Summary
Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiges Modell für die Erkundung der molekularen Grundlagen der Langlebigkeit Regulierung. Dieses Protokoll diskutieren die Schritte bei der Erzeugung eines reproduzierbaren, population-based Messung der Lebensdauer sowie potenzielle Fallstricke und wie man sie vermeidet beteiligt.
Abstract
Altern ist ein Phänomen, dass die Ergebnisse im stationären physiologischen Verschlechterung in nahezu allen Organismen, in denen es untersucht wurde, was zu einer verminderten körperlichen Leistungsfähigkeit und Risiko von Krankheiten erhöht. Individuelle Alterung zeigt sich auf der Ebene der Bevölkerung als eine Zunahme der altersbedingten Sterblichkeit, die oft im Labor wird durch die Beobachtung Lebensdauer gemessen in großen Kohorten von gleichaltrigen Personen. Experimente, um das Ausmaß zu quantifizieren versuchen, die genetische oder umweltbedingte Manipulationen Auswirkungen Lebensdauer in einfachen Modellorganismen haben bemerkenswert erfolgreich gewesen für das Verständnis der Aspekte des Alterns, die über Taxa und für inspirierende neue Strategien zur Verlängerung Lebensdauer und Verhinderung altersbedingter-assoziierten Erkrankungen bei Säugetieren konserviert sind .
Der Essig Drosophila melanogaster, ist ein attraktives Modell für die Erforschung der Mechanismen des Alterns aufgrund seiner relativ kurze Lebensdauer, bequem Tierhaltung und einfache Genetik.Allerdings sind demografische Maßnahmen des Alterns, einschließlich des Alters-spezifische Überleben und Mortalität, außerordentlich anfällig für selbst geringfügige Abweichungen in der experimentellen Gestaltung und Umwelt und die Erhaltung der strengen Laborpraxis für die Dauer des Alterns Experimente erforderlich. Diese Überlegungen, zusammen mit der Notwendigkeit, eine genaue Steuerung des genetischen Hintergrund zu praktizieren, sind essentiell für die Erzeugung robuste Messungen. Tatsächlich gibt es viele bemerkenswerte Kontroversen um Folgerung aus Langlebigkeit Experimente in Hefe, Würmern, Fliegen und Mäusen, die Umwelt oder genetische Artefakte 1-4 wurden verfolgt. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Reihe von Verfahren, die über viele Jahre Vermessung Langlebigkeit in Drosophila mit Labor-Fläschchen optimiert wurden. Wir beschreiben auch die Verwendung des dLife Software, die in unserem Labor entwickelt wurde und steht zum Download (erhältlich http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / Software). dLife beschleunigt den Durchsatz und fördert gute Praktiken, indem optimale Versuchsplanung, Vereinfachung fly Handhabung und Datenerfassung und Standardisierung von Daten-Analyse. Wir diskutieren auch die vielen Fallstricke in der Entwicklung, Sammlung und Interpretation der Lebensdauer von Daten, und wir bieten vor, um diese Gefahren zu vermeiden.
Protocol
Wir empfehlen die Lagerung experimentellen Lebensmittel, Hefepaste und Trauben Agarplatten, die im Protokoll erscheinen bei 4 ° C und mit ihnen innerhalb von 1-2 Monaten, solange Form und Trockenheit nicht in. Norm Umgebungsbedingungen sowohl für die Larven und erwachsenen gesetzt inszenieren beinhalten Wartung von Fliegen in einem Brutschrank bei 25 ° C mit einem 12:12 h Licht-Dunkel-Zyklus und 60% relativer Luftfeuchtigkeit.
Ein. Vorbereitung für Experimentelle Küche
- Für Larvenwachstum, verwenden wir eine modifizierte Caltech Medium 5, das abgekürzt wird in diesem Protokoll als CT.
- Wir empfehlen eine Ernährung für erwachsene Drosophila (SY), das aus Zucker (Saccharose) und Hefe (lyophilisiert ganzen Bierhefe) in einer 2% Agar-Basis, die gekocht worden ist, mit Antibiotika und Anti-Pilz-Mittel ergänzt besteht, und verteilt (10 ml pro Fläschchen) 6. Lebensmittel sollten erstarren gelassen und verdampfen für 12-24 Stunden vor der Lagerung werden. Weil der Nährstoff-Umgebung kann substanWesentlichen Einfluss Langlebigkeit, Konsistenz Garverfahren ist sowohl innerhalb eines Experiments und zum Vergleich zwischen den Experimenten unerlässlich.
- Wenn ein pharmakologisches Mittel ist, um zu der erwachsenen Lebensmitteln zugesetzt werden, kann dieses Arzneimittel in einer kleinen Charge von Nahrungsmitteln und geschichtet (2 ml) auf die Nahrungsmitteloberfläche mit Kontrollfläschchen Empfangen enthaltenden Schichten Vehikel gemischt werden.
2. Vorbereitung einer Live Hefepaste
Kombinieren Sie 5-6 ml Wasser mit 3 g Trockenhefe und gut mischen. Die Konsistenz des Hefepaste muss die für eine glatte Erdnussbutter sein.
3. Vorbereitung eines Grape Agarplatte
- Fügen Sie ein Paket von einer Traube Agar Vormischung in 500 ml destilliertem Wasser in einem 1.000 ml-Flasche und folgen Sie den Anweisungen auf der Packung, um die Trauben Agar Mix auflösen.
- Füllen Sie vorsichtig eine dicke Schicht des Gemisches in 100 mm Petrischalen unter Vermeidung Blasenbildung. Ein Paket von Premix produziert rund 14 grape Agarplatten.
- Lassen Sie die Medien abkühlen und erstarren bei Raumtemperatur mit Deckel für 15 min. Platten können bei 4 ° C aufbewahrt werden, eingewickelt in Plastikfolie oder sofort verwendet werden.
4. Sammlung Synchronisiertes Eggs
Alle Medien in diesem Protokoll verwendet, dh Hefe, Trauben Agarplatten, CT und 10% SY Lebensmittel sollte Raumtemperatur haben.
- Verteilen Sie eine 2-3 cm Durchmesser aus Hefe auf einer Traube Agarplatte fügen und beiseite stellen.
- Legen Sie ein großes Ei Sammlung Käfig auf einer CO 2-Pad mit dem Mesh-side down, um die Fliegen zu betäuben. Stickstoff-Narkose ist eine Alternative zu CO 2, von einigen Laboratorien, die qualitativ hochwertige Ergebnisse können 7.
- Mit einem Trichter, übertragen 150-200 Paar fliegt in der Eizellenentnahme Käfig.
- Legen Sie die Trauben Agarplatte das offene Ende des Käfigs an und sichern mit einer Endkappe.
- Legen Sie den Käfig auf seiner Seite, bis Fliegen aufwachen.Dann halten Sie den Käfig, Trauben Agarplatte Seite nach unten in den Inkubator über Nacht.
- Am nächsten Tag, tauschen die Traube Platte mit einem neu enthefte Trauben Platte. Nur setzen ca. 1 cm Durchmesser von Hefe Paste auf die Oberfläche der Platte. Entsorgen Sie den 1. Tag Trauben Platte.
- Erlauben Embryonen auf der Oberfläche der Traube Agarplatte für 16-22 h sammeln. Ist das erledigt, sammeln die Trauben Agarplatte und entsorgen Sie die Muttergesellschaft Fliegen.
- Waschen Sie die Oberfläche der Trauben Agarplatten mit 1x Phosphate Buffered Saline (PBS). Eier können durch vorsichtiges Schaben mit einem Wattestäbchen mobilisiert werden. Achten Sie darauf, nicht zu kratzen, Schäden oder kratzen dünne Stücke von Agar von der Oberfläche der Platte. Mit Hilfe eines Trichters, gießen die gewaschenen Eier in einem 15 ml konischen Röhrchen.
- Lassen Sie die Eier in den Boden des Röhrchens absetzen und giesst die überstehende, man aufpassen, nicht alle Eier verlieren. Das verbleibende Volumen sollte ca. 2-3 ml betragen.
- Hinzufügen von 8 bis 10 ml PBS mit dem Rohr und die vorgenannten Schritte wiederholen 2-3 more mal gründlich zu waschen, die Eier, bis der Überstand klar ist. Loswerden von Resthefe ist der Schlüssel in diesem Schritt.
- Nach dem Waschen, abtropfen alle Überstand bis Restvolumen beträgt 2 ml. Aliquot 32 ul von Eiern in CT-Flaschen mit einem breiten Bohrung Pipettenspitze. Eier in der Pipettenspitze sollte kompakt, mit wenig bis gar keine Flüssigkeit angesaugt. Dies kann durch Einführen der Pipettenspitze tief in das Ei Besiedlung und schnell freisetzende den Kolben zum Ansaugen erreicht werden.
- Ort seeded CT Flaschen zurück in den Inkubator ganzen fly Entwicklung.
5. Sammlung Alter abgestimmten erwachsenen Fliegen
- Erwachsene werden in der Regel vom ersten Tag schlüpfen 9 weiter. Entsorgen Sie die Fliegen, die am ersten Tag und Ort Flaschen entstand wieder in den Inkubator über Nacht. Diese Praxis wird versehentliche Auswahl für Anfang Emergenzen vermieden werden und für die Sammlung von einer maximalen Anzahl von synchronisierten Fliegen.
- 16-22 Stunden später, übertragen die Tage alten Erwachsenen fliegt into 10% SY Lebensmitteln Flaschen. Bei Bedarf können weitere Charge gesammelt am nächsten Tag.
- Zurück fliegt zurück in den Inkubator und ermöglichen Fliegen bis zur Geschlechtsreife und paaren sich für zwei Tage zu erreichen. Notieren Sie sich den Tag der Überweisung auf 10% SY-Flaschen als der erste Tag des Erwachsenseins.
6. Sortierung Flies und Einrichten Longevity Experiment
- Anesthetize kleine Gruppen von Fliegen auf der Narkose-Pad, dann sortieren Männer und Frauen in zwei Gruppen mit einem Pinsel. Wenn unter Verwendung von CO 2 ist es kritisch, um die Exposition gegenüber möglichen langanhaltende Gesundheitsfragen, die die Integrität der Langlebigkeit Experiment kompromittieren kann verhindern minimieren.
- Platz 30 Fliegen des gleichen Geschlechts in einzelne Ampullen. Vorausgesetzt, ohne Balancer-Chromosomen in der Bevölkerung und gesunde Nachkommen, sollte jede Flasche etwa 3-4 Fläschchen jedes Geschlecht zu produzieren. Aliquotieren Fliegen in einzelne Ampullen sollte nicht mehr als 3-4 min, so daß im gesamten, Fliegen nur auf die Anästhesie für maximal belichteten9-10 min.
- Wiederholen Sie die Schritte, bis 6,1-6,2 gibt es 8-10 Fläschchen Wiederholungen für jedes Geschlecht und experimentelle Therapie.
7. Einrichten der Excel-Tabelle, um die Langlebigkeit Experiment verfolgen
- Wir empfehlen Randomisieren Fläschchen Position anstatt Gruppieren Vials durch experimentelle Bedingung, um schräg in der Phiole Lage im Inkubator einhergehen, zu vermeiden und um das Fläschchen Identität zu der Experimentator verdunkeln. Dazu weisen Sie zunächst eine randomisierte numerische ID zu jedem Fläschchen in einem Tabellenkalkulations-Programm, dann ordnen Sie die Fläschchen in Schalen von ID-Nummer. Wenn Sie die dLife Experiment-Management-Software, befolgen Sie die Anleitung zum Versuchsaufbau, um die ID-Nummer für jedes Fläschchen zu generieren.
- (Optional) Wenn Sie einen RFID-Leser oder Barcode-Leser in Zusammenarbeit mit dLife sind, schließen Sie einen RFID-oder Barcode-tag in jedes Fläschchen und ordnen Sie den Tag mit der Ampulle die numerische ID in dLife. Das Programm erkennt jedes Fläschchen, wenn sie mit einem Lesegerät gescanntund leiten ein, um die Daten an der richtigen Stelle in einer Tabelle aufgezeichnet. Die Nutzung eines Tag-Lesegerät in Verbindung mit dLife reduziert Datenerfassung Zeit und Fehler bei der Aufzeichnung.
8. Aufrechterhaltung der Longevity Experiment
Die Fläschchen mit frischen Lebensmitteln sollte bei Raumtemperatur für jeden Transfer sein.
- Während der Versuchsphase, die Übertragung Fliegen auf neue Flaschen frischen Lebensmitteln alle 2 Tage (junge Frauen), oder 3 mal pro Woche (Männchen oder Weibchen> 3 Wochen alt). Dieser Schritt stellt sicher, dass das Zuführen Umgebung für junge Frauen nicht durch das Vorhandensein von Larven gestört. Dieser Transfer sollte ohne Narkose abgeschlossen werden, was akute Mortalität verursachen, besonders bei älteren Fliegen (Pletcher, persönliche Beobachtungen).
- Während jedes Fläschchen übertragen, aufzeichnen das Alter, zählt die toten Fliegen in der alten Flasche, und die toten Fliegen, die auf die neue Flasche durchgeführt werden. Notieren Sie diese Informationen separat inzwei Spalten in einer Tabelle (entweder dLife oder eigene Tabellenkalkulation). Dadurch wird sichergestellt, dass die durchgeführten Fliegen nicht doppelt gezählt. Die Gesamtzahl der Todesfälle (dead + durchgeführt) sollte mindestens gleich der Anzahl der durchgeführten Fliegen aus dem letzten Transfer. Subtrahieren der Anzahl von zuvor durchgeführten entfernt von der gesamten Zahl von Todesfällen, die Zahl der Todesfälle neuen zu bestimmen.
- Eine Fliege gilt rechten zensiert, wenn es das Experiment links vor dem natürlichen Tod durch Flucht oder Tod durch Unfall. Tiere verlassen das Experiment auf diese Weise sollten in einer separaten Spalte am Tag eingetragen werden, dass die Fliege das Experiment beendet. Censored Fliegen sind nicht so tot (siehe unten) aufgezeichnet.
- Weitere Schritte 8,1-8,2 wiederholen, bis der letzte Überlebende tot ist. Seien Sie sich bewusst, dass als Fliegen Alter, einige Fliegen kann auf dem Rücken liegen und erscheinen Toten wegen ihrer Untätigkeit. Daher, wenn das Zählen durchgeführt (toten) entfernt, auf der Seite der Phiolen, um zu bestimmen, ob es Beinbewegungen sind erschließen. Wenn ja, these Fliegen sind noch am Leben. In dem Fall, dass Fliegen zum Essen in der alten Flasche aber lebendig stecken bleiben, sollten sie nicht als tot gezählt werden und sollte durch weitere Erschließung des Fläschchens, die Fliege vertreiben gerettet werden. Zensur wie Fliegen sollten mit Vorsicht verwendet werden, da sie in der experimentellen Bias führen kann.
9. Data Analysis
- Die Hinterbliebenenpension Kurve zeigt die Wahrscheinlichkeit, dass eine Person zu einem bestimmten Alter überlebt und wird in der Regel unter Verwendung einer Kaplan-Meier-Ansatz (Abbildung 1) 8. In Abwesenheit von rechten zensierten Daten, die Formel kann, so dass altersspezifischen Überlebensrate im Alter x (S x) wird vereinfacht werden, indem die Zahl der Individuen lebendig zu Beginn der Zählung einer Zeit im Alter x (N x) bestimmt durch die Gesamtzahl von Fliegen im Experiment (N 0), S N x = x / N 0. 9,2) Survivorship Kurven sind die häufigste Form der Präsentation der Daten, und siekann für die Gleichstellung zwischen den Gruppen mit einer log-rank-Test geprüft werden. Angemessene Schlussfolgerung kann aus so wenig wie 50-100 Personen in einer Kohorte gezogen werden. Survivorship ist ein kumulatives Maß, aber, und daher Todesfällen, die nicht altersbedingten, wie diejenigen, früh im Leben, wird Überlebensrate während der gesamten Lebensdauer drücken macht es schwierig, festzustellen, spezifische Auswirkungen auf Alterung.
- Eine zweite Datenvisualisierung Methode ist die altersspezifischen Sterblichkeit Funktion, die das Risiko des Sterbens zeigt durch jedes Alter Intervall und stellt eine differenziertere Beschreibung der Überlebensdaten 9,10. Mortalität Maßnahmen sind unabhängig von einem Zeitalter zum anderen, und die Form des Mortalitätskurve ist nützlich für Inferenz über die Dynamik der Alterung, insbesondere bei Anwendungen im Erwachsenenalter eingestellt sind. Schätzungen der altersspezifischen Sterblichkeit, jedoch fehlt die Präzision und Genauigkeit, mit kleinen Stichproben und erfordern oft mehrere-zu-viele Hunderte von Personen pro Kohorte für eine zuverlässige estimate 11.
- Andere Methoden zur Schätzung Langlebigkeit Unterschiede sind parametrische (zB Gompertz) und semi-parametrischen (z. B. Cox-Regression) Modelle. Diese Modelle können leistungsfähige, aber sollten mit Vorsicht wegen der Annahmen über die Gestalt der Kurven Mortalität und der Art der Behandlung Effekte, die zu falschen Folgerung 11,12 führen könnten, aufgebracht werden.
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Representative Results
Ein vereinfachtes Schema des Protokolls ist in Abbildung 1, wo wichtige Schritte skizziert vorgestellt. Die Synchronisation Teil des Protokolls können für verschiedene Assays, altersangepassten erwachsenen Fliegen erfordern.
Typische Überlebensrate Kurven von Wildtyp-Fliegen sind in Abbildung 2a dargestellt, mit dem dLife Experiment-Management-Software (Abb. 2b, c). Erwachsene Männchen leben meist kürzer, beide Populationen erreichen einen Mittelwert und Median Langlebigkeit> 50 Tage auf einem 10% SY Lebensmitteln bei 25 ° C. Beachten Sie, dass Hinterbliebene hoch in den frühen Teil des Experiments bleibt und fällt dann exponentiell.
Drosophila Lebensdauer wird durch die Umgebungsbedingungen, wie Temperatur und Ernährung beeinflusst. Abbildung 3a zeigt, dass erwachsene Männer leben typischerweise deutlich kürzer als Temperatur erhöht wird. Ebenso wird die Wirkung von Ernährung auf Lebenszeit in 3b präsentiert
Die Dichte von Kohorten während der Entwicklung beeinflussen können erwachsene Lebensdauer und verändern Entwicklungsstörungen Timing. Hier zeigen wir ein Beispiel, wie unterschiedliche Dichten von synchronisierten Eier beeinflussen Larvalentwicklung. Wie in 4 gezeigt, ist erwachsenen Fliege Ausbeute schlecht und die Nahrungsmitteloberfläche ist anfällig für Trocknung, wenn die Anzahl der Eier zu niedrig ist. Am anderen Ende des Spektrums ist Larvalentwicklung in überfüllten Flaschen verzögert, und die Ausbeute an adulten Fliegen reduziert wird.
Die Überlebensrate Kurve der Kohorte als Ganzes kann signifikant durch anomale Fläschchen Effekte beeinflusst werden, wie in Abbildung 5 dargestellt. Unregelmäßige Überlebensdaten für die einzelnen Fläschchen kann mehrere Ursachen haben, wie schlechte Qualität der Lebensmittel oder Bakterien / Pilz Akkumulation und Infektion. Während solche anomale Todesfälle cein skew die Bevölkerung Überleben Maßnahme gibt es keine einfache Metrik für angemessen Bestimmung, dass ein Fläschchen aus dem Experiment ausgeschlossen werden sollte. Diese Situationen werden daher am besten durch eine gute Handhabung zu vermeiden und gemildert durch Verwendung eines großen Stichprobengröße.
Abbildung 6 zeigt Beispiele des Fläschchens Bedingungen, die anomale Todesfällen führen kann. Im Allgemeinen sollte eine Bedingung, die kleinere Spalten wo Fliegen steckenbleiben führen kann und sterben vermieden werden. Beispiele umfassen: Blasen in der Lebensmittelindustrie, Trockenheit im Lebensmittelbereich, die zu schrumpfende auswärts aus dem Fläschchen Wand und Rissbildung in der Lebensmittel führt in 5a (ein mildes Beispiel mit einer einzigen Blase), Figur 5b und 5c gezeigt sind, jeweils . Übermäßig trockene Lebensmittel, wie in Abbildung 5b und 5c gezeigt sollten sorgfältig umgedreht bei der Übertragung, wie das Essen kann zu vertreiben und auf die Fliegen in der n zusammenbrechenew Fläschchen. Bakterienwachstum auf der Oberfläche des Lebensmittels zu Infektionen oder physikalischen Einschluss und damit verursachte Sterblichkeit erhöhen. Einige Bakterien auf der Oberfläche des Lebensmittels erscheinen transparent und glänzend als gäbe es Schweiß aus dem Futter (nicht dargestellt), während andere Arten von Bakterien manifestieren wird als weiße Kolonien (5d). Durchstechflaschen eine dieser Bedingungen zu beachten und weiter berücksichtigt werden, wenn die Daten interpretiert werden. Im Allgemeinen möchten wir betonen, dass eine sorgfältige Aufmerksamkeit auf Tierhaltung in den beiden Larven und adulte Stadien unterstützen die Langlebigkeit und Gesundheit der erwachsenen Fliegen und reduziert das Auftreten von Problemen, die zu mehrdeutigen Todesursachen im späteren Leben.
Abbildung 1. Vereinfachte schematische Darstellung einer Drosophila Lebensdauer Assay.
Abbildung 2. (A) Repräsentative Lebensdauer Kurven w 1118 Steuerung weiblich (Kreise) und männlichen (Quadrate) erwachsenen Fliegen bei 25 ° C auf einem SY10% Lebensmitteln. (B, C) Vertreter Screenshots des dLife Software.
Abbildung 3. Auswirkungen der Temperatur (A) und Futter (B) an adulten Lebensdauer. A. Adult Steuerelement (Kanton S) männliche Fliegen wurden bis zum Erwachsenenalter bei 18 ° C gehalten wird, 25 ° C oder 29 ° CB Adult Regelung (w 1118) weibliche Fliegen wurden entweder mit einem 15% oder 5% SY SY Nahrung auf.
Abbildung 4. Tag 9 der Entwicklung (bei 25 ° C) von synchronisierten Eier, in CT Lebensmitteln Flaschen aliquotiert. Volumen des Embryos-haltigen Aliquot wird als unter jeder Flasche gezeigt.
Abbildung 5. Vertreter Grundstück aus dem dLife Software zeigt Überlebensrate von Fläschchen. Der Pfeil zeigt eine einzelne Ampulle anomalen innerhalb einer Gruppe.
Abbildung 6. Beispiele für suboptimal Lebensmittelqualität. A. Blasen auf die Lebensmittelindustrie Oberfläche. B. Lebensmittel weg von der Kante des Fläschchens geschrumpft. C. Risse in der Nahrung. D. Bakterien Anreicherung an der Oberfläche des Nahrungsmittels.
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Discussion
Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung reproduzierbare Messungen von erwachsenen Langlebigkeit in Drosophila die anpassungsfähig zur Beurteilung von genetischen, pharmakologischen und Umweltinterventionen ist. Zentrale Aspekte des Protokolls sind sorgfältige Kontrolle der Larven Entwicklungsumgebung, die Minimierung Erwachsenen Stress und minimieren Vorspannung über experimentelle Gruppen und Kontrollen. Außerdem stellen wir die Verwendung des dLife Lebensdauer Experiment Verwaltungssoftware. Durch einfaches Anbringen eines Barcodes oder RFID-Tag zu jedem Gefäß, wird das Programm in dLife Datenerfassung für jede Messung zu unterstützen und in Auftragen der Überlebensrate Kurve. Während es derzeit am besten geeignet ist für die Untersuchung von fly Lebensdauer mit Fläschchen, könnte dieses Experiment-Management-Tool leicht für die Verwendung in anderen Organismen angepasst werden, mit verschiedenen Arten der Bevölkerung Kammern, oder für zusätzliche Maßnahmen das Überleben einschließlich der Stressresistenz und Drogen Toxizität.
Prior Antritt der Langlebigkeit Beurteilung, muss man zunächst sorgfältig kontrollieren die Produktion von Stammpflanzen. Genetische Variabilität ist ein wichtiger Faktor, da die Gesundheit der elterlichen Stämme. Diese Faktoren haben zu erheblichen öffentlichen Kontroverse mit früheren Studien, die mutmaßliche Lebensdauer Aufsichtsbehörden gemeldet 13 zugeordnet geführt. Der Forscher hat mehrere Möglichkeiten, um Effekte aus Schwankungen der genetischen Hintergrund zu minimieren. Für genetische Manipulationen sollten alle genetisch veränderte Stämme werden entweder durch Rückkreuzen mit einer Steuereinheit Stammhintergrund-gesteuert (mindestens 6 mal) oder mit induzierbare Systeme (beispielsweise temperaturempfindliche Allele oder Drogen-induzierbaren Transgenexpression). Die GeneSwitch und Tet-On-Systeme 14,15 sind sehr beliebt und ermöglichen den direkten Vergleich von Fliegen mit der gleichen genetischen Hintergrund in denen das Transgen entweder induziert wird oder nicht induziert. Für alle induzierbare Systeme sind geeignete vorübergehenden Kontrollen erforderlich, um confou vermeidennds mit dem Induktor verbunden. Failure für genetische Hintergrund fast immer kontrollieren Ergebnisse in Hybrid-Kraft, die Lebenserwartung in der F1-Generation aus einer Kreuzung zwischen zwei verschiedenen Stämmen aus Gründen unabhängig von der beabsichtigten Manipulation 13 erstrecken kann. Dieser Faktor ist von besonderer Bedeutung bei der Verwendung der GAL4-UAS-System. Aus Umweltschutzgründen Interventionen (zB, Behandlung, Diät, Temperatur etc.), ist es ratsam, die Wirkungen der Intervention auf mehr als einem Stamm studieren. Schließlich können sowohl die elterliche Alter von 16 Jahren und Stress 17 Einfluss auf die Langlebigkeit der F1-Generation, und aus diesem Grund, gesunden jungen Erwachsenen sollten für die Eiererzeugung gewählt werden.
Wichtige Aspekte der Steuerung der Larven / Puppen Umfeld gehören die Vermeidung von Überbelegung und die Aufrechterhaltung einer kontrollierten Umgebung mit strengen Regulierung der Hell-Dunkel-Perioden, Luftfeuchtigkeit und Temperatur. Diese Faktoren beeinflussen sowohl das Timing development und die physikalische Qualität der resultierenden Erwachsenen. Unerwünschte larvalen Umgebungen, wie hohe Larvendichte kann, um die Aktivierung von Stress-induzierbaren Faktoren (zB Hitzeschock-Protein-Expression), die bekanntermaßen zu beeinflussen erwachsenen Langlebigkeit 18 führen.
Während der erwachsenen Phase bleibt Aufmerksamkeit für die Umwelt wichtig. Die Wahl der Diät allein kann einen großen Einfluss auf Lebensdauer und können mit genetischen Faktoren zu Diät-spezifischen Auswirkungen auf die Lebensdauer zu produzieren interagieren. Darüber hinaus können einige gemeinsame Nahrungsgrundlage Alternativen (Hefe anstelle von gefriergetrockneten ganzen Brauhefeextrakt) drastisch verkürzen Lebensdauer 19, so dass die Möglichkeit offen, dass das Essen selbst verursacht organismal Stress, die zur Beurteilung der Langlebigkeit beeinträchtigen kann. In diesem Artikel haben wir potenzielle Quellen von Stress in der Diät-Umgebung einschließlich der körperlichen Anomalien in der Lebensmittelindustrie (zB Blasen, Schaum, Risse, Bakterien usw.), kann P markierthysically einfangen der Tiere. Regelmäßiger Austausch der alten Küche mit frischen Lebensmitteln (mindestens drei Mal pro Woche) kann viele dieser Schwierigkeiten. Weiterhin können Temperatur 20, Luftfeuchtigkeit (persönliche Beobachtung), Beleuchtung 21, und die Anwesenheit von Artgenossen (soziales Umfeld) 22 alle modulieren Lebensdauer und Aufmerksamkeit Steuerung dieser Faktoren im Rahmen des Tests ist wichtig, um Verzerrung der Ergebnisse zu vermeiden. Während die Zahl der Fliegen in einem Fläschchen mit der Zeit abnimmt, haben wir festgestellt, dass die Anwendung von Betäubungsmitteln, um die Anzahl der Fliegen einstellen Mortalität in einem vom Alter abhängigen Weise (Pletcher, persönliche Beobachtungen) zu erhöhen, und wir wissen nicht dieses Verfahren empfohlen. Die genaue Position der Röhrchen in einem Inkubator ist auch ein Faktor, auch in einer scheinbar kontrollierten Umgebung. Randomized physische Distribution der experimentellen Gruppen mit Kontrollen können zu mildern Vorspannung mit Fläschchen Platzierung zugeordnet und ist für die ordnungsgemäße statistische Inferenz erforderlich. Selbst mitsorgfältig kontrollierten Bedingungen, können geringfügige Unterschiede zwischen den Experimenten beobachtet werden, und die Verwendung innerhalb von Experiment-Kontrollen notwendig.
Alternative Fütterung Ansätze zur Lebensdauer Analyse einschließlich einer Kapillare Feeder Ansatz (CAFE-Methode) 23 vorgeschlagen. Diese Methode zeichnet sich durch die Fähigkeit, präzise Messungen der Verzehr von Lebensmitteln zu schaffen, aber es führt zu deutlich kurzlebiger Fliegen 24. Mögliche Belastungen bei der Fütterung Umfeld verbunden sind, müssen bei der Beurteilung der kombinierten Zusammenhang zwischen Ernährung und genetischer Faktoren bei insgesamt Langlebigkeit werden.
Die demographische Analyse, einschließlich der Berechnung des Überlebens und Mortalität Kurven können viele Informationen über die Dynamik der Alterung der Bevölkerung zu offenbaren. Ein typisches Überleben Kurve relativ flach bleiben über einen längeren Zeitraum früh im Leben und erhöhen die Rate der Rückgang bei älteren Frauen, die auf einen Zeitraum von niedrige Sterblichkeit f entsprichtollowed durch einen Zeitraum von einem exponentiellen Anstieg der Mortalität. A stressigen Umfeld wird in der Regel manifestieren sich als Überschuss der frühzeitigen Todesfälle in der Bevölkerung und eine anomale Bad im Überleben Kurve. Während ein solches Ergebnis signifikanten Unterschiede zwischen den Behandlungen geben kann, wird es normalerweise nicht robust sein, um die Replikation. Wir empfehlen daher mindestens zwei voneinander unabhängige (dh nicht-vorübergehenden) Wiederholungsexperimente ausgeführt werden, bevor eine sichere Schlussfolgerung gezogen werden. Es kann sein, dass zusätzliche Anstrengungen zur Erhöhung der Stichprobengröße, die Kontrolle der Haltungsbedingungen und die Verbesserung der Gesundheit der Stammpflanzen erforderlich sein.
Rechts-Zensur (Entfernung von Tieren aus dem Experiment, dass Flucht oder tot aus zufälligen Ursachen vermutet) von Tieren, die aus dem stressigen Umweltbedingungen sterben sollte mit äußerster Vorsicht angewendet werden. Genau genommen muss Zensurvorrichtung zufällig auftreten über experimentelle Behandlungen, und wenn die experimentelle interventiam moduliert Stressempfindlichkeit, könnte man versehentlich gelten Behandlungs-level Auswahl für die Bevölkerung. Als allgemeine Regel, die Vermeidung der Anwesenheit von Faktoren, die mehrdeutig frühen Tod verursachen können (vor allem mit der Nahrungsmittelquelle assoziiert) ist besser als Zensurvorrichtung und Zensurvorrichtung sollte nur an Organismen beobachtet, zu sterben oder während physische Bearbeitung entweichen wurden angewendet.
Eine letzte Überlegung ist die Beurteilung der statistischen Signifikanz. Während große Kohorte Stichprobengrößen beeindruckende Leistung bereitzustellen, um kleine Unterschiede zwischen den Behandlungen zu unterscheiden, muss der potenzielle biologische Bedeutung einer solchen Differenz ebenfalls berücksichtigt werden. Mit ziemlich große Langlebigkeit Experimenten sind die Unterschiede so niedrig wie 2.1% oft statistisch hoch signifikant, aber die Gesamtwirkung der Intervention über den Gesundheitszustand kann gering sein. Daher müssen sowohl statistische und biologische Bedeutung bei der Interpretation der gesamten Ergebnisse des Experiments werden. Inferenz über den Alterungsprozess vom Überleben Experimente können durch Maßnahmen der altersbedingten Rückgang der Verhaltens-oder physiologische Gesundheit Maßnahmen, einschließlich Steigfähigkeit 25 und Magen-Darm-Wand Integrität 7 ergänzt werden.
Zusammenfassend, die Drosophila Modellorganismus eine ansprechende Wahl für das Studium Mechanismen des Alterns. Mit einer sorgfältigen experimentellen Technik kann robuste demographische Analyse Einblick in die Auswirkungen der pharmakologischen und genetischen Faktoren auf den Alterungsprozess bieten.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Ellison Medical Foundation (SDP unterstützt http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) und NIH R01AG030593 (SDP). Diese Arbeit verwendet die Ressourcen des Drosophila Aging Core (DAC) der Nathan Shock Center of Excellence in der Biologie des Alterns von der National Institute of Aging P30-AG-013.283 (gefördert http://www.nih.gov/ ). Die Autoren möchten die Pletcher Labor für hilfreiche Diskussionen und vor allem Brian Chung für die kritische Durchsicht des Manuskripts danken. Wir möchten Nick Asher und Kathryn Borowicz für die Unterstützung bei der Datenerhebung zu bestätigen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Fleishmann’s Yeast | 2192 | |
| Grape Agar Powder Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Large Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Large Replacement End Caps | Genesee Scientific | 59-103 | |
| 6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Flugs Closures for Stock Bottles | Genesee Scientific | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide, Polystrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Flugs Closures for Wide Vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul | Denville Scientific | P1105-CP | |
| Flystuff Flypad, Standard Size | Genesee Scientific | 59-114 | |
| BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow | Fisher Scientific | 10-200-47 | |
| PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 | |
| Gelidium Agar | Mooragar | n/a | |
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals | 0290331280 | |
| Granulated Sugar | Kroger | n/a | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-266 | Fly Food Preservative |
| Propionic Acid, 99% | Acros Organics | 149300025 | Fly Food Preservative |
| Kanamycin Sulfate | ISC BioExpress | 0408-10G | |
| Tetracycline HCl | VWR | 80058-724 |
References
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