Summary
Drosophila melanogaster er en kraftig modell organisme for å utforske den molekylære basis av lang levetid regulering. Denne protokollen vil diskutere trinnene involvert i å generere en reproduserbar, populasjonsbasert måling av lang levetid, så vel som potensielle fallgruver og hvordan unngå dem.
Abstract
Aldring er et fenomen som resulterer i jevn fysiologiske forverring i nesten alle organismer som har blitt undersøkt, fører til redusert fysisk yteevne og økt risiko for sykdom. Individuell aldring er manifest på befolkningsnivå som en økning i aldersavhengig dødelighet, som ofte måles i laboratoriet ved å observere levetid i store årskull av alder-matchet individer. Eksperimenter som forsøker å kvantifisere i hvilken grad genetisk eller miljømessige manipulasjoner innvirkning levetid i enkle modellorganismer har vært bemerkelsesverdig vellykket for å forstå aspekter ved aldring som er bevart på tvers taxa og inspirerende nye strategier for å utvide levetiden og hindre alder-assosiert sykdom hos pattedyr .
Eddik fly, Drosophila melanogaster, er en attraktiv modell for å studere mekanismene for aldring på grunn av sin relativt korte levetid, praktisk reindrift, og lettvinte genetikk.Imidlertid demografiske tiltak av aldring, inkludert alder-spesifikk overlevelse og dødelighet, er usedvanlig følsom for selv små variasjoner i eksperimentell design og miljø, og opprettholdelse av strenge laboratoriepraksis for varigheten av aldrende eksperimenter kreves. Disse hensynene, sammen med behovet for å øve nøye kontroll av genetisk bakgrunn, er avgjørende for å generere robuste målinger. Faktisk er det mange kjente kontroversene rundt slutning fra levetid eksperimenter i gjær, mark, flue og mus som har blitt sporet tilbake til miljømessige eller genetiske gjenstander 1-4. I denne protokollen beskriver vi et sett av prosedyrer som har blitt optimalisert over mange år for å måle levetid i Drosophila hjelp laboratoriet hetteglass. Vi beskriver også bruken av dLife programvare, som ble utviklet av vårt laboratorium og er tilgjengelig for nedlasting ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / software). dLife akselererer gjennomstrømming og fremmer god praksis ved å innlemme optimal eksperimentell design, forenkle fly håndtering og datainnsamling, og standardisere data analyse. Vi vil også diskutere de mange potensielle fallgruver i design, innsamling og tolkning av levetid data, og vi gir skritt for å unngå disse farene.
Protocol
Vi anbefaler lagring eksperimentelle mat, gjær lim, og drue agarplater som vises i protokollen ved 4 ° C og bruke dem i løpet av 1-2 måneder, så lenge mugg og tørrhet ikke har satt i. Standard miljøforhold for både larve og voksen scenen innebære vedlikehold av fluer i en inkubator ved 25 ° C med en 12:12 timers lys mørke syklus og 60% relativ fuktighet.
1. Utarbeidelse av eksperimentelle mat
- For larve vekst, bruker vi en modifisert Caltech 5 Medium, som er forkortet i denne protokollen som CT.
- Vi anbefaler en diett for voksen Drosophila (SY) som består av sukker (sukrose) og gjær (lyofilisert hele ølgjær) i en 2% agar-base, som har blitt kokt, supplert med antibiotika og anti-fungal agenter, og distribuert (10 ml per hetteglass) 6. Mat bør få lov til å stivne og fordampe for 12-24 timers før lagring. Fordi næringsstoffer miljøet kan betydeligtially innvirkning levetid, konsistens i matlaging prosesser er viktig både innenfor et eksperiment og for sammenligning mellom eksperimenter.
- Hvis en farmakologisk agent er å bli lagt til den voksne mat, kan dette stoffet blandes inn i en liten gruppe med mat og lagdelt (2 ml) på mat overflaten, med kontroll hetteglass fikk lagene inneholder kjøretøy alene.
2. Utarbeidelse av en levende gjær Lim
Kombiner 5-6 ml vann med 3 g tørrgjær og bland godt. Konsistensen av gjær lim bør være av en jevn peanøttsmør.
3. Utarbeidelse av en Grape agarskål
- Legg en pakke av en drue agar premix i 500 ml destillert vann i en 1000 ml kolbe og følg instruksjonene på pakken for å oppløse drue agar mix.
- Hell forsiktig et tykt lag av blandingen i 100 mm petriskåler samtidig unngå bobledannelse. En pakke Premix produserer ca 14 grape agarplater.
- La media avkjøles og stivne i romtemperatur med lokk på i 15 min. Platene kan holdes ved 4 ° C, innpakket i plastfolie, eller brukes umiddelbart.
4. Innsamling av Synkroniserte Eggs
Alle medier som brukes i denne protokollen, dvs. gjær, drue agarplater, CT og 10% SY mat, bør ha romtemperatur.
- Spre en 2-3 cm diameter lag av gjær lime på en drue agar plate og sett til side.
- Plassere en stor egg samling bur på en CO 2 pad med mesh-side ned for å bedøve fluer. Nitrogen-baserte anestesi er et alternativ til CO 2, brukes av noen laboratorier, som kan produsere høykvalitets resultater 7.
- Ved hjelp av en trakt, overføre 150-200 par fluer inn i egget samling buret.
- Plasser drue agarskål å dekke den åpne ende av buret og fest med en endehette.
- Lå i buret på sin side til fluer våkner.Deretter holder buret, drue agarskål side ned, i inkubatoren natten.
- På neste dag, bytte drue plate med en nylig yeasted drue plate. Bare satt ca 1 cm diameter av gjær lim på overflaten av platen. Kast 1. dag drue plate.
- Tillat embryoene samle seg på overflaten av drue agarskål for 16-22 timer. Når dette er gjort, samle drue agarskål og kast den overordnede fluer.
- Vask overflaten av drue agarplater med 1x Fosfatbufret saltvann (PBS). Egg kan mobiliseres ved forsiktig skraping med en bomullspinne. Pass på ikke å ripe, skade eller skrape tynne stykker av agar på overflaten av platen. Ved hjelp av en trakt, helle de vaskede egg i et 15 ml konisk rør.
- La eggene seg på bunnen av røret, og hell av supernatanten, er forsiktig for ikke å miste noen egg. De resterende volum bør være rundt 2-3 ml.
- Legg 8-10 ml PBS til røret og gjenta foregående trinn 2-3 more ganger å grundig vaske eggene inntil supernatanten er klart. Bli kvitt gjenværende gjær er nøkkelen i dette trinnet.
- Etter vask, avløp alle supernatant til gjenværende volum er 2 ml. Alikvot 32 ul egg i CT flasker med et bredt-boring pipettespiss. Egg i pipettespissen skal være kompakt, med liten eller ingen væske som aspireres. Dette kan oppnås ved å sette inn pipettespissen dypt inn i egget oppgjør og raskt slippe stempelet til å aspirere.
- Place seeded CT flasker tilbake i inkubatoren i hele fly utvikling.
5. Innsamling av samme alder Adult Flies
- Voksne vil typisk Eclose fra dag 9 framover. Kast fluene som fremkom på den første dagen og plassere flasker tilbake i kuvøse natten. Denne praksisen vil unngå utilsiktet utvalg for tidlig emergents og gir mulighet for innsamling av et maksimalt antall synkroniserte fluer.
- 16-22 hr senere, overføre dager gammel voksen flyr into 10% SY mat flasker. Hvis nødvendig, kan en annen batch samles neste dag.
- Tilbake flyr tilbake til inkubatoren og la fluer å nå seksuell modenhet og kompis i to dager. Registrere dagen for overføring til 10% SY flasker som den første dagen av voksenlivet.
6. Sortering Flies og sette opp Longevity Experiment
- Anesthetize små grupper av fluer på bedøvelse pad, og deretter sortere menn og kvinner inn i to grupper med en pensel. Hvis du bruker CO 2, er det avgjørende å minimere eksponering for å hindre mulige langvarige helseproblemer som kan kompromittere integriteten til lang levetid eksperimentet.
- Plasser 30 fluer av samme kjønn i individuelle ampuller. Forutsatt ingen balansesleider kromosomer i befolkningen og sunn avkom, bør hver flaske produsere rundt 3-4 ampuller av hvert kjønn. Aliquoting fluer i individuelle ampuller bør ikke ta mer enn 3-4 minutter, slik at det samlet er fluer bare utsatt for anestesi for maksimalt9-10 min.
- Gjenta trinn 06.01 til 06.02 fram til det er 8-10 hetteglass replikater for hvert kjønn og eksperimentell behandling.
7. Sette opp Excel regneark til å spore den Longevity Experiment
- Vi anbefaler randomizing hetteglass stilling i stedet gruppering ampuller etter eksperimentell tilstand for å unngå skjevhet tilknyttet hetteglasset beliggenhet i inkubator og å skjule hetteglasset identitet til experimenter. For å gjøre dette, må du først tilordne en randomisert numerisk ID til hver ampulle i et regnearkprogram, deretter ordne hetteglassene i skuffene etter ID-nummer. Hvis du bruker dLife eksperimentet programvare, følg veiledningen på oppsettet av eksperimentet å generere ID-nummer for hvert hetteglass.
- (Valgfritt) Hvis du bruker en RFID-leser eller strekkodeleser i forbindelse med dLife, feste en RFID eller strekkode tag til hvert hetteglass og knytte tag med hetteglasset er numerisk ID i dLife. Programmet vil gjenkjenne hvert hetteglass når skannet med en leserog veilede en til å registrere data i riktig sted i et regneark. Bruk av en kode leser i forbindelse med dLife reduserer datainnsamling tid og opptak feil.
8. Vedlikeholde Longevity Experiment
Ampullene inneholdende fersk mat bør være ved romtemperatur for hver overføring.
- Under forsøksperioden, overføre fluer på nye ampuller inneholder fersk mat hver 2 dager (unge kvinner), eller 3 ganger i uken (menn eller kvinner> 3 ukers alder). Dette trinnet vil sikre at fôring miljø for unge kvinner ikke blir forstyrret av tilstedeværelsen av larver. Denne overføringen skal være ferdig uten bedøvelse, som kan indusere akutt dødelighet, særlig i eldre fluer (pletcher, personlige observasjoner).
- Under hvert hetteglass overføring, registrere alder, telle de døde fluer i den gamle flasken, og de døde fluer som er gjennomført til den nye flasken. Noter disse opplysningene separat ito kolonner i et regneark (enten dLife eller din egen regneark). Dette vil sikre at utført fluer er ikke dobbelt telles. Det totale antall dødsfall (død + gjennomført) skal minst være lik antall gjennomførte fluer fra forrige overføring. Trekk antallet tidligere gjennomført fluer fra det totale antall dødsfall å bestemme antall av nye dødsfall.
- En flue regnes høyre sensurert hvis den forlot eksperimentet før naturlig død gjennom flukt eller dødsulykker. Dyr spennende eksperimentet på denne måten bør inngås en egen kolonne på dagen at fly gått forsøket. Sensurert fluer er ikke registrert som død (se nedenfor).
- Fortsette å gjenta trinn 08.01 til 08.02 fram til den siste overlevende er død. Vær oppmerksom på at som fluer alder, kan noen fluer ligge på ryggen og synes døde på grunn av inaktivitet deres. Derfor når man teller gjennomført (død) fluer, trykker du på siden av ampullene for å fastslå om det er leg bevegelser. I så fall these fluer er fortsatt i live. I tilfeller der fluer blir sittende til maten i den gamle flasken, men i live, bør de ikke bli regnet som død og bør bli reddet av ytterligere tapping av hetteglasset for å løsne fly. Sensurere slike fluer bør brukes med forsiktighet da det kan føre til eksperimentell bias.
9. Dataanalyse
- Den overlevelseskurve viser sannsynligheten for at et individ overlever til en gitt alder og er vanligvis beregnet med en Kaplan-Meier tilnærming (Figur 1) 8. I fravær av høyre-sensurerte data, kan formelen forenkles slik at alderstilpasset survivorship i en alder x (S x) bestemmes ved å dividere antall individer i live ved starten av en folketelling tid i en alder x (N x) med det totale antall av fluer i eksperimentet (N 0), S x = N x / N 0. 9.2) survivorship kurvene er den vanligste form av data presentasjon, og dekan testes for likestilling mellom grupper som bruker en log-rank test. Rimelig slutning kan trekkes fra så få som 50-100 personer i en kohort. Survivorship er en kumulativ mål, imidlertid, og derfor dødsfall som ikke aldring-relatert, slik som de tidlig i livet, vil trykke survivorship hele levetiden gjør det vanskelig å fastslå effektene spesifikke for aldring.
- En annen data visualisering metoden er den aldersspesifikke dødeligheten funksjon, som viser risiko for å dø gjennom hver alder intervall og presenterer en mer nyansert beskrivelse av overlevelse data 9,10. Dødelighet tiltak er uavhengige fra en alder til en annen, og formen på dødelighet kurven er nyttig for inferens om dynamikken i aldring, spesielt når behandlinger justeres under voksne liv. Estimater av alderstilpasset dødelighet, men mangler både presisjon og nøyaktighet med små utvalgsstørrelser, og krever ofte flere-til-mange hundre individer per kohort for en pålitelig esestimat 11.
- Andre metoder for å beregne levetid forskjeller inkluderer parametrisk (f.eks Gompertz) og semi-parametriske (f.eks Cox regresjon) modeller. Disse modellene kan være kraftig, men bør brukes med forsiktighet på grunn av forutsetningene om formen på dødelighet kurver og natur behandlingseffekter, noe som kan føre til feil slutning 11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En forenklet ordning av protokollen er presentert i figur 1, hvor det sentrale trinn skissert. Synkroniseringen del av protokollen kan brukes for ulike analyser som krever samme alder voksne fluer.
Typiske survivorship kurver av villtype fluer er vist i figur 2a, ved hjelp av dLife eksperimentet administrasjonsprogramvare (Figur 2b, c). Voksne hanner vanligvis lever kortere, med begge populasjonene oppnå en gjennomsnittlig og median levetid på> 50 dager på en 10% SY mat ved 25 ° C. Vær oppmerksom på at survivorship fortsatt høy i første del av eksperimentet, og deretter avtar eksponentielt.
Drosophila levetid påvirkes av miljømessige forhold, som for eksempel temperatur og diett. Fig. 3a viser at voksne hanner vanligvis lever markert kortere som temperaturen økes. Likeledes er virkningen av dietten på levetiden presentert i Figur 3b
Tettheten av kohorter under utvikling kan påvirke voksen levetid og endre utviklingsmessige timing. Her viser vi et eksempel på hvordan ulike tettheter av synkroniserte egg påvirker larveutvikling. Som vist i figur 4, er en voksen flue utbytte fattige og mat overflate er utsatt for tørking når antall egg er for lav. På den andre enden av spekteret, er larveutviklingen tilbakestående i overfylte flasker, og utbytte av voksne fluer reduseres.
Den overlevelseskurve av kullet som helhet kan påvirkes betydelig ved avvikende hetteglass effekter, som vist i Figur 5. Uregelmessig overlevelse data for individuelle ampuller kan ha flere årsaker, for eksempel dårlig mat kvalitet eller bakteriell / sopp akkumulering og infeksjon. Selv om slike avvikende dødsfall cen skew befolkningen survivorship tiltaket, er det ikke en enkel beregning for riktig å fastslå at et hetteglass bør utelukkes fra forsøket. Slike situasjoner er derfor best unngås ved gode håndtering praksis og dempet ved hjelp av en stor utvalgsstørrelse.
Figur 6 viser eksempler på hetteglass forhold som kan føre til avvikende dødsfall. Generelt bør enhver tilstand som kan føre til små sprekker der fluer kan bli sittende fast og dør unngås. Eksempler inkluderer: er bobler i maten, tørrhet i maten som fører til krymping bort fra hetteglasset veggen, og sprekkdannelser i maten vist i figur 5a (et mildt eksempel med en enkelt boble), Figur 5b og figur 5c henholdsvis . Svært tørr mat, som vist i figur 5b og figur 5c bør nøye venda under overføringer, som maten kan løsne og skjule bort fluene i new hetteglass. Bakterievekst på overflaten av maten kan føre til infeksjon eller fysiske innesperring og dermed kan øke dødeligheten. Noen bakterier på overflaten av maten vises transparente og glinsende som om det er svette fra mat (ikke vist), mens andre typer bakterier vil manifestere som hvite kolonier (figur 5d). Ampuller oppviser noen av disse forholdene bør bemerkes og videre betraktes når dataene tolket. Generelt, understreker vi at omsorgen for reindrift i både larver og voksen stadier kan støtte lang levetid og helse for voksne fluer og redusere forekomsten av problemer som fører til tvetydige dødsårsakene i senere i livet.
Figur 1. Forenklet skjematisk av en Drosophila levetid assay.
Figur 2. (A) Representant levetid kurver av w 1118 kontroll kvinne (sirkler) og menn (firkanter) voksen flyr ved 25 ° C på en SY10% mat. (B, C) Representative skjermbilder av dLife programvare.
Figur 3. Effekter av temperatur (A) og kosthold (B) på voksen levetid. A. Voksen kontroll (Canton S) mannlige fluer ble opprettholdt gjennom voksenlivet ved 18 ° C, 25 ° C, eller 29 ° CB Voksen kontroll (w 1118) kvinnelige fluer ble utsatt for enten en 15% eller 5% SY SY diett.
Figur 4. Dag 9 av utvikling (ved 25 ° C) av synkroniserte egg, alikvoteres i CT food flasker. Volume av embryoet-holdige delmengde er som vist under hver flaske.
Figur 5. Representant plottet fra dLife programvare viser survivorship av hetteglass. Pilen indikerer en enkelt unormal hetteglass i en gruppe.
Figur 6. Eksempler på suboptimal mat kvalitet. A. Bubbles på mat overflate. B. mat krympet bort fra kanten av hetteglasset. C. Sprekker i maten. D. Bakterier akkumulasjon på overflaten av maten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen presenteres her beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av reproduserbare målinger av voksen levetid i Drosophila som er tilpasningsdyktige for vurdering av genetiske, farmakologiske, og miljømessige intervensjoner. Viktige aspekter av protokollen omfatter nøye kontrollere larve utviklingsmiljø, minimere voksen stress, og minimere skjevhet over eksperimentelle grupper og kontroller. Vi presenterer også bruk av dLife levetid eksperimentet management software. Ved ganske enkelt å feste en strekkode eller RFID tag til hver ampulle, vil dLife programmet bistå i datainnsamling for hver måling og i plotte overlevelseskurve. Mens det er i dag mest egnet for studier av flue levetid hjelp hetteglass, kunne dette eksperimentet styringsverktøy lett tilpasses for bruk i andre organismer, med ulike typer av befolkningsgrupper kamre, eller for ytterligere tiltak for å overleve, inkludert stress motstand og legemiddeltoksisitet.
Prior påbegynnes noen lang vurdering, må man først nøye kontrollere produksjonen av foreldrenes aksjer. Genetisk variasjon er en viktig faktor, som er helse av foreldrenes stammer. Disse faktorene har ført til en betydelig offentlig kontrovers knyttet tidlige studier som rapporterte antatte levetid regulatorer 13. Forskeren har flere alternativer for å minimere effekter som kan tilskrives variasjon i genetiske bakgrunn. For genetiske manipulasjoner, bør alle genetisk endret stammer være background-kontrollert gjennom enten tilbakekryssing til en kontroll belastning (minst 6 ganger) eller ved hjelp av induserbare systemer (f.eks temperatursensitive alleler eller narkotika-induserbar transgene uttrykk). Den GeneSwitch og Tet-på systemer 14,15 er populære og tillate direkte sammenligning av fluer med samme genetiske bakgrunn hvori transgenet enten indusert eller ikke indusert. For alle induserbare systemer, er hensiktsmessige samtidige kontroller nødvendig for å unngå confounds tilknyttet induceren. Unnlatelse av å kontrollere for genetisk bakgrunn nesten alltid resulterer i hybrid vigor, som kan utvide levetiden på F1 generasjon av en krysning mellom to forskjellige stammer av grunner ikke er relatert til den tiltenkte manipulasjon 13. Denne faktoren er spesielt opptatt av når du bruker GAL4-UAS systemet. For miljø intervensjoner (f.eks medikamentell behandling, kosthold, temperatur etc.), er det tilrådelig å studere effekter av intervensjonen på mer enn én stamme. Endelig kan både foreldrenes alder 16 og stress 17 påvirke levetiden til F1-generasjonen, og av denne grunn, bør friske unge voksne velges for eggproduksjon.
Viktige aspekter ved å kontrollere larve / pupal miljø omfatter forebygging av overbefolkning og vedlikehold av et kontrollert miljø med streng regulering av lys og mørke perioder, fuktighet og temperatur. Disse faktorene vil påvirke både tidspunkt for development og den fysisk kvalitet av de resulterende voksne. Uønskede larve miljøer, slik som høy larve tetthet, kan føre til aktivering av stress-induserbare faktorer (f.eks, heat shock protein expression) som er kjent for å påvirke voksen levetid 18 år.
Under den voksne fasen, forblir nøye hensyn til miljøet viktig. Valget av diett alene kan i stor grad påvirke levetid og kan samhandle med genetiske faktorer å produsere diett-spesifikke effekter på lang levetid. Videre kan noen vanlige mat base alternativer (gjærekstrakt stedet for lyofilisert hele ølgjær) dramatisk forkorte levetiden 19, forlater åpne muligheten for at maten selv forårsaker organismebiologi stress som kan svekke vurdering av levetid. I denne artikkelen har vi fremhevet potensielle kilder til stress i kosten miljø inkludert fysiske uregelmessigheter i mat (f.eks bobler, skum, sprekker, bakterier, etc.) som kan physically entrap dyrene. Regelmessig utskifting av gamle mat med fersk mat (minst tre ganger hver uke) kan overvinne mange av disse vanskelighetene. Videre kan temperatur 20, fuktighet (personlige observasjoner), belysning 21, og tilstedeværelsen av conspecifics (sosialt miljø) 22 alle modulere levetid, og oppmerksomhet å kontrollere disse faktorene i eksperimentet er viktig å unngå skjevhet i resultatene. Mens antall fluer i et hetteglass avtar med tiden, har vi funnet at bruk av anestesi for å justere antall fluer kan øke dødeligheten i en alder-avhengig måte (pletcher, personlige observasjoner), og vi ikke anbefales denne prosedyren. Den nøyaktige posisjonen til ampullene i en inkubator er også en faktor, selv i en tilsynelatende kontrollert miljø. Randomisert fysisk distribusjon av eksperimentelle grupper med kontroller kan redusere skjevhet knyttet hetteglass plassering og er nødvendig for riktig statistisk inferens. Selv mednøye kontrollerte betingelser, kan små forskjeller observeres mellom eksperimenter og bruk av innen-eksperiment kontroller er avgjørende.
Alternative fôring tilnærminger har blitt foreslått for levetid analyse med kapillær mater tilnærming (CAFE metode) 23. Denne metoden er overlegen på evnen til å gi presise målinger av matforbruket, men det resulterer i markant kortvarige fluer 24. Potensielle påkjenninger knyttet til fôring miljøet må vurderes når man vurderer den kombinerte sammenhengen mellom kosthold og genetiske faktorer i den totale levetid.
Demografisk analyse, herunder beregning av survivorship og dødelighet kurver kan avsløre mye informasjon om dynamikken i den aldrende befolkningen. En typisk overlevelseskurve forblir relativt flat i en lang periode tidlig i livet og øke frekvensen av nedgang hos eldre aldre, som tilsvarer en periode med lav dødelighet followed av en periode med en eksponentiell økning i dødeligheten. En stressende miljø vil vanligvis manifest som et overskudd av tidlige dødsfall i befolkningen og en isolert dukkert i overlevelseskurve. Mens et slikt resultat kan indikere signifikante forskjeller mellom behandlinger, vil det normalt ikke være robust overfor replikering. Vi anbefaler derfor at minst to uavhengige (dvs. ikke-samtidige) gjentatte eksperimenter utføres før noen klare konklusjoner er trukket. Det kan være at ekstra innsats mot økt størrelsen på utvalget, kontrollere bruksforholdene, og forbedre helsen foreldrenes aksjer er nødvendig.
Høyre-sensur (fjerning dyr fra forsøket som rømmer eller blir antatt død fra tilfeldige årsaker) av dyr som dør av stressende miljøforhold bør brukes med ekstrem forsiktighet. Strengt tatt må sensurere inntreffer uregelmessig tvers eksperimentelle behandlinger, og om den eksperimentelle interventipå modulerer stresset følsomhet, kunne man utilsiktet søke behandling nivå utvalget til befolkningen. Som en generell regel, unngå tilstedeværelsen av faktorer som kan produsere tvetydige tidlig død (primært knyttet til mat kilde) er bedre enn sensur, og sensureringen skal bare brukes på organismer som ble observert å dø eller flykte under fysisk håndtering.
En endelig vurdering er vurdering av statistisk signifikans. Mens store kohort utvalgsstørrelser gir imponerende kraft å skille små forskjeller mellom behandlinger, må potensialet biologisk betydning av en slik forskjell også bli vurdert. Med rimelig størrelse levetid eksperimenter, forskjeller så lavt som 1-2% er ofte svært statistisk signifikant, men den samlede virkningen av intervensjonen på helsetilstanden kan være mindre. Derfor må både statistisk og biologisk betydning anses ved tolkningen samlede resultatet av eksperimentet. Inferanse om den aldrende prosessen fra overlevelse eksperimenter kan bli utvidet med tiltak av aldersrelaterte reduksjoner i atferdsmessige eller fysiologiske helsetiltak, herunder klatring evne 25 og tarmveggen integritet 7.
I sammendraget, Drosophila modell organisme et attraktivt valg for å studere mekanismer for aldring. Med forsiktig eksperimentell teknikk, kan robuste demografisk analyse gir innsikt i effekten av farmakologiske og genetiske faktorer på aldringsprosessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av midler fra Ellison Medical Foundation (SDP, http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) og NIH R01AG030593 (SDP). Dette arbeidet utnyttet ressursene i Drosophila Aging Core (DAC) av Nathan Shock Center of Excellence i biologi av aldring finansiert av National Institute of Aging P30-AG-013 283 ( http://www.nih.gov/ ). Forfatterne ønsker å takke pletcher Laboratory for personer diskusjoner og spesielt Brian Chung for kritisk lesning av manuskriptet. Vi ønsker å erkjenne Nick Asher og Kathryn Borowicz for å få hjelp med innsamling av data.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Fleishmann’s Yeast | 2192 | |
| Grape Agar Powder Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Large Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Large Replacement End Caps | Genesee Scientific | 59-103 | |
| 6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Flugs Closures for Stock Bottles | Genesee Scientific | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide, Polystrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Flugs Closures for Wide Vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul | Denville Scientific | P1105-CP | |
| Flystuff Flypad, Standard Size | Genesee Scientific | 59-114 | |
| BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow | Fisher Scientific | 10-200-47 | |
| PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 | |
| Gelidium Agar | Mooragar | n/a | |
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals | 0290331280 | |
| Granulated Sugar | Kroger | n/a | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-266 | Fly Food Preservative |
| Propionic Acid, 99% | Acros Organics | 149300025 | Fly Food Preservative |
| Kanamycin Sulfate | ISC BioExpress | 0408-10G | |
| Tetracycline HCl | VWR | 80058-724 |
References
- Toivonen, J. M., et al. No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects. PLoS Genet. 3, e95 (2007).
- Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. Testing an 'aging gene' in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background. Aging Cell. 2, 123-130 (2003).
- Burnett, C., et al. Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila. Nature. 477, 482-485 (2011).
- Bokov, A. F., et al. Does reduced IGF-1R signaling in Igf1r+/- mice alter aging? PLoS One. 6, e26891 (2011).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosophila Information Service. 34, 117-118 (1960).
- Skorupa, D. A., Dervisefendic, A., Zwiener, J., Pletcher, S. D. Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster. Aging Cell. 7, 478-490 (2008).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metab. 14, 623-634 (2011).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 53, 457-481 (1958).
- Pletcher, S. D. Mitigating the Tithonus Error: Genetic Analysis of Mortality Phenotypes. Sci. Aging Knowl. Environ. 2002, pe14 (2002).
- Pletcher, S. D., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Why do life spans differ? Partitioning mean longevity differences in terms of age-specific mortality parameters. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 381-389 (2000).
- Promislow,, Tatar,, Pletcher,, Carey, Below-threshold mortality: implications for studies in evolution, ecology and demography. Journal of Evolutionary Biology. 12, 314-328 (1999).
- Pletcher, Model fitting and hypothesis testing for age-specific mortality data. Journal of Evolutionary Biology. 12, 430-439 (1999).
- Partridge, L., Gems, D. Benchmarks for ageing studies. Nature. 450, 165-167 (2007).
- Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 12602-12607 (2001).
- Ford, D., et al. Alteration of Drosophila life span using conditional, tissue-specific expression of transgenes triggered by doxycyline or RU486/Mifepristone. Exp. Gerontol. 42, 483-497 (2007).
- Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, 927-935 (2002).
- Smith, E. M., et al. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J. Nutr. 137, 2006-2012 (2007).
- Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. J. Insect Physiol. 47, 1301-1307 (2001).
- Bass, T. M., et al. Optimization of dietary restriction protocols in Drosophila. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1071-1081 (2007).
- Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Minis, D. H. Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1537-1539 (1972).
- Joshi, A., Mueller, L. D. Adult crowding effects on longevity in Drosophila melanogaster: Increase in age-dependent mortality. Current Science. 72, 255-260 (1997).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 8253-8256 (2007).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2498-2503 (2008).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
