Summary
Drosophila melanogaster is een krachtige modelorganisme voor het verkennen van de moleculaire basis van de levensduur regelgeving. Dit protocol gaat in op de stappen die betrokken zijn bij het genereren van een reproduceerbare, populatie-gebaseerde meting van de levensduur en mogelijke valkuilen en hoe ze te vermijden.
Abstract
Veroudering is een fenomeen dat resulteert in constante fysiologische achteruitgang in bijna alle organismen waarin het is onderzocht, wat leidt tot verminderde fysieke prestaties en risico van de ziekte vergroot. Individuele veroudering manifesteert zich op populatieniveau als een toename van de leeftijdsafhankelijke sterfte, die vaak wordt in het laboratorium gemeten door het observeren levensduur in grote cohorten van vergelijkbare leeftijd individuen. Experimenten die streven naar de mate te kwantificeren welke genetische of omgevingsfactoren manipulaties invloed levensduur in eenvoudig model organismen zijn opmerkelijk succesvol geweest voor het begrijpen van de aspecten van het ouder worden die aan de overkant van de taxa en voor inspirerende nieuwe strategieën behouden voor de uitbreiding van levensduur en het voorkomen van leeftijd-geassocieerde ziekte bij zoogdieren .
De azijn Drosophila melanogaster, is een aantrekkelijke modelorganisme voor het bestuderen van de mechanismen van veroudering als gevolg van de relatief korte levensduur, handige veeteelt, en facile genetica.De demografische maatregelen van veroudering, zoals leeftijd-overleving en mortaliteit, zijn buitengewoon gevoelig voor zelfs kleine variaties in proefopzet en milieu en handhaving van strikte laboratorium werkwijzen voor de duur van veroudering experimenten vereist. Deze overwegingen, alsmede de noodzaak om zorgvuldige controle van de genetische achtergrond oefenen, zijn essentieel voor het genereren robuuste metingen. Inderdaad, er zijn vele opmerkelijke controverses rond gevolgtrekking uit een lange levensduur experimenten in gist, wormen, vliegen en muizen die zijn terug te voeren op het milieu of genetische artefacten 1-4. In dit protocol beschrijven we een reeks procedures die zijn geoptimaliseerd gedurende vele jaren van het meten van duurzaamheid in Drosophila met behulp van laboratorium flesjes. We beschrijven ook het gebruik van de dLife software die is ontwikkeld door ons laboratorium en is beschikbaar om te downloaden ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / software). dLife versnelt de doorvoer en bevordert goede praktijken door het opnemen van een optimaal experimenteel ontwerp, het vereenvoudigen van vlieg behandeling en het verzamelen van gegevens, en het standaardiseren van data-analyse. We zullen ook ingaan op de vele mogelijke valkuilen in het ontwerp, de verzameling en interpretatie van de levensduur van gegevens, en wij bieden stappen om deze gevaren te voorkomen.
Protocol
We raden opslaan experimenteel voedsel, gist plakken en druif agar platen die in het protocol weergegeven bij 4 ° C en het gebruik ervan in 1-2 jaar mits schimmels en droog niet ingesteld in Standard omgevingsomstandigheden voor zowel de larven en volwassen stadium te betrekken onderhoud van vliegen in een incubator bij 25 ° C met een 12:12 uur licht donker cyclus en 60% relatieve vochtigheid.
1. Voorbereiding van de Experimentele Eten
- Voor larvale groei, gebruiken we een aangepaste Caltech Medium 5, die wordt afgekort in dit protocol als CT.
- We raden een dieet voor volwassen Drosophila (SY) dat bestaat uit suiker (sucrose) en gist (gelyofiliseerde geheel biergist) in een 2% agar base, die is gekookt, aangevuld met antibiotica en antischimmelmiddelen en gedistribueerd (10 ml per flacon) 6. Voedsel moet worden toegestaan om stollen en verdampen gedurende 12-24 uur voorafgaand aan de opslag. Omdat de voeding milieu substantietially invloed levensduur, consistentie in de keuken processen is essentieel, zowel binnen een experiment en voor vergelijking tussen experimenten.
- Als een farmacologisch middel wordt toegevoegd aan de volwassen voer kan dit geneesmiddel worden gemengd in een kleine batch van voedsel en gelaagd (2 ml) op de levensmiddelen oppervlak met controle flesjes opnemende lagen met vehikel alleen.
2. Voorbereiding van een Live Gist Plakken
Combineer 5 tot 6 ml water met 3 g actieve droge gist toe en meng goed. De consistentie van de gist pasta moet zijn dat van een gladde pindakaas.
3. Voorbereiding van een Grape Agar Plate
- Voeg een pakje van een druif agar premix in 500 ml gedestilleerd water in een 1.000 ml kolf en volg de instructies op de verpakking om de druif agar mix te ontbinden.
- Giet een dikke laag van het mengsel in 100 mm petrischaaltjes terwijl het vermijden van de vorming van luchtbellen. Een pakje premix produceert ongeveer 14 grape agarplaten.
- Laat de media afkoelen en stollen bij kamertemperatuur met deksels gedurende 15 min. Platen kunnen worden bewaard bij 4 ° C, verpakt in plastic folie, of onmiddellijk gebruikt.
4. Het verzamelen van Gesynchroniseerde Eieren
Alle media in dit protocol, zoals gist, druif agarplaten, CT en 10% SY voedsel dienen bij kamertemperatuur.
- Spreid een 2-3 cm diameter laagje gist plakken op een druif agar plaat en zet apart.
- Plaats een groot ei collectie kooi op een CO 2 pad met de mesh-kant naar beneden om de vliegen te verdoven. Stikstofhoudende anesthesie is een alternatief voor CO 2, worden door sommige laboratoria, die van hoge kwaliteit resultaten 7.
- Met behulp van een trechter, over te dragen 150 tot 200 paren van vliegen in het ei collectie kooi.
- Plaats de druif agarplaat het open einde van de kooi dekken en een eindkap verzekeren.
- Leg de kooi op zijn kant tot vliegen wakker.Dan, laag te houden de kooi, druif agarplaat kant, in de incubator 's nachts.
- Op de volgende dag, wisselen de druif plaat met een nieuw gegiste druiven plaat. Slechts zet ongeveer 1 cm diameter gist pasta op het oppervlak van de plaat. Gooi de 1e dag druif plaat.
- Toestaan embryo te verzamelen op het oppervlak van de druif agar plaat voor 16-22 uur. Eenmaal gedaan, het verzamelen van de druif agarplaat en gooi de ouders vliegen.
- Was het oppervlak van de druif agarplaten met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Eieren kunnen worden gemobiliseerd door zachtjes te schrapen met een wattenstaafje. Zorg ervoor dat u krassen, beschadiging of schraap dunne stukjes agar van het oppervlak van de plaat. Met behulp van een trechter de gewassen eieren in een 15 ml conische buis.
- Laat de eieren naar de bodem van de buis en giet het supernatant, zorg ervoor dat u geen eieren te verliezen. Het resterende volume moet ongeveer 2-3 ml.
- Voeg 8 tot 10 ml PBS aan de buis en herhaal de bovenstaande stap 2-3 more keer grondig te wassen de eieren totdat het supernatans helder is. Het wegwerken van de resterende gist is de sleutel in deze stap.
- Na het wassen, voer al het supernatant tot resterende volume is 2 ml. Aliquot 32 ul van eieren in CT flessen met behulp van een breed-boring pipetpunt. Eieren in de pipetpunt moet compact, met weinig tot geen vloeistof opgezogen. Dit kan worden bereikt door het plaatsen van de pipetpunt diep in het ei schikking en snel loslaten van de zuiger te zuigen.
- Plaats geplaatste CT bottelt terug in de incubator gedurende vlieg ontwikkeling.
5. Het verzamelen van vergelijkbare leeftijd volwassen vliegen
- Volwassenen zullen doorgaans Eclose vanaf dag 9 verder. Gooi de vliegen die ontstond op de eerste dag en de plaats flessen terug in de incubator 's nachts. Deze praktijk wordt voorkomen dat onbedoeld selectie voor vroege Emergents en zorgen voor het verzamelen van een maximum aantal van gesynchroniseerde vliegen.
- 16 tot 22 uur later, de overdracht van de dag-oude volwassen int vliegto 10% SY voedsel flessen. Indien nodig kan een andere partij worden de volgende dag verzameld.
- Terug vliegt terug in de incubator en laat vliegen tot geslachtsrijpheid en partner te bereiken voor twee dagen. Registreert de datum van overdracht naar 10% SY flessen als de eerste dag van volwassenheid.
6. Sorteren Vliegen en instellen Longevity Experiment
- Verdoof kleine groepen van vliegen op de verdoving pad, dan sorteren mannen en vrouwen in twee groepen met behulp van een penseel. Bij gebruik CO 2, is het essentieel om blootstelling aan mogelijke langdurige gezondheidsproblemen die de integriteit van de levensduur experiment gevaar voorkomen minimaliseren.
- Plaats 30 vliegen van hetzelfde geslacht in individuele flacons. Veronderstelling dat er geen balancer chromosomen in de bevolking en gezond nageslacht, moet elke fles te produceren ongeveer 3-4 flacons van elk geslacht. Aliquoteren vliegen in afzonderlijke flesjes moet niet meer dan 3-4 minuten, zodat in totaal vliegen alleen sprake anesthesie maximaal9-10 min.
- Herhaal de stappen 6,1-6.2 totdat er 8-10 flacon herhalingen voor elk geslacht en experimentele behandeling.
7. Instellen van de Excel-spreadsheet om de Longevity Experiment Track
- Wij raden randomiseren flacon positie in plaats van het groeperen van flesjes met experimentele conditie om vertekening in verband met de flacon locatie in de incubator te voorkomen en om de flacon identiteit verhullen aan de experimentator. Om dit te doen, eerst een gerandomiseerde numerieke ID aan elk flesje in een spreadsheet-programma toe te wijzen, dan regelen de flacons in trays op ID-nummer. Als u gebruik maakt van de dLife experiment management software, volg de tutorial over experiment setup om het ID-nummer voor elke flacon te genereren.
- (Optioneel) Als u gebruik maakt van een RFID-lezer of barcode-lezer in samenwerking met dLife, sluit u een RFID of barcode label aan elk flesje en associëren de tag met numerieke de flacon-ID in dLife. Het programma herkent elke injectieflacon wanneer gescand met een lezeren begeleiden degene die de data op de juiste plaats in een spreadsheet opnemen. Het gebruik van een tag-lezer in combinatie met dLife vermindert aanzienlijk het verzamelen van gegevens en tijd opname fout.
8. Handhaving van de Longevity Experiment
De flesjes met vers voedsel moet op kamertemperatuur zijn voor elke overdracht.
- Tijdens de experimentele periode, de overdracht vliegen naar nieuwe flesjes met vers voedsel om de 2 dagen (jonge vrouwen), of 3 keer per week (mannen of vrouwen> 3 weken oud). Deze stap zorgt ervoor dat de voeding omgeving voor jonge vrouwen niet wordt verstoord door de aanwezigheid van larven. Deze overdracht moet worden ingevuld zonder verdoving, wat kan acute sterfte, vooral bij oudere vliegen (Pletcher, persoonlijke observaties).
- Tijdens elke flacon overdracht op te nemen met de leeftijd, de telling van de dode vliegen in de oude flacon, en de dode vliegen die worden meegenomen naar de nieuwe flacon. Apart opnemen van deze informatie intwee kolommen in een spreadsheet (ofwel dLife of uw eigen spreadsheet). Dit zal ervoor zorgen dat de uitgevoerde vliegen niet dubbel geteld. Het totale aantal doden (dode + uitgevoerd) moet ten minste gelijk zijn aan het aantal vervoerde vliegen uit de vorige overdracht. Trek het aantal voorheen vliegen van het totaal aantal sterfgevallen het aantal sterfgevallen nieuwe bepalen.
- Een vlieg wordt beschouwd als rechts-gecensureerd als het verlaten van het experiment voorafgaand aan de natuurlijke dood door ontsnapping of overlijden door een ongeval. Dieren verlaten van het experiment op deze manier moet worden opgenomen in een aparte kolom op de dag dat de vlieg het experiment verlaten. Censored vliegen worden niet geregistreerd als gestorven (zie hieronder).
- Blijf stappen 8,1-8,2 herhalen totdat de laatste overlevende is dood. Wees ervan bewust dat als de vliegen leeftijd, sommige vliegen kan liggen op hun rug en dood lijken vanwege hun inactiveness. Daarom bij het tellen uitgevoerd (dode) vliegen, tikt u op de zijkant van de flesjes om te bepalen of er beenbewegingen. Als dat zo is, These vliegen zijn nog in leven. In het geval dat vliegen blijven aan het eten in de oude flacon maar levend, mogen ze niet worden geteld als dood en moet worden gered door verdere tikken van de flacon om de vlieg te verjagen. Censureren zoals vliegen moet met voorzichtigheid worden gebruikt omdat het kan leiden tot experimentele bias.
9. Data-analyse
- De overleving curve geeft de kans dat een individuele overleeft een bepaalde leeftijd en wordt typisch berekend met een Kaplan-Meier benadering (figuur 1) 8. In afwezigheid van rechts gecensureerde data, de formule kan worden vereenvoudigd zodat leeftijdsspecifieke overleving op leeftijd x (S x) wordt bepaald door het aantal individuen leven aan het begin van een telling tijd op leeftijd x (N x) door het aantal vliegen in het experiment (N 0) S x = N x / N 0. 9,2) Overlevingspensioen curves zijn de meest voorkomende vorm van gegevensrepresentatie, en zijkunnen worden getest voor de gelijkheid van groepen met behulp van een log-rank test. Redelijke gevolgtrekking kunnen worden getrokken uit zo weinig als 50 tot 100 personen in een cohort. Overleving een cumulatieve maatstaf is dus doden die niet leeftijdsgerelateerde, zoals vroeg in het leven zal overleving druk gehele levensduur waardoor het moeilijk vast te stellen effecten specifieke veroudering.
- Een tweede data visualisatie methode is de leeftijd-specifieke sterfte functie, die het risico van overlijden wordt door elke leeftijd interval en geeft een meer genuanceerde beschrijving van overlevingsgegevens 9,10. Mortaliteit maatregelen zijn onafhankelijk van elkaar leeftijd en de vorm van de respons-curve is nuttig voor gevolgtrekking van de dynamiek van veroudering, vooral wanneer behandelingen worden aangepast op volwassen leeftijd. Schattingen van leeftijd-specifieke sterfte echter aan zowel precisie en nauwkeurigheid met kleine steekproeven, en vereisen vaak een aantal-op-veel honderden mensen per cohort voor een betrouwbare esopnamecapaciteit 11.
- Andere methoden voor het schatten van de levensduur verschillen, omvatten parametrische (bijvoorbeeld Gompertz) en semi-parametrische (bijv. Cox regressie) modellen. Deze modellen kunnen krachtig zijn, maar dient te worden toegepast met de nodige voorzichtigheid als gevolg van de hypotheses over de vorm van de sterfte bochten en de aard van de effecten van de behandeling, wat kan leiden tot onjuiste gevolgtrekking 11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een vereenvoudigde regeling van het protocol wordt in Figuur 1, waar de belangrijkste stappen worden beschreven. De synchronisatie van het protocol kan worden gebruikt voor verschillende assays die dezelfde leeftijd volwassen vliegen vereisen.
Typische curves overleving van wild-type vliegen worden getoond in Figuur 2a, met het dLife experiment management software (figuur 2b, c). Volwassen mannetjes leven meestal korter, met beide populaties het bereiken van een gemiddelde en mediane levensduur van> 50 dagen op een 10% SY eten bij 25 ° C. Merk op dat overleving blijft hoog in het eerste deel van het experiment en dan daalt exponentieel.
Drosophila levensduur wordt beïnvloed door omgevingsfactoren zoals temperatuur en dieet. Figuur 3a toont dat de volwassen mannen meestal aanzienlijk korter leven zoals temperatuur wordt verhoogd. Ook is het effect van voeding op levensduur in figuur 3b
De dichtheid van cohorten tijdens de ontwikkeling kunnen beïnvloeden volwassen levensduur en veranderen ontwikkeling timing. Hier laten we een voorbeeld van hoe verschillende dichtheden van gesynchroniseerde eieren ongunstig kan beïnvloeden larvale ontwikkeling. Zoals getoond in figuur 4, volwassen vlieg rendement slecht en het eten oppervlak gevoelig voor drogen wanneer het aantal eieren te laag. Aan de andere kant van het spectrum, larvale ontwikkelingsachterstand in overbevolkte flessen, en de opbrengst van volwassen vliegen verminderd.
De overleving van de curve cohort als geheel aanzienlijk worden beïnvloed door abnormale vial effecten, zoals weergegeven in figuur 5. Onregelmatige overleving gegevens voor individuele flacons kan verschillende oorzaken hebben, zoals een slechte kwaliteit van het eten of bacteriële / schimmel accumulatie en infectie. Hoewel dergelijke abnormale sterfte ceen scheef de bevolking overleving maatregel, is er geen eenvoudige maatstaf voor de juiste vaststelling dat een injectieflacon dient te worden uitgesloten van het experiment. Deze situaties worden daarom best vermeden door goede handling praktijken en verminderd door het gebruik van een grote steekproef.
Figuur 6 toont voorbeelden van flacon omstandigheden die kunnen leiden tot afwijkende doden. In het algemeen dienen aandoening die kan leiden tot kleine spleten waar vliegen kan komen te zitten en sterven worden vermeden. Voorbeelden zijn: bellen in het voedsel, droogheid in het voedsel dat leidt tot krimpen weg van de flacon wand en barsten in de voeding worden getoond in figuur 5a (een milde voorbeeld met een enkele bel), figuur 5b en figuur 5c respectievelijk . Overmatig droogvoer, zoals weergegeven in figuur 5b en figuur 5c moet zorgvuldig omgedraaid bij de overdracht, omdat het eten kan verjagen en vouwen op de vliegen in de new injectieflacon. Bacteriële groei op het oppervlak van het voedsel kan infectie of fysieke insluiting en kan dus de sterfte. Sommige bacteriën op het oppervlak van het voedsel als transparant en glanzend alsof er vocht uit de voeding (niet getoond), terwijl andere soorten bacteriën zich manifesteren als witte kolonies (Figuur 5d). Flacons die een van deze voorwaarden dient te worden opgemerkt en verder overwogen wanneer de gegevens worden geïnterpreteerd. In het algemeen hebben we dat zorgvuldig aandacht te benadrukken veeteelt in zowel de larvale en volwassen stadia kan bijdragen aan de levensduur en de gezondheid van volwassen vliegen en vermindering van het optreden van problemen die leiden tot dubbelzinnige doodsoorzaken in het latere leven.
Figuur 1. Vereenvoudigd schematisch een Drosophila levensduur assay.
Figuur 2. (A) Vertegenwoordiger levensduur rondingen van w 1118 controle vrouwelijke (cirkels) en mannelijke (vierkanten) volwassen vliegen bij 25 ° C op een SY10% voedsel. (B, C) Vertegenwoordiger screenshots van de dLife software.
Figuur 3. Effecten van temperatuur (A) en voeding (B) op volwassen levensduur. A. Adult control (Canton S) mannelijke vliegen bleven gedurende de volwassenheid bij 18 ° C, 25 ° C of 29 ° CB Adult (W 1118) vrouwtjes werden blootgesteld aan een 15% of 5% SY SY dieet.
Figuur 4. Dag 9 van ontwikkeling (bij 25 ° C) van gesynchroniseerde eieren gealiquoteerd in CT voedsel flessen. Volume van de embryo-bevattende monster wordt zoals onder elke fles.
Figuur 5. Vertegenwoordiger plot van de dLife software met overleving door flacon. De pijl geeft een afwijkende flacon binnen een groep.
Figuur 6. Voorbeelden van suboptimale kwaliteit van het eten. A. Bubbles op het voedsel oppervlak. B. Voedsel gekrompen van de rand van de flacon. C. Scheuren in het voedsel. D. Bacteriën accumulatie op het oppervlak van het voedsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde protocol beschrijft een werkwijze voor reproduceerbare metingen van volwassen levensduur in Drosophila dat kan worden aangepast voor bepaling van de genetische, farmacologische en veranderingen. Cruciale aspecten van het protocol zijn zorgvuldig regelen van de larvale ontwikkeling omgeving, het minimaliseren van volwassen stress, en het minimaliseren van vooroordeel over experimentele groepen en controles. We presenteren ook het gebruik van de dLife levensduur experiment management software. Door simpelweg aanbrengen van een streepjescode of RFID tag aan elk flesje zal het programma dLife helpen data acquisitie voor elke meting en het uitzetten van de curve survivorship. Hoewel het momenteel het meest geschikt voor studies van fly levensduur met flesjes, kan dit experiment beheersinstrument gemakkelijk worden aangepast voor gebruik in andere organismen, met verschillende soorten populatie kamers of aanvullende maatregelen te overleven, zoals stress resistentie en geneesmiddeltoxiciteit.
PRior u begint met het lange levensduur beoordeling, moet men eerst zorgvuldig de controle van de productie van ouderlijke voorraden. Genetische variabiliteit is een belangrijke factor, zoals de gezondheid van ouderstammen. Deze factoren hebben geleid tot grote publieke controverse in verband met de vroege studies die gemeld vermeende levensduur toezichthouders 13. De onderzoeker heeft verschillende opties om effecten toe te schrijven aan variatie in genetische achtergrond te minimaliseren. Voor genetische manipulaties, moeten alle genetisch veranderde stammen zijn achtergrond-gecontroleerd, zowel via terugkruising naar een controle stam (ten minste 6 keer) of met behulp van induceerbare systemen (bv. temperatuur gevoelige allelen of drug-induceerbare transgene expressie). De GeneSwitch en Tet-on systemen 14,15 zijn populaire en laat directe vergelijking van vliegen met dezelfde genetische achtergrond die het transgen ofwel geïnduceerd of niet geïnduceerd. Voor alle induceerbare systemen, zijn geschikte gelijktijdige controles worden uitgevoerd om te voorkomen confounds geassocieerd met de inductor. Niet controleren voor genetische achtergrond bijna altijd tot hybride kracht, die levensduur kan uitstrekken in de F1-generatie van een kruising tussen twee verschillende stammen voor redenen die niets met de beoogde manipulatie 13. Deze factor is van bijzonder belang bij het gebruik van het GAL4-UAS-systeem. Om milieuredenen interventies (bijvoorbeeld behandeling met geneesmiddelen, voeding, temperatuur, etc.), is het raadzaam om de effecten van de interventie op meer dan een stam bestuderen. Tenslotte kunnen beide ouders 16 jaar en stress 17 beïnvloeden de levensduur van de F1-generatie, en daarom, gezonde jonge volwassenen worden gekozen voor de eierproductie.
Belangrijke aspecten van het beheersen van de larven / popstadium omgeving zijn onder andere het voorkomen van overbevolking en het onderhoud van een gecontroleerde omgeving met strikte regulering van licht-donker periodes, vochtigheid en temperatuur. Deze factoren zullen van invloed op zowel de timing van de develing en de fysieke kwaliteit van de resulterende volwassenen. Negatieve larvale omgevingen, zoals hoge dichtheid larvale kan leiden tot activering van stress-induceerbare factoren (bv. heat shock eiwit expressie) waarvan bekend is dat volwassen levensduur beïnvloeden 18.
Tijdens de volwassen fase, aandacht voor het milieu blijft essentieel. De keuze van alleen dieet kan een grote invloed levensduur en kan communiceren met genetische factoren een dieet-specifieke effecten op de levensduur te produceren. Verder kunnen een aantal gemeenschappelijke voedsel basis alternatieven (gistextract in plaats van gevriesdroogde hele biergist) drastisch verkorten levensduur 19, laat de mogelijkheid open dat het voedsel zelf wordt organismale benadrukken dat de beoordeling van een lang leven kan verminderen veroorzaakt. In dit artikel hebben we gewezen op mogelijke bronnen van stress in de voeding-omgeving met inbegrip van fysieke afwijkingen in de voedingsmiddelenindustrie (bijvoorbeeld bellen, schuim, scheuren, bacteriën, enz.) die kunnen physically vangen de dieren. Regelmatige vervanging van oude gerechten met vers voedsel (minstens drie keer per week) kan overwinnen veel van deze problemen. Verder kan de temperatuur 20, vochtigheid (personal waarnemingen), verlichting 21, en de aanwezigheid van soortgenoten (sociale omgeving) 22 Alle moduleren levensduur en aandacht voor beheersing van deze factoren in het experiment is belangrijk om vertekening te voorkomen in de resultaten. Terwijl het aantal vliegen in een flesje tijd afneemt, hebben wij gevonden dat de toepassing van anesthesie om het aantal vliegen te passen kan sterfte in een tijd-afhankelijke wijze (Pletcher, persoonlijke observaties) te verhogen, en we niet aanbevolen deze procedure. De precieze positie van de flesjes in een incubator is een factor, zelfs in een schijnbaar gecontroleerde omgeving. Gerandomiseerde fysieke distributie van experimentele groepen met controles kan beperken vooringenomenheid geassocieerd met flacon plaatsing en is nodig voor een goede statistische inferentie. Zelfszorgvuldig gecontroleerde omstandigheden kunnen kleine verschillen worden waargenomen tussen experimenten en het gebruik van binnen-experiment controles van essentieel belang.
Alternatieve voeding benaderingen zijn voorgesteld levensduur analyse met een capillair feeder benadering (CAFE methode) 23. Deze methode blinkt uit in het vermogen om nauwkeurige metingen van de voedselconsumptie bieden, maar resulteert in aanzienlijk kortstondige vliegen 24. Potentiële spanningen in verband met de voeding milieu moet rekening worden gehouden bij de beoordeling van de gecombineerde relatie tussen voeding en genetische factoren in de totale levensduur.
Demografische analyse, inclusief de berekening van overleving en mortaliteit bochten kan veel informatie onthullen over de dynamiek van de vergrijzing van de bevolking. Een typische nabestaanden curve relatief vlak blijven voor een lange periode in het begin van het leven en het verhogen van de snelheid van achteruitgang op oudere leeftijd, wat overeenkomt met een periode van lage sterfte followed door een periode van een exponentiële toename van de sterfte. Een stressvolle omgeving zal meestal manifesteren als een overmaat aan vroegtijdige sterfgevallen in de bevolking en een afwijkend duik in het overlevingspensioen curve. Hoewel een dergelijk resultaat kan geven significante verschillen tussen behandelingen zal het normaliter niet bestand tegen replicatie. Wij adviseren daarom ten minste twee onafhankelijke (dwz niet-gelijktijdige) repliceren experimenten worden uitgevoerd voordat er harde conclusie worden getrokken. Het kan zijn dat extra inspanningen in de richting van het vergroten van de steekproefomvang, het regelen van de houderijomstandigheden, en het verbeteren van de gezondheid van de ouderlijke voorraden nodig zijn.
Rechts-censureren (het verwijderen van dieren uit het experiment dat ontsnappen of worden verondersteld dood per ongeluk oorzaken) van dieren die sterven aan de stressvolle omgevingsfactoren dient te worden toegepast met uiterste voorzichtigheid. Strikt genomen moet censureren willekeurige plaatsen in experimentele behandelingen, en als de experimentele interventiop moduleert stressgevoeligheid, kan men per ongeluk toe te passen behandeling level selectie aan de bevolking. Als algemene regel, het vermijden van de aanwezigheid van factoren die de dubbelzinnige vroege dood zou kunnen produceren (voornamelijk geassocieerd met de bron van voedsel) is beter dan te censureren, en censureren mag alleen worden toegepast op organismen die werden waargenomen om te sterven of te ontsnappen tijdens fysieke behandeling.
Een laatste overweging is de beoordeling van de statistische significantie. Terwijl de grote cohort steekproeven geven een indrukwekkend vermogen om kleine verschillen tussen de behandelingen te onderscheiden, moet de potentiële biologische betekenis van een dergelijk verschil ook worden overwogen. Met redelijk grote levensduur experimenten, verschillen zo laag als 1-2% zijn vaak zeer statistisch significant, maar het totale effect van de interventie op de gezondheidstoestand kan gering zijn. Daarom moeten zowel statistische en biologische betekenis worden gehouden bij het interpreteren van de algemene resultaten van het experiment. Infeschil over het verouderingsproces van de overleving experimenten kunnen worden aangevuld door maatregelen van aan leeftijd gerelateerde daling van de gedrags-of fysiologische gezondheid maatregelen, met inbegrip van klimvermogen 25 en gastro-intestinale wand integriteit 7.
Kortom, het Drosophila modelorganisme een aantrekkelijke keuze voor het bestuderen mechanismen van veroudering. Met een zorgvuldige experimentele techniek, kunnen robuuste demografische analyse geven inzicht in de invloed van farmacologische en genetische factoren op het verouderingsproces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door financiering van de Ellison Medical Foundation (SDP, http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) en NIH R01AG030593 (SDP). Dit werk van de middelen van de Drosophila Aging Core (DAC) van de Nathan Shock Center of Excellence gebruikt in de biologie van veroudering gefinancierd door het National Institute of Aging P30-AG-013283 ( http://www.nih.gov/ ). De auteurs willen graag de Pletcher Laboratorium bedanken voor nuttige discussies en vooral Brian Chung voor kritisch lezen van het manuscript. Wij willen Nick Asher en Kathryn Borowicz erkennen voor hulp bij het verzamelen van gegevens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Fleishmann’s Yeast | 2192 | |
| Grape Agar Powder Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Large Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Large Replacement End Caps | Genesee Scientific | 59-103 | |
| 6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Flugs Closures for Stock Bottles | Genesee Scientific | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide, Polystrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Flugs Closures for Wide Vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul | Denville Scientific | P1105-CP | |
| Flystuff Flypad, Standard Size | Genesee Scientific | 59-114 | |
| BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow | Fisher Scientific | 10-200-47 | |
| PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 | |
| Gelidium Agar | Mooragar | n/a | |
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals | 0290331280 | |
| Granulated Sugar | Kroger | n/a | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-266 | Fly Food Preservative |
| Propionic Acid, 99% | Acros Organics | 149300025 | Fly Food Preservative |
| Kanamycin Sulfate | ISC BioExpress | 0408-10G | |
| Tetracycline HCl | VWR | 80058-724 |
References
- Toivonen, J. M., et al. No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects. PLoS Genet. 3, e95 (2007).
- Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. Testing an 'aging gene' in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background. Aging Cell. 2, 123-130 (2003).
- Burnett, C., et al. Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila. Nature. 477, 482-485 (2011).
- Bokov, A. F., et al. Does reduced IGF-1R signaling in Igf1r+/- mice alter aging? PLoS One. 6, e26891 (2011).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosophila Information Service. 34, 117-118 (1960).
- Skorupa, D. A., Dervisefendic, A., Zwiener, J., Pletcher, S. D. Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster. Aging Cell. 7, 478-490 (2008).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metab. 14, 623-634 (2011).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 53, 457-481 (1958).
- Pletcher, S. D. Mitigating the Tithonus Error: Genetic Analysis of Mortality Phenotypes. Sci. Aging Knowl. Environ. 2002, pe14 (2002).
- Pletcher, S. D., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Why do life spans differ? Partitioning mean longevity differences in terms of age-specific mortality parameters. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 381-389 (2000).
- Promislow,, Tatar,, Pletcher,, Carey, Below-threshold mortality: implications for studies in evolution, ecology and demography. Journal of Evolutionary Biology. 12, 314-328 (1999).
- Pletcher, Model fitting and hypothesis testing for age-specific mortality data. Journal of Evolutionary Biology. 12, 430-439 (1999).
- Partridge, L., Gems, D. Benchmarks for ageing studies. Nature. 450, 165-167 (2007).
- Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 12602-12607 (2001).
- Ford, D., et al. Alteration of Drosophila life span using conditional, tissue-specific expression of transgenes triggered by doxycyline or RU486/Mifepristone. Exp. Gerontol. 42, 483-497 (2007).
- Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, 927-935 (2002).
- Smith, E. M., et al. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J. Nutr. 137, 2006-2012 (2007).
- Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. J. Insect Physiol. 47, 1301-1307 (2001).
- Bass, T. M., et al. Optimization of dietary restriction protocols in Drosophila. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1071-1081 (2007).
- Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Minis, D. H. Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1537-1539 (1972).
- Joshi, A., Mueller, L. D. Adult crowding effects on longevity in Drosophila melanogaster: Increase in age-dependent mortality. Current Science. 72, 255-260 (1997).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 8253-8256 (2007).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2498-2503 (2008).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
