Summary
Drosophila melanogaster er en kraftfuld model organisme for at udforske den molekylære basis for levetiden regulering. Denne protokol vil diskutere de skridt, der er involveret i at generere en reproducerbar, befolkning-baseret måling af levetiden samt potentielle faldgruber og hvordan man undgår dem.
Abstract
Aldring er et fænomen, der resulterer i steady fysiologiske forringelse af næsten alle organismer i hvilke det er blevet undersøgt, hvilket fører til nedsat fysisk ydeevne og øget risiko for sygdom. Individuel aldring er åbenbart på populationsniveau som en stigning i aldersafhængig dødelighed, som ofte måles i laboratoriet ved at observere levetid i store kohorter af aldersmatchede individer. Eksperimenter, der søger at kvantificere det omfang, hvori genetiske eller miljømæssige manipulationer indvirkning levetid i simple model organismer har været bemærkelsesværdigt vellykkede til forståelse af aspekter ved aldring, som er konserveret på tværs af enheder samt for inspirerende nye strategier til at udvide levetiden og forhindre aldersbetinget sygdom hos pattedyr .
Den eddike flyve, Drosophila melanogaster, er en attraktiv model organisme for at studere de mekanismer af aldring på grund af sin relativt korte levetid, praktisk dyrehold, og letkøbte genetik.Men demografiske foranstaltninger på ældning, herunder alder-specifik overlevelse og dødelighed, er overordentligt modtagelige for selv mindre variationer i eksperimentel design og miljø, og opretholdelse af strenge laboratoriepraksis for varigheden af aldrende eksperimenter er påkrævet. Disse betragtninger, sammen med behovet for at praktisere omhyggelig kontrol af genetisk baggrund, er af afgørende betydning for at skabe robuste målinger. Faktisk er der mange bemærkelsesværdige kontroverser omkring slutning fra levealder forsøg i gær, orme, fluer og mus, der er blevet sporet til miljømæssige eller genetiske artefakter 1-4. I denne protokol, beskriver vi en række procedurer, der er blevet optimeret gennem mange års måling levetid i Drosophila hjælp laboratorium hætteglas. Vi beskriver også anvendelsen af dLife software, som blev udviklet af vort laboratorium og kan hentes ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / software). dLife accelererer throughput og fremmer god praksis ved at indarbejde optimale eksperimenterende design, forenkle flyve håndtering og indsamling af data, og standardisere data analyse. Vi vil også diskutere de mange potentielle faldgruber i design, indsamling, og fortolkning af levetid data, og vi leverer skridt til at undgå disse farer.
Protocol
Vi anbefaler opbevaring af eksperimentelle fødevarer, gær pasta, og drue agarplader, der vises i protokollen ved 4 ° C og bruge dem inden for 1-2 måneder, så længe mug og tørhed ikke har sat i. Standard miljøforhold for både larver og voksne fase involverer opretholdelse af fluer i en inkubator ved 25 ° C med en 12:12 timers lys mørke-cyklus og 60% relativ fugtighed.
1. Fremstilling af Eksperimentel Food
- For larve vækst, bruger vi en modificeret Caltech Medium 5, som er forkortet i denne protokol som CT.
- Vi anbefaler en kost til voksne Drosophila (SY), der består af sukker (saccharose) og gær (lyofiliseret hele ølgær) i en 2% agar base, der er blevet kogt, suppleret med antibiotika og anti-svampemidler og distribueret (10 ml per hætteglas) 6. Fødevarer bør have lov til at størkne og fordampe i 12-24 timer før opbevaring. Fordi næringsstof miljø kan i væsentligligt virkning levetid, konsistens i madlavning processer er afgørende både i et eksperiment, og til sammenligning mellem forsøgene.
- Hvis et farmakologisk middel skal tilsættes til voksne fødevarer, kan dette stof blandes i et lille parti af fødevarer og lagdelt (2 ml) på fødevarer overflade, med kontrol-hætteglas modtager lag indeholdende bærer alene.
2. Fremstilling af en levende gær Paste
Kombiner 5-6 ml vand med 3 g tørgær og bland godt. Konsistensen af gær pasta skal være af en glat jordnøddesmør.
3. Fremstilling af en Grape Agar Plade
- Tilføj en pakke af en drue agar forblanding i 500 ml destilleret vand i en 1.000 ml kolbe, og følg vejledningen på pakken for at opløse den drue agar mix.
- Hæld forsigtigt et tykt lag af blandingen i 100 mm petriskåle og samtidig undgå bobledannelse. En pakke af premix producerer cirka 14 grape-agarplader.
- Lad medierne afkøle og størkne i stuetemperatur med låg på i 15 min. Plader kan opbevares ved 4 ° C, pakket ind i plastik eller anvendes straks.
4. Indsamling af Synkroniserede Æg
Alle medier, der anvendes i denne protokol, dvs gær, drue agarplader, CT og 10% SY mad, skal være ved stuetemperatur.
- Spred en 2-3 cm i diameter lag af gær indsætte på en drue agarplade og der er afsat.
- Sæt en stor indsamling af æg bur på en CO 2-puden med mesh-side ned for at bedøve fluerne. Nitrogen-baserede anæstesi er et alternativ til CO 2, der anvendes af nogle laboratorier, der kan producere resultater af høj kvalitet 7.
- Ved hjælp af en tragt, 150-200 par fluer overføre til ægudtagning bur.
- Anbring drue agarplade at dække den åbne ende af buret og sikres med en endehætte.
- Læg bur på sin side, indtil fluer vågne op.Derefter holde buret, drue agarplade nedad i inkubatoren natten over.
- Den næste dag, bytte den drue plade med en nyligt yeasted drue plade. Kun sættes omkring 1 cm diameter af gær pasta på overfladen af pladen. Kassér 1 st dage drue plade.
- Tillad embryoner at samle på overfladen af den drue agarplade for 16-22 timer. Når det er gjort, indsamle den drue agarplade og kassér de stiftende fluer.
- Vask overfladen af drue agarplader med 1x phosphatpufret saltvand (PBS). Æg kan mobiliseres ved forsigtigt at skrabe med en vatpind. Pas på ikke at ridse, beskadige eller skrabe tynde stykker agar fra overfladen af pladen. Ved hjælp af en tragt hældes de vaskede æg i et 15 ml konisk rør.
- Lad æggene afregne til bunden af røret og hæld supernatanten, være omhyggelig med ikke at miste nogen æg. Den resterende mængde bør være omkring 2-3 ml.
- Tilsættes 8-10 ml PBS til røret og gentage ovennævnte trin 2-3 more tid til grundigt at vaske æg indtil supernatanten er klar. At komme af med resterende gær er nøglen i dette trin.
- Efter vask, dræne al supernatanten indtil resterende volumen er 2 ml. Alikvot 32 pi æg i CT flasker ved hjælp af en bred boring pipettespids. Æg i pipettespidsen skal være kompakt, med lidt at ingen aspireret væske. Dette kan opnås ved at indsætte pipettespidsen dybt ind i ægget afvikling og hurtigt frigive stemplet at aspirere.
- Sted seeded CT flasker tilbage i inkubatoren i hele flue udvikling.
5. Indsamling af aldersmatchede voksne fluer
- Voksne vil typisk eclose fra dag 9 og fremefter. Kassér fluerne, der opstod på den første dag og sted flasker tilbage i inkubatoren natten over. Denne praksis vil undgå utilsigtet selektion for tidlige emergents og giver mulighed for indsamling af et maksimalt antal synkroniserede fluer.
- 16-22 timer senere, overføre daggamle voksen flyver into 10% SY mad flasker. Om nødvendigt kan en anden batch indsamles dagen efter.
- Return flyver tilbage i inkubatoren og tillade fluer at blive kønsmodne og kammerat for to dage. Optag dagen for overførsel til 10% SY flasker som den første dag i voksenalderen.
6. Sortering Fluer og Opsætning Longevity Experiment
- Bedøve små grupper af fluer på bedøvelsesmiddel pad og derefter sortere hanner og hunner i to grupper ved hjælp af en pensel. Hvis du bruger CO 2, er det afgørende at minimere eksponeringen for at forhindre mulige langvarige sundhedsmæssige problemer, der kan kompromittere integriteten af levetiden eksperimentet.
- Placer 30 fluer af samme køn i de enkelte hætteglas. Hvis der ikke indføres Afbalanceringsapparat kromosomer i befolkningen og sund afkom, skal hver flaske producere omkring 3-4 hætteglas af hvert køn. Udportionering fluer i de enkelte hætteglas bør ikke tage mere end 3-4 min, således at der i alt er fluer kun udsat for anæstesi i maksimalt9-10 min.
- Gentag trin 6,1-6,2 indtil der er 8-10 hætteglas replikater for hvert køn og eksperimentel behandling.
7. Opsætning af Excel-regneark til at spore Longevity Experiment
- Vi anbefaler randomisering hætteglas position i stedet for gruppering hætteglas ved eksperimentel betingelse for at undgå skævhed forbundet med hætteglassets placering i inkubatoren, og at tilsløre hætteglasset identitet til eksperimentatoren. For at gøre dette, skal du først tildele et randomiseret numerisk id til hvert hætteglas i et regnearksprogram, så arrangere hætteglassene i bakkerne ved ID-nummer. Hvis du bruger dLife eksperiment management software, følg tutorial på opsætningen af eksperimentet til at generere ID-nummeret for hvert hætteglas.
- (Valgfrit) Hvis du bruger en RFID-læser eller stregkodelæser i forbindelse med dLife, vedhæfte en RFID eller stregkode tag til hvert hætteglas og associere tag med hætteglassets numeriske ID i dLife. Programmet vil genkende hvert hætteglas når scannet med en læserog vejlede en til at registrere data i den korrekte placering i et regneark. Brug af et tag-læser sammen med dLife reducerer dataindsamling tid og registrering fejl.
8. Vedligeholdelse af Longevity Experiment
De hætteglas, der indeholder friske fødevarer bør være ved stuetemperatur for hver overførsel.
- I løbet af forsøgsperioden, der indeholder transfer fluer over på nye flasker frisk mad hver 2 dage (unge kvinder), eller 3 gange om ugen (mænd eller kvinder> 3 ugers alderen). Dette trin vil sikre, at fodring miljø for unge kvinder ikke ødelægges ved tilstedeværelsen af larver. Denne overførsel skal være afsluttet uden bedøvelse, som kan fremkalde akut dødelighed, især hos ældre fluer (Pletcher, personlige observationer).
- Under hvert hætteglas overførsel registrere alder, tælle de døde fluer i den gamle hætteglas, og de døde fluer, der udføres til den nye hætteglas. Notér disse oplysninger særskilt ito kolonner i et regneark (enten dLife eller dit eget regneark). Dette vil sikre, at de transporterede fluer ikke er talt med to gange. Det samlede antal dødsfald (død + gennemført) bør mindst være lig antallet af transporterede fluer fra den tidligere overførsel. Fratræk antallet af tidligere foretaget fluer fra det samlede antal dødsfald for at bestemme antallet af nye dødsfald.
- En flue anses højre censureret, hvis det forlod forsøget forud for naturlig død gennem flugt eller hændelig død. Dyr, der forlader forsøget på denne måde bør opføres i en separat kolonne på den dag, hvor fluen kom ud af forsøget. Censurerede fluer er ikke registreret som død (se nedenfor).
- Fortsæt med at gentage trin 8,1-8,2 indtil den sidste overlevende er død. Vær opmærksom på, at da den fluer alder, kan nogle fluer ligge på ryggen og ser død på grund af deres inactiveness. Derfor når optælling foretaget (døde) fluer, skal du trykke på den side af hætteglassene at afgøre, om der er benbevægelser. Hvis det er tilfældet, THESe fluer er stadig i live. I tilfælde, hvor fluerne bliver hængende til maden i den gamle hætteglas, men i live, bør de ikke medregnes som død og bør reddes ved yderligere at trykke af hætteglasset for at løsne fluen. Censurerer sådanne fluer bør anvendes med forsigtighed, da det kan resultere i eksperimentel bias.
9. Dataanalyse
- Den efterladte kurve viser sandsynligheden for, at en person overlever til en given alder og er typisk beregnet under anvendelse af en Kaplan-Meier-fremgangsmåde (fig. 1) 8. I mangel af højre-censurerede data, kan formlen forenkles således, at aldersspecifikke efterladte i alderen x (S x) bestemmes ved at dividere antallet af personer i live ved starten af en folketælling tid i en alder x (N x) med det samlede antal fluer i eksperimentet (N 0), S x = N x / N 0. 9.2) efterladte kurver er den mest almindelige form for datapræsentation, og dekan testes for ligestilling mellem grupper ved hjælp af en log-rank test. Rimelig slutning kan drages af så få som 50-100 individer i en kohorte. Efterladte er en kumulativ foranstaltning, dog, og derfor dødsfald, der ikke er aldersrelaterede, såsom dem tidligt i livet, vil presse efterladte igennem hele livet gør det vanskeligt at konstatere virkninger er specifikke for aldring.
- En anden data visualisering metode er den aldersspecifikke dødelighed funktion, som viser risikoen for at dø gennem hver alder interval og præsenterer en mere nuanceret beskrivelse af overlevelsesdata 9,10. Dødelighed foranstaltninger er uafhængige af alder til en anden, og formen af doedsfaldskurve er nyttig til slutning om dynamikken i aldring, især når behandlinger er justeret som voksne. Skøn over aldersspecifikke dødelighed, men mangler både præcision og nøjagtighed med små stikprøvestørrelser, og kræver ofte flere-til-mange hundrede individer pr kohorte for en pålidelig esintim 11.
- Andre metoder til vurdering levetid forskelle omfatter parametrisk (f.eks Gompertz) og semi-parametriske (f.eks Cox regression) modeller. Disse modeller kan blive stærke, men bør anvendes med forsigtighed på grund af de antagelser om formen af dødeligheden kurver og arten af behandlingen virkninger, hvilket kan føre til forkert slutning 11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En forenklet ordning af protokollen er vist i figur 1, hvor de vigtigste trin er skitseret. Synkroniseringen del af protokollen kan anvendes til forskellige assays, der kræver aldersmatchede voksne fluer.
Typiske efterladte kurver for vildtype-fluer er vist i figur 2a, ved hjælp af dLife eksperimentet management software (figur 2b, c). Voksne hanner normalt lever kortere, med begge populationer opnå en middelværdi og median levetid på> 50 dage på en 10% SY mad ved 25 ° C. Bemærk, at efterladte forbliver høj i den tidlige del af eksperimentet og falder derefter eksponentielt.
Drosophila levetid påvirkes af miljømæssige betingelser, såsom temperatur og kost. 3a viser, at voksne mænd bor typisk markant kortere som temperaturen forøges. Ligeledes er effekten af diæt på levetiden vist i figur 3b
Tætheden af kohorter under udvikling kan påvirke voksne levetid og ændre udviklingsmæssige timing. Her viser vi et eksempel på, hvordan forskellige tætheder af synkroniserede æg påvirker larvernes udvikling. Som vist i figur 4, voksen flyve udbytte er dårlig og fødevarer overflade er modtagelig for tørring, når antallet af æg er for lav. På den anden ende af spektret er larveudvikling forsinkes i overfyldte flasker, og udbyttet af voksne fluer reduceres.
Den efterladte kurve af kohorten som helhed kan påvirkes betydeligt af anomale hætteglas virkninger, som vist i figur 5. Uregelmæssige overlevelsesdata for de enkelte hætteglas kan have flere årsager, såsom dårlig fødevarekvalitet eller bakteriel / svampe ophobning og infektion. Selv om sådanne unormale dødsfald cen skew befolkningen efterladte foranstaltning, der er ikke en simpel måling for passende at fastslå, at et hætteglas bør udelukkes fra forsøget. Disse situationer er derfor bedst undgås ved god behandlingspraksis og afbødes ved hjælp af en stor stikprøve.
Figur 6 viser eksempler på hætteglas betingelser, der kan føre til afvigende dødsfald. Generelt skal enhver tilstand, der kan føre til små sprækker, hvor fluer kan sætte sig fast og dør undgås. Eksempler indbefatter: bobler i fødevarer, tørhed i fødevaren, der fører til faldende væk fra hætteglassets væg, og revner i fødevaren, er vist i figur 5a (en mild eksempel med en enkelt boble), figur 5b og 5c henholdsvis . Overdrevent tørre fødevarer, som vist i figur 5b og 5c bør omhyggeligt vendes under overførsler, som fødevarer kan løsne og skjule på fluerne i new hætteglas. Bakterievækst på overfladen af fødevaren kan resultere i infektion eller fysiske indfangning og således kan forøge dødeligheden. Nogle bakterier på overfladen af fødevaren synes gennemsigtig og glinsende som om der er sved fra mad (ikke vist), medens andre typer af bakterier vil manifestere sig som hvide kolonier (figur 5d). Hætteglas med nogen af disse betingelser bør bemærkes og behandles yderligere, når dataene fortolkes. Generelt understrege vi, at omhyggelig med dyrehold i både haletudser og voksne stadier kan støtte levetiden og sundhed voksne fluer og reducere forekomsten af problemer fører til uklare dødsårsager senere i livet.
Fig. 1. Simplificeret skematisk afbildning af en Drosophila levetid assay.
Figur 2. (A) Repræsentative levetid kurver w 1118 styring kvinder (cirkler) og mandlige (firkanter) voksne fluer ved 25 ° C på en SY10% fødevarer. (B, C) Repræsentative skærmbilleder af den dLife software.
Figur 3. Virkninger af temperatur (A) og kost (B) på voksne levetid. A. Adult kontrol (Canton S) mandlige fluer blev opretholdt gennem voksenalderen ved 18 ° C, 25 ° C eller 29 ° CB Adult kontrol (w 1118) hun-fluer blev udsat for enten en 15% SY eller 5% SY kost.
Fig. 4. dag 9 i udviklingen (ved 25 ° C) af synkroniserede æg, alikvoteret i CT fødevarer flasker. Vlydstyrken af embryonet-holdige aliquot som vist under hver flaske.
Figur 5. Repræsentant plot fra dLife software viser efterladte efter hætteglas. Pilen angiver en enkelt anomal hætteglas i en gruppe.
Figur 6. Eksempler på suboptimal fødevarekvalitet. A. bobler på mad overflade. B. Food krympet væk fra kanten af hætteglasset. C. Revner i maden. D. Bakterier ophobning på overfladen af fødevaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen præsenteres her beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af reproducerbare målinger af voksne levetid i Drosophila som er passende til vurdering af genetiske, farmakologiske, og miljømæssige tiltag. Afgørende aspekter af protokollen omfatter omhyggelig styring af larveudvikling miljø, minimere voksen stress, og minimerer skævhed tværs forsøgsgrupper og kontroller. Vi præsenterer også brugen af dLife levetid eksperimentet management software. Ved blot at fastgøre en stregkode eller RFID tag til hvert hætteglas, vil dLife programmet hjælpe med dataopsamling for hver måling og plotte efterladte kurven. Selv om det er i øjeblikket mest egnet til studier af flue levetid ved hjælp af hætteglas, kunne dette eksperiment ledelsesværktøj let kan tilpasses til brug i andre organismer, med forskellige typer af befolkningsgrupper kamre, eller for yderligere foranstaltninger for overlevelse, herunder stress modstand og lægemiddeltoksicitet.
Prior påbegyndelse nogen lang levetid vurdering, må man først omhyggeligt styre produktionen af forældrenes bestande. Genetisk variation er en vigtig faktor, som det er sundhed parentale stammer. Disse faktorer har ført til betydelig offentlig polemik i forbindelse med tidlige studier, der rapporterede formodede levetid regulatorer 13. Forskeren har flere muligheder for at minimere effekter tilskrives variation i genetisk baggrund. Til genetiske manipulationer, bør alle genetisk ændrede stammer baggrundskorrigeres-styret gennem enten tilbagekrydsning til en kontrolstamme (mindst 6 gange) eller ved anvendelse af inducerbare systemer (f.eks temperaturfølsomme alleler eller lægemiddel-inducerbar ekspression af transgenet). The GeneSwitch og Tet-on systemer 14,15 er populære og tillader direkte sammenligning af fluer med samme genetiske baggrund, hvor transgenet er enten induceret eller ikke induceres. For alle inducerbare systemer, er passende samtidige kontroller for at undgå confounds forbundet med induceren. Manglende kontrol for genetiske baggrund næsten altid resulterer i krydsningsfrodighed, som kan forlænge levetiden i F1-generationen af en krydsning mellem to forskellige stammer af grunde, som ikke til den tilsigtede manipulation 13. Denne faktor er af særlig betydning ved anvendelse af GAL4-UAS-system. Af miljømæssige interventioner (f.eks narkotikabehandling, kost, temperatur osv.), er det tilrådeligt at studere virkningerne af indsatsen på mere end én stamme. Endelig kan både forældrenes alder 16 og stress 17 påvirke levetiden af F1-generationen, og af denne grund bør raske unge voksne vælges til ægproduktion.
Vigtige aspekter af at styre larve / pupal miljø omfatter forebyggelse af overbelægning og vedligeholdelse af et kontrolleret miljø med streng regulering af lys-mørke perioder, fugt og temperatur. Disse faktorer vil påvirke både timingen af development og den fysiske kvalitet af de resulterende voksne. Uønskede larvestadium miljøer, såsom høj larve densitet, kan føre til aktivering af stress-inducerende faktorer (f.eks varmechokprotein ekspression), som vides at påvirke voksne levetid 18.
I den voksne fase, fortsat er meget omhyggelig med at miljøet væsentligt. Valget af kosten alene kan have stor indflydelse levetid og kan interagere med genetiske faktorer til at producere kost-specifikke virkninger på levealderen. Desuden kan nogle fælles mad base alternativer (gærekstrakt i stedet for frysetørret hele ølgær) dramatisk forkorte levetiden 19, at der åbnes mulighed for, at fødevarer i sig selv er årsag organismal stress, der kan forringe vurdering af levetiden. I denne artikel har vi fremhævet potentielle kilder til stress i kosten miljø, herunder fysiske anomalier i fødevarer (f.eks bobler, skum, revner, bakterier osv.), som kan physically indeslutte dyrene. Løbende udskiftning af gamle fødevarer med friske fødevarer (mindst tre gange hver uge) kan klare mange af disse vanskeligheder. Desuden kan temperatur 20, fugtighed (personlige observationer), belysning 21, og tilstedeværelsen af artsfæller (socialt miljø) 22 alle modulere levetid, og opmærksomhed på at styre disse faktorer i eksperimentet er vigtigt at undgå bias i resultaterne. Mens antallet af fluer i et hætteglas falder med tiden, har vi fundet, at anvendelsen af bedøvelse for at justere antallet af fluer kan øge dødeligheden i en alders-afhængig måde (Pletcher, personlige observationer), og vi mener ikke anbefales denne procedure. Den præcise placering af hætteglassene i en inkubator er også en faktor, selv i en tilsyneladende kontrolleret miljø. Randomiseret fysiske distribution af eksperimentelle grupper med kontrol kan mindske skævhed forbundet med hætteglas placering og er nødvendig for korrekt statistisk inferens. Selv medomhyggeligt kontrollerede betingelser, kan små forskelle iagttages mellem forsøgene og anvendelse af inden-eksperiment kontrol er nødvendig.
Alternative fodring tilgange er blevet foreslået til levetid analyse omfattende en kapillær feeder tilgang (CAFE metode) 23. Denne metode udmærker sig i evnen til at give præcise målinger af fødevareforbrug, men det resulterer i markant kortlivede fluer 24. Potentielle understreger i forbindelse med fodring miljø skal tages i betragtning ved vurderingen af den samlede sammenhæng mellem kost og genetiske faktorer i den samlede levetid.
Demografisk analyse, herunder beregning af efterladte og dødelighed kurver kan afsløre mange oplysninger om dynamikken i den aldrende befolkning. En typisk efterladte kurve vil forblive forholdsvis flad i en lang periode tidligt i livet og øge sin nedgang på ældre aldersklasser, hvilket svarer til en periode med lav dødelighed followed af en periode med en eksponentiel stigning i dødeligheden. En stressende miljø vil normalt manifestere sig som et overskud af tidlige dødsfald i befolkningen og en unormal dukkert i efterladte kurven. Mens et sådant resultat kan indikere signifikante forskelle mellem behandlingerne, vil det normalt ikke være robust over for replikation. Vi anbefaler derfor mindst to uafhængige (dvs. ikke-samtidige) gentagne forsøg udføres, før en endelig konklusion drages. Det kan være, at ekstra indsats mod at øge stikprøvestørrelsen, styre pasningsforhold, og at forbedre sundheden for forældrenes bestande er påkrævet.
Højreklik censurering (fjernelse af husdyr fra det eksperiment, flugt eller formodes at være døde fra tilfældige årsager) af dyr, der dør fra stressende miljøforhold bør anvendes med yderste forsigtighed. Strengt taget skal censurering forekomme tilfældigt på tværs af eksperimentelle behandlinger, og hvis den eksperimentelle interventipå modulerer stress følsomhed, kunne man uforvarende anvende behandling-niveau markering til befolkningen. Som en generel regel, er at undgå tilstedeværelsen af faktorer, der kunne producere tvetydige tidlig død (primært forbundet med den mad kilde) bedre end censur, og censurering bør kun anvendes til organismer, som blev observeret at dø eller flygte under fysisk håndtering.
En sidste overvejelse er vurderingen af statistisk signifikans. Mens store kohorte stikprøvestørrelser giver imponerende kraft til at skelne små forskelle mellem behandlingerne, skal den potentielle biologiske betydning af en sådan forskel også overvejes. Med rimelig størrelse levetid eksperimenter er forskellene så lave som 1-2% ofte meget statistisk signifikant, men den samlede virkning af indsatsen på sundhedsstatus, kan være mindre. Derfor skal både statistisk og biologisk betydning tages i betragtning ved fortolkningen af de samlede resultater af forsøget. Inference om modningen fra overlevelse eksperimenter kan blive forøget ved foranstaltninger af aldersrelaterede fald i adfærdsmæssige eller fysiologisk sundhedsmæssige foranstaltninger, herunder klatring evne 25 og mave væg integritet 7.
Sammenfattende. Drosophila modelorganisme et tiltalende valg for at studere mekanismer af aldring Med omhyggelig eksperimentel teknik, kan robust demografisk analyse give indsigt i konsekvenserne af farmakologiske og genetiske faktorer på modningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler fra Ellison Medical Foundation (SDP, http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) og NIH R01AG030593 (SDP). Dette arbejde udnyttede ressourcerne i Drosophila Aging Core (DAC) af Nathan Shock Center of Excellence i Biologi af de aldrende finansieret af National Institute of Aging P30-AG-013.283 ( http://www.nih.gov/ ). Forfatterne vil gerne takke Pletcher Laboratorium for personer diskussioner og især Brian Chung for kritisk læsning af manuskriptet. Vi vil gerne anerkende Nick Asher og Kathryn Borowicz for assistance med indsamling af data.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Fleishmann’s Yeast | 2192 | |
| Grape Agar Powder Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Large Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Large Replacement End Caps | Genesee Scientific | 59-103 | |
| 6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Flugs Closures for Stock Bottles | Genesee Scientific | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide, Polystrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Flugs Closures for Wide Vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul | Denville Scientific | P1105-CP | |
| Flystuff Flypad, Standard Size | Genesee Scientific | 59-114 | |
| BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow | Fisher Scientific | 10-200-47 | |
| PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 | |
| Gelidium Agar | Mooragar | n/a | |
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals | 0290331280 | |
| Granulated Sugar | Kroger | n/a | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-266 | Fly Food Preservative |
| Propionic Acid, 99% | Acros Organics | 149300025 | Fly Food Preservative |
| Kanamycin Sulfate | ISC BioExpress | 0408-10G | |
| Tetracycline HCl | VWR | 80058-724 |
References
- Toivonen, J. M., et al. No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects. PLoS Genet. 3, e95 (2007).
- Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. Testing an 'aging gene' in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background. Aging Cell. 2, 123-130 (2003).
- Burnett, C., et al. Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila. Nature. 477, 482-485 (2011).
- Bokov, A. F., et al. Does reduced IGF-1R signaling in Igf1r+/- mice alter aging? PLoS One. 6, e26891 (2011).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosophila Information Service. 34, 117-118 (1960).
- Skorupa, D. A., Dervisefendic, A., Zwiener, J., Pletcher, S. D. Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster. Aging Cell. 7, 478-490 (2008).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metab. 14, 623-634 (2011).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 53, 457-481 (1958).
- Pletcher, S. D. Mitigating the Tithonus Error: Genetic Analysis of Mortality Phenotypes. Sci. Aging Knowl. Environ. 2002, pe14 (2002).
- Pletcher, S. D., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Why do life spans differ? Partitioning mean longevity differences in terms of age-specific mortality parameters. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 381-389 (2000).
- Promislow,, Tatar,, Pletcher,, Carey, Below-threshold mortality: implications for studies in evolution, ecology and demography. Journal of Evolutionary Biology. 12, 314-328 (1999).
- Pletcher, Model fitting and hypothesis testing for age-specific mortality data. Journal of Evolutionary Biology. 12, 430-439 (1999).
- Partridge, L., Gems, D. Benchmarks for ageing studies. Nature. 450, 165-167 (2007).
- Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 12602-12607 (2001).
- Ford, D., et al. Alteration of Drosophila life span using conditional, tissue-specific expression of transgenes triggered by doxycyline or RU486/Mifepristone. Exp. Gerontol. 42, 483-497 (2007).
- Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, 927-935 (2002).
- Smith, E. M., et al. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J. Nutr. 137, 2006-2012 (2007).
- Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. J. Insect Physiol. 47, 1301-1307 (2001).
- Bass, T. M., et al. Optimization of dietary restriction protocols in Drosophila. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1071-1081 (2007).
- Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Minis, D. H. Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1537-1539 (1972).
- Joshi, A., Mueller, L. D. Adult crowding effects on longevity in Drosophila melanogaster: Increase in age-dependent mortality. Current Science. 72, 255-260 (1997).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 8253-8256 (2007).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2498-2503 (2008).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
