Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

In ömrü ölçümü doi: 10.3791/50068 Published: January 7, 2013

Summary

Drosophila melanogaster uzun ömürlü düzenleme moleküler temelini keşfetmek için güçlü bir model organizmadır. Bu protokol bir tekrarlanabilir, uzun ömürlü yanı sıra potansiyel tuzaklar nüfus tabanlı ölçme ve bunlardan kaçınmanın yolları üreten katılan adımları görüşecek.

Abstract

Yaşlanma, fiziksel performansa yol açan ve onu muayene edildiği hemen hemen bütün organizmalarda sürekli fizyolojik bozulma sonuçları, hastalık riskinin arttığı bir olgudur. Bireysel yaşlanma genellikle yaştaki bireylerin büyük kohortlarında gözlem ömrü tarafından laboratuvarda ölçülür yaşa bağlı mortalite, bir artış olarak nüfus düzeyinde tezahür. Ölçüde ölçmek için aramaya Deneyler basit modeli organizmalarda genetik veya çevresel manipülasyonlar etkisini ömrü ömrünü uzatmak ve memelilerde yaşla ilişkili hastalığı önlemek için takson genelinde ve ilham verici yeni stratejiler için muhafaza edilmektedir yaşlanma yönlerini anlamak için son derece başarılı olmuş hangi .

Sirke sineği, Drosophila melanogaster, nispeten kısa ömürlü, uygun hayvancılık ve basit genetik nedeniyle yaşlanma mekanizmaları incelemek için cazip bir model organizmadır.Ancak, yaş-spesifik sağkalım ve ölüm gibi yaşlanma demografik önlemler, deneysel tasarım ve ortamda bile küçük varyasyonlar için olağanüstü duyarlıdır ve yaşlanma deneyler süresince sıkı laboratuvar uygulamalarının bakım gereklidir. Birlikte genetik arka plan dikkatli kontrolü uygulamaya ihtiyacı olan bu hususlar, sağlam ölçümler üretmek için gereklidir. Nitekim, maya uzun ömürlü deneyler, solucanlar, sinekler ve çevresel veya genetik eserler 1-4 kadar takip edilmiştir farelerin çıkarım çevreleyen birçok önemli tartışmalar vardır. Bu protokol, biz laboratuvar şişeleri kullanarak Drosophila da uzun ömürlü ölçüm uzun yıllar boyunca optimize edilmiş prosedürleri bir dizi tanımlamak. Biz de bizim laboratuvar tarafından geliştirilen ve indirme (yüklenememektedir dLife yazılımın kullanımı, tarif http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / yazılım). dLife throughput hızlandırır ve anında işleme ve veri toplama basitleştirilmesi ve veri analizi standartlaştırarak, birleşmeyle Optimum deneysel tasarım tarafından iyi uygulamaları teşvik etmektedir. Biz de tasarım, koleksiyon ve ömrü verileri yorumlamada birçok potansiyel tuzaklar tartışacağız, ve biz bu tehlikeleri önlemek için adımları sağlar.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biz 4 ° C'de protokol görünür deneysel gıdalar, maya salçası ve üzüm agar plaklarına depolamak ve küf ve kuruluk larva ve ergin hem de standart ortam koşulları set in değil sürece 1-2 ay içinde bunları kullanmanızı tavsiye Bir 12:12 hr ışık karanlık döngüsü ve% 60 bağıl nem ile 25 ° C'de bir inkübatör sinekler bakım gerektirmesi sahneye.

1. Deneysel Yiyecek Hazırlama

  1. Larva gelişmesi için, BT gibi bu protokolde kısaltılmış bir modifiye Caltech Orta 5, kullanın.
  2. Biz (10 şeker (sakaroz) ve antibiyotik, anti-fungal maddeler ile takviye kaynatılmış olan bir% 2 agar baz, özel olarak maya (liyofilize bütün bira mayası) oluşur Drosophila ergin (SY) için bir diyet, tavsiye ve dağıtılmış ml başına flakon) 6. Gıda sağlamlaştırmak ve depolamadan önce 12-24 saat boyunca buharlaşmasına izin verilmelidir. Besin ortamı substan Çünküpişirme proseslerinde tially etkisi uzun ömürlü, tutarlılık bir deney içinde ve deneyler arasındaki karşılaştırma için hem de önemlidir.
  3. Bir farmakolojik madde yetişkin gıda ilave edilecek ise, bu ilaç tek başına araç içeren katmanlar alma kontrolü şişeleri ile gıda yüzey üzerinde gıda ve katmanlı bir küçük ölçekli (2 ml), içine karıştırılabilir.

2. Canlı Maya Yapıştır hazırlanması

Aktif kuru maya 3 gr su ile 5-6 ml birleştirin ve iyice karıştırın. Maya hamur kıvamı yumuşak fıstık ezmesi gibi olmalıdır.

3. Bir Üzüm Agar Plaka Hazırlanması

  1. 1.000 ml'lik şişede distile su 500 ml üzüm agar premix bir paket ekleyin ve üzüm agar karışımı eritmek için paket üzerindeki yönergeleri izleyin.
  2. Kabarcığı oluşumuna kaçınarak dikkatlice 100 mm Petri kapları içine karışımı kalın bir tabaka dökün. Premix bir paket yaklaşık 14 gra üretirpe agar plakaları.
  3. Ortam soğutmak ve 15 dakika için kapaklı ile oda sıcaklığında katılaşmaya izin verin. Tabaklar 4 tutulabilir ° C, plastik şal sarılmış, ya da hemen kullanılabilir.

4. Senkronize Yumurta Toplama

Bu protokolde kullanılan tüm ortam, örneğin maya, üzüm agar plakaları, CT ve% 10 SY gıda, oda sıcaklığında olmalıdır.

  1. Bir üzüm agar plaka üzerine yapıştırın maya 2-3 cm çapında katman aç ve bir kenara koyun.
  2. Sinekler uyutmak aşağı örgü tarafı ile CO 2 pad üzerinde büyük bir yumurta toplama kafesi yerleştirin. Azot tabanlı anestezi yüksek kalitede sonuçlar 7 üretebilir Bazı laboratuvarlar tarafından kullanılan CO 2 alternatif vardır.
  3. Bir huni kullanarak, yumurta toplama kafes içine sinek 150-200 çiftleri aktarın.
  4. Kafesin açık ucunu kapak ve bir uç kapağı ile güvenli üzüm agar plağına yerleştirin.
  5. Sinekler uyanana kadar yan kafesi yatırın.Sonra, gecede inkübatör, aşağı kafes, üzüm agar plaka tarafında tutun.
  6. Ertesi gün, yeni mayalı üzüm plaka ile üzüm plaka takas. Sadece plaka yüzeyine maya macun yaklaşık 1 cm çaplı koydu. 1. gün üzüm plaka atın.
  7. Embriyoların 16-22 saat boyunca üzüm agar plaka yüzeyinde toplamasına izin ver. Bu işlem tamamlandıktan sonra, üzüm agar toplamak ve üst sinekler atın.
  8. 1x Fosfat ile üzüm agar plakaları yüzey yıkayın salin (PBS) ile tamponlu. Yumurta yavaşça bir pamuklu çubukla kazınarak mobilize edilebilir. Çizik, hasar vermemeye özen veya plaka yüzeyinden agar ince parçalar kazıyın. Bir huni yardımıyla, bir 15 ml konik tüp içine yıkanmış yumurta dökün.
  9. Yumurta tüpün dibine yerleşmeye ve herhangi bir yumurta kaybetmemek için dikkatli olmak, süpernatant kapalı getireyim. Kalan hacmi 2-3 ml civarında olmalıdır.
  10. Tüp PBS 8-10 ml ekleyin ve yukarıda adım 2-3 mor tekrarlayınsüpernatant netleşene kadar e kat iyice yumurtaları yıkayın. Rezidüel maya kurtulmak bu adımda anahtarıdır.
  11. Kalan hacmi 2 ml kadar yıkama sonra tüm süpernatant süzün. Geniş çaplı pipet kullanarak BT şişeler içine tablet yumurta 32 ul. Pipet ucu Yumurta aspire hiçbir sıvı çok az olan, kompakt olmalıdır. Bu yumurta yerleşim derinliklerine pipet ucu takarak ve hızlı aspire pistonu serbest bırakarak sağlanabilir.
  12. Sıra numaralı seribaşı CT sinek gelişim boyunca inkübatörde geri biberonlar.

5. Yaş eşlemeli Yetişkin Koleksiyonu Flies

  1. Yetişkinler genellikle gün 9 ileriye eclose olacaktır. Inkübatör gecede geri ilk gün ve yerde şişeleri üzerinde ortaya sinekler atın. Bu uygulama erken emergents için yanlışlıkla seçim önlemek ve senkronize sinekler maksimum sayıda toplanmasını sağlayacak.
  2. 16-22 saat sonra, gün-yaşlı yetişkin int uçar aktarmako% 10 SY gıda şişeleri. Gerekirse, diğer bir grup ertesi gün toplanır.
  3. Dönüş inkübatör içine geri uçar ve sinekler iki gün boyunca cinsel olgunluk ve arkadaşı ulaşmanızı sağlar. Yetişkinliğin ilk günü olarak% 10 SY şişe transfer günü kaydedin.

6. Sinekler Sıralama ve Ömür Deneme Kurulumu

  1. Bir fırça kullanarak iki gruba daha sonra anestezi pad üzerinde sinekler küçük gruplar, sıralama erkek ve kadın uyuştur. CO 2 kullanılması durumunda, uzun ömürlü deney bütünlüğünü tehlikeye atabilir olası uzun süreli sağlık sorunları önlemek için maruziyeti en aza indirmek için önemlidir.
  2. Bireysel şişeleri içine aynı cinsiyet 30 sinekler yerleştirin. Nüfus ve sağlıklı nesillerinde hiçbir dengeleyici kromozom varsayarsak, her bir şişe ile her iki cinste 3-4 şişeleri etrafında üretmek gerekir. Bireysel şişeleri içine sinekler Aliquoting toplam, sinekler sadece bir maksimum anestezi maruz, böylece, 3-4 dk daha fazla almalı9-10 dk.
  3. 8-10 flakon her cinsiyet ve deneysel tedavi için çoğaltır kalmayana kadar tekrarlayın 6,1-6,2 adımları.

7. Ömür Deney Takip Excel Kurma

  1. Biz inkübatör şişeyi konumla ilişkili yanlılığı önlemek ve deneyci için flakon kimliğini gizlemek için deneysel koşul tarafından flakon pozisyonu yerine gruplama şişeleri randomizing öneririz. Bunu yapmak için, ilk olarak bir elektronik tablo programında her flakon bir randomize sayısal kimliği atamak, daha sonra kimlik numarasıyla kasetlere şişeleri düzenleyin. Eğer dLife deneme yönetimi yazılımı kullanıyorsanız, her flakon için kimlik numarası oluşturmak için deneme kurulumu öğretici izleyin.
  2. Eğer bir RFID okuyucu veya dLife ile birlikte barkod okuyucu kullanıyorsanız (İsteğe bağlı) her flakon bir RFID veya barkod etiket eklemek ve dLife yılında flakon en sayısal kimliği ile etiket ilişkilendirmek. Bir okuyucu ile tarandığında programı her flakon tanıyacaktırve bir tablo içinde doğru konumda verileri kaydetmek için bir yol. DLife ile birlikte bir etiket okuyucu kullanımı önemli ölçüde veri toplama zamanı ve kayıt hatası azaltır.

8. Ömür Deney Bakımı

Taze yiyecek içeren şişe her transfer için oda sıcaklığında olmalıdır.

  1. Deney süresince, yeni şişeleri üzerine transferi sinekler taze gıda içeren her 2 gün (genç kadın) veya haftada 3 kez (erkek veya kadın yaşı> 3 hafta). Bu adım, genç kadınlar için beslenme ortamının larvaların varlığı mani olmamasına sağlayacaktır. Bu transfer, özellikle eski sinekler (Pletcher, kişisel gözlemler), akut mortalite kısal, anestezi olmadan tamamlanmış olmalıdır.
  2. Her flakon transferi sırasında, yaş kaydetmek eski flakon ölü sinekler saymak ve yeni flakon taşınan ölü sinekler. Ayrıca bu bilgileri kaydetmekBir tablo içinde iki sütun (dLife veya kendi tablo ya da). Bu yapılan sinekler çift sayılmaz olmasını sağlayacaktır. Ölümlerin toplam sayısı (ölü + taşınan) gerektiği önceki transfer taşınan sineklerin en azından eşit sayıda. Yeni ölümlerin sayısını belirlemek için toplam ölüm sayısının daha önce yapılan sinekler sayısını çıkarın.
  3. Bu kaçış veya kaza sonucu ölüm yoluyla doğal ölüm öncesinde deney bırakılırsa bir sinek sağ sansürlü olarak kabul edilir. Bu şekilde çıkan deney hayvanları uçucu deney ayrıldığı o gün ayrı bir sütun içine girilmesi gerekir. Sansürlü sinekler (bkz. aşağıda) ölü olarak kaydedilmez.
  4. Son kurtulan ölene kadar adımları 8,1-8,2 tekrarlamak için devam edin. Sinekler yaş olarak, bazı sinekleri sırt üstü yatmak ve kendi inactiveness nedeniyle ölü görünebilir unutmayın. Bu nedenle (ölü) yapılan sinekler sayarken, bacak hareketleri var olup olmadığını belirlemek için şişeleri tarafında dokunun. Eğer öyleyse, thesE sinekler hala hayatta. Sinekler eski flakon ama canlı olarak gıda takılıp kalması durumunda, onlar ölü olarak sayılmamalıdır ve daha fazla sinek çıkarmak için flakon dokunarak kurtarılmalıdır. Bu deneysel önyargı neden olabileceğinden Sansürleme gibi sinekler dikkatli kullanılmalıdır.

9. Veri Analizi

  1. Yaşayanlar eğrisi bireyin belirli bir yaş hayatta ve tipik bir Kaplan-Meier yaklaşım (Şekil 1) 8 kullanılarak hesaplanır olasılığını görüntüler. Sağ ve üstü örtülü veri yokluğunda, formül yaş x (S x) bu tür, yaş-spesifik hayatta kalma basitleştirilebilir yaş x (N x) bir sayım zaman başlangıcında canlı bireylerin sayısı bölünmesiyle belirlenir Deney sinekler sayısı (N 0) tarafından, S x = N x / N 0. 9.2) Sağkalım eğrileri veri sunumu en sık görülen formu vardır ve bunlarBir log-rank testi kullanılarak gruplar arasındaki eşitlik için test edilebilir. Makul çıkarsama bir grupta 50-100 bireyler olarak birkaç çizilebilir. Sağkalım Ancak, kümülatif bir ölçüsüdür ve bu nedenle böyle bir yaşamın bu erken yaşlanma ile ilgili olmayan ölümler, yaşlanma özgü tespit etkileri güçleştirmek ömrü boyunca hayatta kalma düşmesine neden olacaktır.
  2. İkinci bir veri görselleştirme yöntemi her yaş aralığı yoluyla ölme riskini gösterir ve sağkalım verileri 9,10 daha nüanslı bir açıklama sunulur yaşa özgü mortalite fonksiyonudur. Mortalite önlemler bir yaş diğerine bağımsız ve tedaviler erişkin yaşamı boyunca ayarlanır özellikle ölüm eğrisinin şekli, yaşlanma dinamikleri hakkında çıkarım için yararlıdır. Yaşa özgü mortalite tahminleri Ancak, küçük örneklem büyüklüğü olan hassasiyet ve doğruluk hem de yoksundur ve genellikle güvenilir bir es için kohort başına bireylerin birden-çok yüzlerce gerektirir11 Nihaî.
  3. Ömür farklılıkları tahmini için diğer yöntemler parametrik (örn. Gompertz) ve yarı-parametrik (örn. Cox regresyon) modellerini içermektedir. Bu modeller güçlü olabilir ancak çünkü ölüm eğrilerinin şekli ve yanlış çıkarımlar 11,12 yol açabilir tedavi etkileri, doğası hakkında yapılan varsayımların dikkatli uygulanmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokolü basitleştirilmiş bir şeması önemli adımları özetlenen Şekil 1'de sunulmuştur. Protokolünün senkronizasyon kısım yaş grubundaki yetişkin sinek gerektiren çeşitli deneyleri için de kullanılabilir.

Yabani tip sinekler tipik hayatta kalma eğrileri dLife deney yönetim yazılımı (Şekil 2b, c) kullanılarak, Şekil 2a'da gösterilmektedir. Erişkin erkeklerde genellikle hem nüfusları 25 ° C'de% 10 SY gıda> 50 gün ortalama ve medyan uzun ömürlü ulaşma ile, daha kısa yaşıyor Yaşıyanlar Deneyin başlarında yüksek kalır ve ardından katlanarak reddedileceğini unutmayın.

Drosophila ömrü, sıcaklık ve diyet gibi çevresel koşullar tarafından etkilenmektedir. Şekil 3a, sıcaklık arttıkça yetişkin erkeklerin tipik olarak belirgin bir şekilde daha kısa yaşadığını gösterir. Benzer şekilde, ömrü üzerinde diyetin etkisini Şekil 3b'de gösterilmektedir

Geliştirme sırasında Kusaklara yoğunluğu yetişkin ömrü etkileyecek ve gelişimsel zamanlama değiştirebilir. Burada senkronize yumurta farklı yoğunluklarda larva gelişimini nasıl etkilediğini gösteren bir örnek göstermektedir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, yetişkin sinek verim düşüktür ve gıda yüzey yumurta sayısının çok düşük olduğunda, kurutma karşı hassastır. Yelpazenin diğer ucunda, larval gelişim aşırı kalabalık şişelerde retarded ve yetişkin sinekler verim azalır.

Şekil 5'te gösterildiği gibi, bir bütün olarak kohortun yaşayanlar eğrisi, anormal vial etkileri önemli ölçüde etkilenebilir. Tek ampuller için Düzensiz sağkalım verileri böyle kötü gıda kalitesi veya mantar / bakteri birikimi ve enfeksiyon gibi çeşitli nedenleri olabilir. Böyle anormal ölümler c ikenNüfusun yaşayanlar önlem bir eğrilik, uygun bir şişeye deney dışında gerektiğini belirlemek için basit bir metrik yoktur. Bu durumlar dolayısıyla iyi iyi işleme uygulamaları ile önlenebilir ve büyük bir örneklem büyüklüğü kullanılarak azaltılabilir edilir.

Şekil 6 anormal ölümlere yol açabilir flakon koşulları örnekleri gösterilmektedir. Genel olarak, sinekler sıkışmış alabilirsiniz küçük crevasses yol ve ölebilir her koşulda kaçınılmalıdır. Örnekler arasında şunlar bulunmaktadır: şişeye duvardan uzağa çekme ve gıda çatlama yol açar gıda, gıda, kuruluk içinde kabarcıklar, sırasıyla, Şekil 5a (tek bir kabarcık ile hafif bir örnek), Şekil 5b, ve Şekil 5c 'de gösterilmiştir . Gıda n sinekler üzerine çıkarmak ve daraltma gibi Şekil 5b ve Şekil 5c de gösterilen aşırı kuru gıda, dikkatli transferler sırasında döndürülmüş olmalıdırew flakon. Gıda yüzeyi üzerinde bakteriyel büyüme enfeksiyon ya da fiziksel olarak yakalanmalarında neden olabilir ve bu nedenle ölüm oranı artırabilir. Gıda ter (gösterilmemiş olan) olduğu gibi bakteri türleri beyaz koloniler (Şekil 5d) olarak kendini gösterir iken gıda yüzeyinde Bazı bakteriler, saydam ve parlak görünür. Bu koşullardan herhangi biri sergileyen şişeleri not alınır ve veriler yorumlanır zaman daha fazla göz önüne alınmalıdır. Genel olarak, biz larva ve ergin dönemlerinde hem de hayvancılık için bu dikkat vurgulamak yetişkin sinekler uzun ömür ve sağlık desteklemek ve ileri yaşlarda ölüm belirsiz nedenler yol açan sorunların oluşumunu azaltabilir.

Şekil 1
Şekil 1. Bir Drosophila ömrü testi basitleştirilmiş şematik.

"Şekil Şekil 2.. (A) w 1118 kontrol dişi (daireler) ve erkek (kareler) yetişkin Temsilcisi ömrü eğrileri SY10% gıda üzerine 25 ° C'de uçar. DLife yazılım (B, C) Örnek ekran görüntüleri.

Şekil 3
Şekil 3,. Sıcaklık (A) ve (B) erişkin ömrü üzerinde beslenme. A. Yetişkin kontrol (Canton S) erkek sinekler 18 yetişkinlik boyunca muhafaza edildi ° C, 25 ° C ya da 29 ° CB Yetişkin kontrol (w 1118) dişi kara sinekler,% 15 veya% 5 SY SY diyet ya maruz bırakıldı.

Şekil 4,
Şekil 4. Geliştirme Günü 9 (25 ° C'de) BT gıda şişelerde aliquoted senkronize yumurta,. VEmbriyo içeren tablet ve olume kadar her şişe altında gösterilir.

Şekil 5,
Şekil 5. Flakon tarafından yaşayanlar gösteren dLife yazılım Temsilcisi arsa. Ok bir grup içinde tek bir anormal flakon gösterir.

Şekil 6
Şekil 6.. Suboptimal gıda kalitesi örnekleri. A. gıda yüzeyinde Kabarcıklar. B. Gıda flakonun kenarından uzak küçüldü. C. gıda çatlaklar. Gıda yüzeyinde D. bakteri birikmesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada sunulan protokol genetik, farmakolojik ve çevresel müdahalelerin değerlendirilmesi için uyarlanabilir Drosophila yetişkin uzun ömürlü tekrarlanabilir ölçümler üretmek için bir yöntem açıklanır. Protokol Crucial yönleri dikkatle, larval gelişim ortamı kontrol yetişkin stresi en aza indirerek ve deney grupları ve kontrol grubu arasında önyargı minimize içerir. Biz de dLife ömrü deneme yönetimi yazılımı kullanımı sunuyoruz. Sadece her flakon bir barkod veya RFID etiketi takarak dLife programı her bir ölçüm için veri toplama konusunda yardımcı ve yaşayanlar eğrisi çizme içinde olacaktır. Şu anda şişeleri kullanarak sinek ömrü çalışmaları için en uygun iken, bu deney yönetim aracı kolayca nüfus müşavir ya da stres direnci ve ilaç toksisitesi gibi sağkalım ek önlemler için farklı tipleri ile, diğer organizmalar kullanım için adapte olabilir.

PHerhangi bir ömür değerlendirmesi başlamadan rior, bir ilk dikkatlice ebeveyn stokların üretim kontrolü gerekir. Ebeveyn suşları sağlığı olduğu gibi genetik değişkenliği, önemli bir faktördür. Bu faktörler olası uzun ömürlü regülatörleri 13. Min erken çalışmaları ile ilgili önemli bir halk tartışmalara yol açmıştır. Araştırmacı genetik geçmişi değişkenlik atfedilebilecek etkileri en aza indirmek için çeşitli seçenekler vardır. Genetik manipülasyonlar, tüm genetiği değiştirilmiş suşları kontrol suşu ya geriye melezleme yoluyla plan-kontrollü (en az 6 kez) veya indüklenebilir sistemleri (örneğin, ısıya duyarlı allel veya ilaç-indüklenebilir transgen ekspresyonu) kullanarak olmalıdır. GeneSwitch ve sistemler 14,15 Tet-on popüler ve transgen ya uyarılmış veya indüklenen edilmediği aynı genetik arka plan ile sinekler doğrudan karşılaştırılmasını sağlamak. Tüm indüklenebilir sistemleri için, uygun eş kontrol confou önlemek için gerekli olannds indükleyici ile ilişkilidir. Amaçlanan manipülasyon 13 ilişkisiz nedenlerden dolayı iki farklı suşları arasında çapraz F1 nesil ömrünü uzatabilirsiniz melez gücü sonuçlar, neredeyse her zaman genetik geçmişi kontrol etmek için başarısızlık. Gal4-UAS sistemi kullanılırken bu faktör özellikle endişe vericidir. Çevresel müdahaleler için (örneğin, ilaç tedavisi, diyet, sıcaklık, vb), bu birden fazla suşu üzerinde müdahalenin etkilerini araştırmak için tavsiye edilir. Son olarak, ebeveyn 16 yaş ve stres 17 hem F1 nesil uzun ömürlü etkileyebilir, ve bu nedenle, sağlıklı genç erişkinlerde yumurta üretimi için seçilmelidir.

Pupa / larva ortamında kontrol Önemli yönleri kalabalık önlenmesi ve ışık-karanlık dönemleri, nem, sıcaklık ve katı düzenleme ile kontrollü bir çevrenin bakımını içerir. Bu faktörler dev zamanlaması hem etkileyecekelopment ve elde edilen yetişkinlerin fiziksel kalitesini. Bu tür yüksek larva yoğunluğu gibi istenmeyen larva ortamlar, yetişkin uzun ömürlü 18 etkilemekte olarak da bilinirler stres-indüklenebilir etkinleştirme faktörlerinin (örneğin, ısı şoku proteini ekspresyonu) yol açabilir.

Yetişkin aşamasında, çevreye dikkat önemini korumaktadır. Tek başına diyet seçimi büyük ölçüde ömrünü etkileyebilir ve uzun ömür üzerinde diyet özel efektler üretmek için genetik faktörler ile etkileşimde bulunabilirsiniz. Ayrıca, bazı yaygın gıda üssü alternatifleri (maya yerine liyofilize bütün bira mayası özü) dramatik gıda kendisi ömür değerlendirmesini bozabilir organizma strese neden olduğunu ihtimalini açık bırakarak, ömrü 19 kısaltabilir. Bu makalede, biz p edebilirsin gıda fiziksel anormallikler (örneğin, kabarcıklar, köpük, çatlak, bakteri, vb) dahil olmak üzere, diyet ortamında potansiyel stres kaynaklarını sermiştirhysically hayvanlar tuzağa. Taze gıda ile eski gıda (en az üç kere her hafta) düzenli olarak değiştirilmesi bu zorlukların çoğunun üstesinden gelebilir. Ayrıca, sıcaklık 20, nem (kişisel gözlem), aydınlatma 21, ve conspecifics varlığında (sosyal ortam) 22 tüm ömrü modüle edebilir, ve deney içinde, bu faktörlerin kontrol edilmesi için ilgi sonucu olarak sapma önlemek için önemlidir. Bir flakon içindeki sinekler sayısı zamanla azalır iken, biz sinek sayısını ayarlamak için anestezi kullanımı bir yaş-bağımlı bir şekilde (Pletcher, kişisel gözlemler) mortaliteyi artırabilir bulduk, ve biz bu prosedür tavsiye yok. Küvözde şişeleri hassas pozisyon bile görünüşte kontrollü bir ortamda, aynı zamanda bir faktördür. Kontrolleri ile deney grupları arasında Randomize fiziksel dağıtım flakon yerleştirme ile ilgili ve uygun istatistiksel çıkarımlar için gerekli olan önyargı azaltabilir. Hatta ileKontrollü şartlar ufak farklar deneyler arasında gözlenen ve içi deney kontrollerin kullanılması esastır olabilir.

Alternatif beslenme yaklaşımlar bir kılcal besleyici yaklaşımı (CAFE yöntemi) 23 de dahil olmak üzere ömür analizi için ileri sürülmüştür. Yiyecek tüketim hassas ölçümler sağlama yeteneği bu yöntem çıkmaktadır, ama bu belirgin kısa ömürlü sinekler 24 ile sonuçlanır. Ve genel bir diyet uzun ömürlü genetik faktörler arasındaki kombine ilişkiyi değerlendirirken beslenme ortamı ile ilişkili potansiyel gerilimleri dikkate alınmalıdır.

Yaşayanlar ve mortalite eğrileri yaşlanan nüfus dinamikleri hakkında çok bilgi ortaya çıkarabilir hesaplanmasına dahil Demografik analiz. Tipik yaşayanlar eğrisi yaşamın erken dönemlerinde uzun bir süre için nispeten düz kalır ve düşük mortalite f bir döneme tekabül yaşlarda düşüş hızını artacakölüm bir üstel artış dönemine göre ollowed. Stresli bir ortam nüfus ve yaşayanlar eğrisi bir anormal daldırma erken ölümlerin aşırı olarak tezahür genellikle olacak. Böyle bir sonuç tedaviler arasında önemli farklılıklar gösterebilir iken, normal çoğaltma sağlam olmayacaktır. Bu nedenle hiçbir kesin sonuca çizilir önce en az iki bağımsız (yani olmayan eş) tekrarlanan deneyler yürütülür öneririz. Bu, örnek büyüklüğü artan hayvancılık koşulları kontrol ve ebeveyn stoklarının sağlığı gerekli geliştirmeye yönelik ek bir çaba olabilir.

Sağ-sansürleme (deney olduğunu kaçış gelen hayvanların çıkarılması veya kazara nedenlerden ölü olduğu tahmin ediliyor) stresli çevresel koşullar yüzünden ölmektedir hayvanların çok dikkatli uygulanmalıdır. Açıkçası, sansürleme deneysel tedaviler arasında rastgele meydana gelir ve gerekiyorsa deneysel müdahalelerinimodüle stres duyarlılığı ile ilgili bir yanlışlıkla nüfusa tedaviye seviyesi seçimi geçerli olabilir. Genel bir kural olarak, (öncelikle gıda kaynağı ile ilişkili) belirsiz erken ölüm üretebilir faktörlerin varlığı kaçınarak sansürleme daha iyidir, ve sansürleme sadece fiziksel taşıma sırasında ölen ya da kaçmaya gözlendi organizmalar için uygulanmalıdır.

Son bir göz istatistiksel anlamlılık değerlendirilmesidir. Geniş kohort örnek boyutları tedaviler arasındaki küçük farklılıkları ayırt etmek etkileyici güç sağlarken, böyle bir farklılığın potansiyel biyolojik önemi de dikkate alınmalıdır. Makul büyüklükte ömür deneyleri ile,% 1-2 gibi düşük farklılıklar genellikle ileri derecede anlamlı, ancak sağlık durumu üzerinde müdahalenin genel etkisi önemsiz olabilir. Deney toplam sonuçların yorumu, bu nedenle, her iki istatistiksel ve biyolojik önemi göz önünde bulundurulmalıdır. Infesağkalım deneylerden yaşlanma süreci hakkında referansınız yeteneği 25 ve gastrointestinal duvar bütünlüğü 7 tırmanışı gibi davranışsal veya fizyolojik sağlık önlemleri, yaşa bağlı düşüşler önlemlerle artar olabilir.

Özetle, Drosophila model organizma yaşlanma mekanizmaları incelemek için cazip bir seçenek. Dikkatli bir deney tekniği ile, sağlam bir demografik analiz yaşlanma süreci üzerinde farmakolojik ve genetik faktörlerin etkisi içgörü sağlayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma Ellison Tıp Vakfı (SDP, fon tarafından desteklenen http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) ve NIH R01AG030593 (SDP). Bu çalışma P30-AG-013283 (Yaşlanma Ulusal Enstitüsü tarafından finanse Yaşlanma Biyolojisi Mükemmellik Nathan Şok Merkezi Drosophila Yaşlanma Çekirdek (DAC) kaynak kullanm http://www.nih.gov/ ). Yazarlar eleştirel okuma için yararlı tartışmalar ve özellikle Brian Chung Pletcher Laboratuvar teşekkür etmek istiyorum. Biz veri toplama konusunda yardım almak için Nick Asher ve Kathryn Borowicz kabul etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active Dry Yeast Fleishmann’s Yeast 2192
Grape Agar Powder Premix Genesee Scientific 47-102
Large Embryo Collection Cages Genesee Scientific 59-101
Large Replacement End Caps Genesee Scientific 59-103
6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene Genesee Scientific 32-130
Flugs Closures for Stock Bottles Genesee Scientific 49-100
Drosophila Vials, Wide, Polystrene Genesee Scientific 32-117
Flugs Closures for Wide Vials Genesee Scientific 49-101
Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul Denville Scientific P1105-CP
Flystuff Flypad, Standard Size Genesee Scientific 59-114
BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; Fisher Scientific 08-757-12
Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow Fisher Scientific 10-200-47
PBS pH 7.4 10x Invitrogen 70011044
Gelidium Agar Mooragar n/a
Brewer's Yeast MP Biomedicals 0290331280
Granulated Sugar Kroger n/a
Tegosept Genesee Scientific 20-266 Fly Food Preservative
Propionic Acid, 99% Acros Organics 149300025 Fly Food Preservative
Kanamycin Sulfate ISC BioExpress 0408-10G
Tetracycline HCl VWR 80058-724

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toivonen, J. M., et al. No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects. PLoS Genet. 3, e95 (2007).
  2. Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. Testing an 'aging gene' in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background. Aging Cell. 2, 123-130 (2003).
  3. Burnett, C., et al. Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila. Nature. 477, 482-485 (2011).
  4. Bokov, A. F., et al. Does reduced IGF-1R signaling in Igf1r+/- mice alter aging? PLoS One. 6, e26891 (2011).
  5. Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosophila Information Service. 34, 117-118 (1960).
  6. Skorupa, D. A., Dervisefendic, A., Zwiener, J., Pletcher, S. D. Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster. Aging Cell. 7, 478-490 (2008).
  7. Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metab. 14, 623-634 (2011).
  8. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 53, 457-481 (1958).
  9. Pletcher, S. D. Mitigating the Tithonus Error: Genetic Analysis of Mortality Phenotypes. Sci. Aging Knowl. Environ. 2002, pe14 (2002).
  10. Pletcher, S. D., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Why do life spans differ? Partitioning mean longevity differences in terms of age-specific mortality parameters. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 381-389 (2000).
  11. Promislow,, Tatar,, Pletcher,, Carey, Below-threshold mortality: implications for studies in evolution, ecology and demography. Journal of Evolutionary Biology. 12, 314-328 (1999).
  12. Pletcher, Model fitting and hypothesis testing for age-specific mortality data. Journal of Evolutionary Biology. 12, 430-439 (1999).
  13. Partridge, L., Gems, D. Benchmarks for ageing studies. Nature. 450, 165-167 (2007).
  14. Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 12602-12607 (2001).
  15. Ford, D., et al. Alteration of Drosophila life span using conditional, tissue-specific expression of transgenes triggered by doxycyline or RU486/Mifepristone. Exp. Gerontol. 42, 483-497 (2007).
  16. Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, 927-935 (2002).
  17. Smith, E. M., et al. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J. Nutr. 137, 2006-2012 (2007).
  18. Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. J. Insect Physiol. 47, 1301-1307 (2001).
  19. Bass, T. M., et al. Optimization of dietary restriction protocols in Drosophila. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1071-1081 (2007).
  20. Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1976).
  21. Pittendrigh, C. S., Minis, D. H. Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1537-1539 (1972).
  22. Joshi, A., Mueller, L. D. Adult crowding effects on longevity in Drosophila melanogaster: Increase in age-dependent mortality. Current Science. 72, 255-260 (1997).
  23. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 8253-8256 (2007).
  24. Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2498-2503 (2008).
  25. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
In ömrü ölçümü<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (71), e50068, doi:10.3791/50068 (2013).More

Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (71), e50068, doi:10.3791/50068 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter