏见与瓶放置，并须适当的统计推断。即使有精心控制的条件下，可以细微的差异之间观察到实验和实验内的控制的使用是必不可少的。
替代喂养方法已经被提出了生命周期分析，包括毛细管进纸器的方法（CAFE法）23。这种方法擅长于提供精确的测量食品消费的能力，但它会导致显着短命的苍蝇24。评估合并后的饮食和遗传因素之间的关系，整体寿命时，必须考虑潜在的饲养环境应力。
人口分析，包括生存和死亡曲线可以揭示很多信息，人口老龄化的动态的计算。一个典型的存活曲线将保持相对平稳，在生命的早期相当长的一段，并增加其在年龄较大的下降速度，这相当于在一段时期内的死亡率低followed通过一段时间的死亡率呈指数增长。充满压力的环境一般表现为在人口和存活曲线的异常浸在过量的早期死亡。虽然这样的结果可能表明治疗的显着的差异，它通常不鲁棒复制。因此，我们建议至少有两个独立的（ 即 ，非同期）复制的实验被执行之前得出任何明确的结论。这可能是额外的努力来增加样本量，控制饲养条件，提高健康需要父母的股票。
右键审查（去除逃生的实验，或偶然的原因被认为已经死亡的动物）的动物死于压力的环境条件应非常谨慎。从严格意义上讲，审查必须是随机发生的整个试验性治疗，如果实验interventi调制的应力敏感性，无意中适用于治疗水平的人口选择。作为一般规则，避免存在的因素，可能会产生模糊的早期死亡（主要的食物来源）比审查，并审查应只适用于被观察到的生物，物理处理过程中死亡或逃跑。
最后要考虑的是评估的统计学意义。大型队列研究的样本量提供令人印象深刻的功率来区分之间的微小差别的治疗，潜在的，还必须考虑到这种差异的生物学意义。合理规模的寿命实验，低至1-2％的差异往往是高度统计学意义，但干预对健康状况的整体影响可能是次要的。因此，统计和生物学意义解释时，必须考虑整体实验结果。 Infe何正兵从生存实验的老化过程，可以增加与年龄有关的下降行为或生理卫生措施，包括爬坡能力25和胃肠壁的完整性7的措施。
总之， 果蝇模式生物研究老化的机制的一个有吸引力的选择。通过仔细的实验技术，可以提供强大的人口分析洞察药理和遗传因素对衰老进程的影响。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持的资金从埃利森医学基金会（SDP， http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ），美国国立卫生研究院K01AG031917（NJL http://www.nih.gov/ ），美国国立卫生研究院5T32GM007315-35 （JR）和NIH R01AG030593（SDP）。这项工作利用的资源对果蝇衰老的核心弥敦道冲击卓越中心（DAC）的生物学老化的老化P30-AG-013283（ http://www.nih.gov/ ）由国家资助。作者想感谢的的普莱彻实验室为有益的讨论，特别是布赖恩涌的批判性阅读的手稿。我们要感谢尼克·阿谢尔和凯瑟琳Borowicz与数据采集的援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Fleishmann’s Yeast | 2192 | |
| Grape Agar Powder Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Large Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Large Replacement End Caps | Genesee Scientific | 59-103 | |
| 6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Flugs Closures for Stock Bottles | Genesee Scientific | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide, Polystrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Flugs Closures for Wide Vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul | Denville Scientific | P1105-CP | |
| Flystuff Flypad, Standard Size | Genesee Scientific | 59-114 | |
| BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow | Fisher Scientific | 10-200-47 | |
| PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 | |
| Gelidium Agar | Mooragar | n/a | |
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals | 0290331280 | |
| Granulated Sugar | Kroger | n/a | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-266 | Fly Food Preservative |
| Propionic Acid, 99% | Acros Organics | 149300025 | Fly Food Preservative |
| Kanamycin Sulfate | ISC BioExpress | 0408-10G | |
| Tetracycline HCl | VWR | 80058-724 |
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