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Biology

उम्र के मापन में doi: 10.3791/50068 Published: January 7, 2013

Summary

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर दीर्घायु विनियमन के आणविक आधार की खोज के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव है. इस प्रोटोकॉल दीर्घायु के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संभावित नुकसान की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, जनसंख्या के आधार पर माप और से बचने के लिए उन्हें कैसे पैदा करने में शामिल कदम पर चर्चा करेंगे.

Protocol

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हम प्रयोगात्मक खाद्य पदार्थ, खमीर पेस्ट, और अंगूर अगर प्लेट कि 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटोकॉल में दिखाई देते हैं भंडारण और उन्हें 1-2 महीने के भीतर के रूप में लंबे समय के रूप में ढालना और सूखापन दोनों लार्वा और वयस्क के लिए अंदर नहीं मानक पर्यावरण शर्तों निर्धारित किया है का उपयोग करने की सलाह देते हैं 12:12 घंटा प्रकाश अंधेरे चक्र और 60% सापेक्ष आर्द्रता के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर मक्खियों की एक मशीन में रखरखाव शामिल मंच.

1. प्रायोगिक खाद्य की तैयारी

  1. लार्वा के विकास के लिए, हम एक संशोधित कैलटेक 5 मीडियम का उपयोग करते हैं, जो सीटी के रूप में इस प्रोटोकॉल में संक्षिप्त है.
  2. हम वयस्क (SY) ड्रोसोफिला कि (sucrose) चीनी और 2% अगर आधार, कि उबला हुआ किया गया गया है एंटीबायोटिक दवाओं और विरोधी कवक एजेंट के साथ पूरक में खमीर (lyophilized पूरे के ब्रेवर खमीर) के होते हैं के लिए आहार की सलाह देते हैं, और वितरित (10 मिलीग्राम प्रति शीशी) 6. खाद्य जमना और भंडारण के लिए पहले 12-24 घंटे के लिए लुप्त हो जाना करने के लिए अनुमति दी जानी चाहिए. क्योंकि पोषक पर्यावरण substan कर सकते हैंtially प्रभाव, खाना पकाने की प्रक्रिया में दीर्घायु और स्थिरता दोनों एक प्रयोग के भीतर और प्रयोगों के बीच तुलना करने के लिए आवश्यक है.
  3. यदि एक औषधीय एजेंट वयस्क भोजन करने के लिए जोड़ा जा रहा है, इस दवा भोजन और स्तरित के एक छोटे बैच (2 मिलीलीटर) खाद्य सतह पर नियंत्रण वाहन अकेले युक्त परतों प्राप्त शीशियों के साथ, में मिलाया जा सकता है.

2. एक लाइव खमीर चिपकाएँ की तैयारी

सक्रिय सूखी खमीर की 3 जी के साथ पानी की 5-6 मिलीलीटर का मिश्रण है और अच्छी तरह से मिश्रण. खमीर पेस्ट की स्थिरता कि एक चिकनी मूंगफली का मक्खन की होना चाहिए.

3. एक अंगूर अगर प्लेट की तैयारी

  1. एक 1000 मिलीग्राम फ्लास्क में आसुत जल की 500 मिलीलीटर में एक अंगूर अगर premix का एक पैकेट जोड़ें और पैकेट पर दिए गए निर्देशों का पालन करने के लिए अंगूर अगर मिश्रण भंग.
  2. ध्यान से 100 मिमी पेट्री डिश में मिश्रण की एक मोटी परत डाल जबकि बुलबुला गठन से परहेज. Premix का एक पैकेट का उत्पादन लगभग 14 graपे अगर प्लेटें.
  3. मीडिया को शांत करने के लिए और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए lids के साथ में जमना. प्लेट्स 4 में रखा जा सकता डिग्री सेल्सियस, प्लास्टिक की चादर में लपेटा, या तुरंत इस्तेमाल किया.

4. सिंक्रनाइज़ अंडे का संग्रह

इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सभी मीडिया, यानी खमीर, अंगूर अगर प्लेट, सीटी और 10% एसवाई भोजन, कमरे के तापमान पर होना चाहिए.

  1. खमीर की एक 2-3 सेमी व्यास परत एक अंगूर अगर प्लेट पर पेस्ट बिखरा हुआ है और अलग निर्धारित करें.
  2. एक सीओ 2 पैड के नीचे जाल पक्ष मक्खियों anesthetize के साथ एक बड़ा अंडा संग्रह पिंजरे रखें. नाइट्रोजन आधारित संज्ञाहरण सीओ 2 के लिए एक वैकल्पिक, कुछ प्रयोगशालाओं द्वारा प्रयोग किया जाता है, कि उच्च गुणवत्ता परिणाम 7 का उत्पादन कर सकते हैं.
  3. एक चिमनी का प्रयोग, अंडा संग्रह पिंजरे में मक्खियों के 150-200 जोड़े हस्तांतरण.
  4. अंगूर अगर प्लेट रखें पिंजरे के खुले अंत को कवर करने के लिए और एक अंत टोपी के साथ सुरक्षित है.
  5. अपने पक्ष पर पिंजरे लेटाओ जब तक मक्खियों जगा.फिर, पिंजरे, अंगूर अगर प्लेट ओर नीचे रखने के लिए, इनक्यूबेटर में रातोंरात.
  6. अगले दिन, एक नव yeasted अंगूर की थाली के साथ अंगूर की थाली स्वैप. केवल थाली की सतह पर खमीर पेस्ट के बारे में 1 सेमी व्यास डाल दिया. 1 सेंट दिन अंगूर प्लेट त्यागें.
  7. भ्रूण 16-22 घंटे के लिए अंगूर अगर थाली की सतह पर इकट्ठा करने के लिए अनुमति दें. एक बार किया, अंगूर अगर प्लेट एकत्र और माता पिता मक्खियों त्यागें.
  8. 1x फास्फेट के साथ अंगूर अगर प्लेटों की सतह धोने buffered खारा (पीबीएस). अंडे धीरे एक कपास झाड़ू से scraping द्वारा जुटाए जा सकता है. खरोंच नुकसान नहीं ख्याल रखना, या थाली की सतह से अगर के पतले टुकड़े परिमार्जन. एक चिमनी की सहायता के साथ, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में धोया अंडे डालना.
  9. चलो अंडे ट्यूब के नीचे बसा है और सतह पर तैरनेवाला डालना, सावधान किया जा रहा है किसी भी अंडे खोना नहीं. शेष मात्रा 2-3 मिलीग्राम के आसपास होना चाहिए.
  10. ट्यूब पीबीएस के 8-10 मिलीलीटर जोड़ें और दोहराएं ऊपर कदम 2-3 morई बार अच्छी तरह से अंडे धोने के लिए जब तक तैरनेवाला स्पष्ट है. अवशिष्ट खमीर से छुटकारा हो रही है इस चरण में महत्वपूर्ण है.
  11. धोने के बाद, सभी तैरनेवाला नाली जब तक शेष मात्रा 2 मिलीलीटर है. सीटी एक विस्तृत बोर विंदुक टिप का उपयोग कर बोतलों में अंडे की 32 μl अशेष भाजक. विंदुक टिप में अंडे कॉम्पैक्ट कोई aspirated तरल के लिए थोड़ा के साथ किया जाना चाहिए. यह विंदुक टिप गहरी और अंडा निपटान में डालने जल्दी निकालना सवार को रिहा करके प्राप्त किया जा सकता है.
  12. प्लेस वरीयता प्राप्त सीटी इनक्यूबेटर में वापस मक्खी विकास भर बोतलें.

5. उम्र से मिलान वयस्क के संग्रह मक्खियों

  1. व्यसक आम तौर पर दिन से 9 आगे eclose जाएगा. मक्खियों कि 1 दिन और जगह की बोतलें पर इनक्यूबेटर रातोंरात में वापस उभरा त्यागें. इस अभ्यास जल्दी emergents के लिए अनजाने चयन से बचने और सिंक्रनाइज़ मक्खियों की अधिकतम संख्या के संग्रह के लिए अनुमति देते हैं.
  2. 16-22 घंटे बाद हस्तांतरण, वयस्क दिन पुरानी int मक्खियोंओ 10% SY खाना बोतलें. यदि आवश्यक हो अगले दिन, एक बैच एकत्र किया जा सकता है.
  3. वापसी इनक्यूबेटर में वापस मक्खियों और मक्खियों को दो दिनों के लिए यौन परिपक्वता और दोस्त तक पहुँचने की अनुमति है. 10% वयस्कता के पहले दिन के रूप में एसवाई बोतलों को हस्तांतरण के दिन रिकार्ड.

6. मक्खियों छंटनी और दीर्घायु प्रयोग की स्थापना

  1. चतनाशून्य करनेवाली औषधि पैड पर मक्खियों के छोटे समूहों, तो तरह पुरुषों और महिलाओं के दो समूहों में एक तूलिका का उपयोग anesthetize. सीओ 2 का उपयोग अगर, यह संभव लंबे समय तक चलने वाले स्वास्थ्य के मुद्दों कि दीर्घायु प्रयोग की अखंडता से समझौता कर सकते हैं को रोकने के जोखिम को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  2. व्यक्तिगत शीशियों में एक ही लिंग के 30 मक्खियों रखें. जनसंख्या और स्वस्थ संतान में कोई balancer गुणसूत्रों मान लिया जाये कि, प्रत्येक बोतल प्रत्येक सेक्स के 3-4 शीशियों के आसपास का उत्पादन करना चाहिए. व्यक्तिगत शीशियों में मक्खियों Aliquoting 3-4 मिनट से अधिक नहीं ले, तो चाहिए कि कुल में, मक्खियों की एक अधिकतम के लिए ही कर रहे हैं संज्ञाहरण के संपर्क में9-10 मिनट.
  3. दोहराएँ 6.1-6.2 कदम जब तक वहाँ रहे हैं 8-10 शीशी प्रत्येक लिंग और प्रयोगात्मक उपचार के लिए replicates.

7. एक्सेल स्प्रेडशीट की स्थापना के लिए दीर्घायु प्रयोग हुए

  1. हम प्रयोगात्मक हालत की शीशी के बजाय स्थिति randomizing समूहीकरण शीशियों की सिफारिश क्रम में को इनक्यूबेटर में शीशी स्थान के साथ जुड़े पूर्वाग्रह से बचने के लिए और experimenter शीशी पहचान अस्पष्ट. ऐसा करने के लिए पहले एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम में शीशी में से प्रत्येक के लिए एक यादृच्छिक संख्यात्मक आईडी असाइन करने के लिए, तो आईडी संख्या से ट्रे में शीशियों की व्यवस्था. यदि आप dLife प्रयोग प्रबंधन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रहे हैं, प्रयोग सेटअप पर ट्यूटोरियल का पालन करने के लिए शीशी में से प्रत्येक के लिए आईडी संख्या उत्पन्न.
  2. (वैकल्पिक) यदि आप एक आरएफआईडी रीडर या dLife साथ संघ में बारकोड रीडर का उपयोग कर रहे हैं, एक आरएफआईडी या शीशी में से प्रत्येक के लिए बारकोड टैग संलग्न और शीशी dLife में संख्यात्मक आईडी के साथ टैग सहयोगी. कार्यक्रम प्रत्येक शीशी पहचान जब एक पाठक के साथ स्कैनऔर एक मार्गदर्शन करने के लिए एक स्प्रेडशीट में सही स्थान में डेटा रिकॉर्ड. DLife के साथ संयोजन के रूप में एक टैग रीडर का उपयोग काफी डेटा संग्रह समय और रिकॉर्डिंग त्रुटि को कम कर देता है.

8. दीर्घायु प्रयोग बरकरार

ताजा भोजन युक्त शीशियों प्रत्येक हस्तांतरण के लिए कमरे के तापमान पर होना चाहिए.

  1. प्रयोगात्मक अवधि के दौरान, नई शीशियों पर स्थानांतरण मक्खियों ताजा भोजन युक्त हर 2 (युवा महिलाओं), दिन, या 3 बार एक सप्ताह (पुरुषों या महिलाओं के उम्र के 3 सप्ताह). यह कदम यह सुनिश्चित करेंगे कि युवा महिलाओं के लिए खिला पर्यावरण लार्वा की उपस्थिति से बाधित नहीं है. यह स्थानांतरण संज्ञाहरण के बिना पूरा किया जाना चाहिए, जो पुराने मक्खियों (Pletcher, व्यक्तिगत टिप्पणियों) में विशेष रूप से तीव्र मृत्यु दर को प्रेरित कर सकते हैं.
  2. शीशी में से प्रत्येक हस्तांतरण के दौरान उम्र रिकॉर्ड, पुरानी शीशी में मृत मक्खियों गिनती, और मृत मक्खियों कि नई शीशी के लिए किया जाता है. इस जानकारी अलग से रिकार्ड मेंएक स्प्रेडशीट में दो कॉलम (या तो dLife या अपने खुद के स्प्रेडशीट). इससे यह सुनिश्चित होगा कि मक्खियों किए गए डबल गिना नहीं कर रहे हैं. मौतों की कुल संख्या (मृत + किया जाता है) कम से कम पिछले हस्तांतरण से बराबर किया जाता मक्खियों की संख्या चाहिए. नए होने वाली मौतों की संख्या का निर्धारण करने के लिए होने वाली मौतों की कुल संख्या से पहले किया जाता मक्खियों की संख्या घटाना.
  3. एक मक्खी माना जाता है, सही सेंसर अगर यह बच या दुर्घटना में मृत्यु के माध्यम से प्राकृतिक मौत के लिए पहले प्रयोग छोड़ दिया. इस तरह के प्रयोग से बाहर निकलने पशु दिन पर एक अलग कॉलम में दर्ज किया जाना चाहिए कि मक्खी प्रयोग से बाहर निकल गया. सेंसर मक्खियों मृत (देखें नीचे) के रूप में दर्ज नहीं हैं.
  4. 8.1-8.2 चरणों को दोहराएँ जारी रखें जब तक अंतिम उत्तरजीवी मर चुका है. ध्यान रखें कि मक्खियों उम्र के रूप में, कुछ मक्खियों को अपनी पीठ पर झूठ और मृत उनके inactiveness कारण दिखाई देते हैं हो सकता है. इसलिए जब किया जाता है (मृत) मक्खियों की गिनती, शीशियों की ओर निर्धारित करने के लिए अगर वहाँ पैर आंदोलनों पर नल. यदि ऐसा है तो thes,ई मक्खियों अभी भी जीवित हैं. मामले में जहां मक्खियों पुराने शीशी लेकिन जीवित में भोजन करने के लिए अटक रहते हैं, वे मृत के रूप में नहीं गिना चाहिए और आगे शीशी का दोहन करने के लिए मक्खी स्थानच्युत करना द्वारा बचाया जा चाहिए. रोक लगाए ऐसे मक्खियों सावधानी के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए के रूप में यह प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह में परिणाम हो सकता है.

9. डेटा विश्लेषण

  1. उत्तरजीविता वक्र संभावना है कि एक व्यक्ति एक भी उम्र के लिए निकलता है और आम तौर पर एक Kaplan-Meier दृष्टिकोण (1 चित्रा) 8 का उपयोग कर की गणना प्रदर्शित करता है. सही सेंसर डेटा के अभाव में, सूत्र उम्र (x एस x) में ऐसी है कि उम्र विशेष उत्तरजीविता सरल किया जा सकता है, उम्र एक्स (एन x) में एक जनगणना समय की शुरुआत में जीवित व्यक्तियों की संख्या विभाजित करके निर्धारित किया जाता है प्रयोग में मक्खियों की कुल संख्या (0 एन), एस एक्स एन = x / 0 एन. वे 9.2) उत्तरजीविता घटता डेटा प्रस्तुति के सबसे आम रूप है, औरलॉग रैंक परीक्षण का उपयोग करने वाले समूहों के बीच समानता के लिए परीक्षण किया जा सकता है. उचित निष्कर्ष के रूप में एक काउहोट में 50-100 व्यक्तियों के रूप में कुछ से खींचा जा सकता है. उत्तरजीविता संचयी एक उपाय है, तथापि, और इसलिए मौतें, उन जीवन में जल्दी के रूप में है कि उम्र बढ़ने से संबंधित नहीं हैं, जीवन भर उत्तरजीविता दबाना का पता लगाने उम्र बढ़ने के लिए विशेष प्रभाव के लिए मुश्किल बना.
  2. एक 2 डेटा दृश्य विधि मृत्यु दर उम्र विशेष समारोह है, जो हर उम्र अंतराल के माध्यम से मरने के खतरे को प्रदर्शित करता है और अस्तित्व 9,10 डेटा के एक अधिक सूक्ष्म विवरण प्रस्तुत करता है. मृत्यु उपाय एक उम्र से दूसरे करने के लिए स्वतंत्र हैं, और मृत्यु वक्र के आकार उम्र बढ़ने की गतिशीलता के बारे में निष्कर्ष के लिए उपयोगी है, खासकर जब उपचार वयस्क जीवन के दौरान समायोजित कर रहे हैं. उम्र विशिष्ट मृत्यु दर का अनुमान है, तथापि, दोनों और छोटा सा नमूना आकार के साथ सटीक और सटीकता की कमी है, और अक्सर एक विश्वसनीय तों के लिए कई करने के लिए कई पलटन प्रति व्यक्तियों के सैकड़ों की आवश्यकता11 timate.
  3. दीर्घायु मतभेद का आकलन करने के लिए अन्य तरीकों पैरामीट्रिक (जैसे Gompertz) और अर्द्ध पैरामीट्रिक मॉडल (जैसे कॉक्स प्रतिगमन) शामिल हैं. इन मॉडलों शक्तिशाली हो सकता है, लेकिन मृत्यु दर घटता के आकार और उपचार प्रभाव, है जो गलत 11,12 निष्कर्ष करने के लिए नेतृत्व सकता है की प्रकृति के बारे में किए गए मान्यताओं की वजह से सावधानी के साथ लागू किया जाना चाहिए कर सकते हैं.

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Representative Results

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प्रोटोकॉल का एक सरलीकृत योजना 1 चित्रा, जहां महत्वपूर्ण कदम को रेखांकित कर रहे हैं में प्रस्तुत किया है. प्रोटोकॉल के तुल्यकालन हिस्सा विभिन्न assays कि उम्र से मिलान वयस्क मक्खियों की आवश्यकता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

जंगली प्रकार मक्खियों की विशिष्ट उत्तरजीविता घटता चित्रा 2a में दिखाया जाता है, dLife प्रयोग प्रबंधन सॉफ्टवेयर (चित्रा 2b, ग) का उपयोग. वयस्क पुरुषों को आम तौर पर कम से दोनों आबादियों एक 10% SY भोजन पर 25 डिग्री सेल्सियस पर> 50 दिनों का एक मतलब है और मंझला दीर्घायु प्राप्त करने के साथ रहते हैं, ध्यान दें कि उत्तरजीविता प्रयोग के शुरुआती हिस्से में उच्च बनी हुई है और फिर तेजी से गिरावट आती है.

ड्रोसोफिला उम्र तापमान और आहार के रूप में पर्यावरण की स्थिति, से प्रभावित है. चित्रा 3a से पता चलता है कि वयस्क पुरुषों को आम तौर पर स्पष्ट रूप से कम जीने के रूप में तापमान में वृद्धि हुई है. इसी तरह, जीवन पर आहार के प्रभाव चित्रा 3b में प्रस्तुत किया है

विकास के दौरान साथियों के घनत्व वयस्क उम्र को प्रभावित करती है और विकास के समय बदल सकते हैं. यहाँ हम कैसे सिंक्रनाइज़ अंडे के विभिन्न घनत्व लार्वा के विकास को प्रभावित का एक उदाहरण दिखाते हैं. 4 चित्र में दिखाया गया है, वयस्क मक्खी उपज गरीब और भोजन सतह सुखाने जब ​​अंडे की संख्या बहुत कम है के लिए अतिसंवेदनशील है. स्पेक्ट्रम के दूसरे छोर पर, लार्वा विकास से अधिक भीड़ बोतलों में मंद है, और वयस्क मक्खियों की उपज कम है.

एक पूरे के रूप में पलटन की उत्तरजीविता वक्र विषम शीशी प्रभाव से काफी प्रभावित कर सकते हैं, के रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया है. व्यक्तिगत शीशियों के लिए अनियमित अस्तित्व डेटा गरीब भोजन की गुणवत्ता या बैक्टीरियल / कवक संचय और संक्रमण के रूप में इस तरह के कई कारण हो सकता है. जबकि ग ऐसी विषम होने वाली मौतोंएक जनसंख्या उत्तरजीविता उपाय तिरछा, वहाँ उचित है कि एक शीशी प्रयोग से बाहर रखा जाना चाहिए का निर्धारण करने के लिए एक सीधा मीट्रिक नहीं है. इन स्थितियों इसलिए सबसे अच्छा अच्छा हैंडलिंग प्रथाओं से परहेज है और एक बड़े नमूना आकार का उपयोग द्वारा कम.

6 चित्रा शीशी की स्थिति है कि विषम होने वाली मौतों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के उदाहरण से पता चलता है. सामान्य में, किसी भी शर्त है कि छोटे crevasses जहां मक्खियों अटक जाते हैं सकता है के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और मर जाते हैं बचा जाना चाहिए. उदाहरणों में शामिल हैं: खाना खाना है कि शीशी दीवार से दूर सिकुड़ते, और भोजन में खुर के लिए सुराग में सूखापन, में बुलबुले चित्रा 5a (एक एकल बुलबुले के साथ एक हल्के उदाहरण), चित्रा 5b, और चित्रा 5c में दिखाया जाता है, क्रमशः . अत्यधिक सूखे भोजन, के रूप में चित्रा 5b और चित्रा 5c में दिखाया ध्यान स्थानान्तरण के दौरान फ़्लिप हो सकता है, के रूप में खाद्य हटाना और n में मक्खियों पर गिर सकते हैं चाहिएew शीशी. भोजन की सतह पर बैक्टीरियल संक्रमण या शारीरिक फंसाने विकास के लिए नेतृत्व और इस तरह मृत्यु दर में वृद्धि कर सकते हैं कर सकते हैं. भोजन की सतह पर कुछ बैक्टीरिया पारदर्शी और चमकदार रूप में प्रकट अगर खाने से पसीना () नहीं दिखाया है, जबकि बैक्टीरिया के अन्य प्रकार सफेद कालोनियों (चित्रा 5d) के रूप में प्रकट होगा. इन शर्तों के किसी भी प्रदर्शन शीशियों और ध्यान दिया जाना चाहिए और आगे माना जाता है जब डेटा की व्याख्या कर रहे हैं. सामान्य में, हम दोनों लार्वा और वयस्क अवस्था में पालन करने के लिए सावधान ध्यान देने पर जोर दिया और वयस्क मक्खियों के दीर्घायु और स्वास्थ्य का समर्थन करने के लिए और बाद में जीवन में मृत्यु की अस्पष्ट कारणों के लिए प्रमुख समस्याओं में से एक घटना को कम कर सकते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1 योजनाबद्ध एक ड्रोसोफिला उम्र परख के सरलीकृत.

चित्रा 2 (ए) प्रतिनिधि w 1118 नियंत्रण (हलकों) महिला और पुरुष वयस्क (वर्ग) की उम्र घटता एक SY10% भोजन पर 25 डिग्री सेल्सियस पर मक्खियों. (बी, सी) dLife सॉफ्टवेयर के प्रतिनिधि स्क्रीन शॉट.

चित्रा 3
तापमान के प्रभाव चित्रा 3 (ए) और (ख) वयस्क उम्र पर आहार. ए व्यस्क (एस केण्टन) नियंत्रण पुरुष मक्खियों वयस्कता के माध्यम से 18 पर बनाए रखा गया डिग्री सेल्सियस, 25 डिग्री सेल्सियस, या 29 ° सीबी व्यस्क (डब्ल्यू 1118) नियंत्रण मादा मक्खियों या तो एक 15% SY या 5% एसवाई आहार से अवगत कराया गया.

चित्रा 4
चित्रा 4 विकास के 9 दिन (25 में डिग्री सेल्सियस) सिंक्रनाइज़ अंडे, सीटी भोजन बोतलों में aliquoted की. वीभ्रूण युक्त अशेष भाजक की olume के रूप में प्रत्येक बोतल के नीचे दिखाया गया है.

चित्रा 5
चित्रा 5 dLife शीशी द्वारा उत्तरजीविता दिखा सॉफ्टवेयर से प्रतिनिधि साजिश. तीर एक समूह के भीतर एक एकल विषम शीशी को इंगित करता है.

चित्रा 6
6 चित्रा suboptimal भोजन की गुणवत्ता का उदाहरण. ए भोजन सतह पर बुलबुले. बी खाद्य शीशी के किनारे से दूर सिकुड़. सी. भोजन में दरारें. भोजन की सतह पर डी. जीवाणु संचय.

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Discussion

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यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला में वयस्क दीर्घायु की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप है कि आनुवंशिक, औषधीय, और पर्यावरण के हस्तक्षेप के मूल्यांकन के लिए अनुकूल है के उत्पादन के लिए एक विधि का वर्णन है. प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलुओं को शामिल ध्यान से लार्वा विकास के वातावरण को नियंत्रित करने, वयस्क तनाव को कम, और प्रयोगात्मक समूहों और नियंत्रण में पूर्वाग्रह को कम. हम भी dLife उम्र प्रयोग प्रबंधन सॉफ्टवेयर के उपयोग को प्रस्तुत करते हैं. बस शीशी में से प्रत्येक के लिए एक बार कोड या आरएफआईडी टैग संलग्न करके, dLife कार्यक्रम प्रत्येक माप के लिए डाटा अधिग्रहण में सहायता और उत्तरजीविता वक्र की साजिश रचने में. हालांकि यह वर्तमान में मक्खी जीवन के अध्ययन शीशियों का उपयोग कर के लिए सबसे उपयुक्त है, इस प्रयोग प्रबंधन उपकरण आसानी से अन्य जीवों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, कक्षों की आबादी, या अस्तित्व के तनाव प्रतिरोध और दवा विषाक्तता सहित अतिरिक्त उपाय, के लिए विभिन्न प्रकार के साथ.

पीrior किसी भी दीर्घायु मूल्यांकन शुरू करने, एक पहले ध्यान से माता पिता के शेयरों की उत्पादन पर नियंत्रण रखना चाहिए. आनुवंशिक परिवर्तनशीलता एक महत्वपूर्ण कारक है, के रूप में पैतृक उपभेदों के स्वास्थ्य की है. इन कारकों में काफी सार्वजनिक प्रारंभिक अध्ययन है कि ख्यात दीर्घायु नियामकों 13 सूचना दी के साथ जुड़े विवाद को नेतृत्व किया है. शोधकर्ता आनुवंशिक पृष्ठभूमि में परिवर्तनशीलता attributable प्रभाव को कम करने के लिए कई विकल्प है. आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए आनुवंशिक रूप से परिवर्तित उपभेदों पृष्ठभूमि या तो backcrossing के माध्यम से एक नियंत्रण तनाव को नियंत्रित (कम से कम 6 बार) या inducible सिस्टम (उदाहरण के लिए, तापमान संवेदनशील alleles या दवा inducible transgene अभिव्यक्ति) का उपयोग होना चाहिए. GeneSwitch और प्रणालियों 14,15 Tet पर लोकप्रिय हैं और एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि जिसमें transgene या प्रेरित है और प्रेरित नहीं है साथ मक्खियों के प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति. सभी inducible सिस्टम के लिए उपयुक्त समकालीन नियंत्रण करने के लिए confou से बचने के लिए आवश्यक हैएनडीएस inducer के साथ जुड़ा हुआ है. विफलता आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए लगभग हमेशा नियंत्रण संकर जोश में परिणाम है, जो इरादा 13 हेरफेर करने के लिए असंबंधित कारणों के लिए दो अलग अलग उपभेदों के बीच एक क्रॉस के F1 पीढ़ी में जीवन का विस्तार कर सकते हैं. इस पहलू विशेष चिंता का विषय है जब प्रणाली GAL4 यूएएस का उपयोग. पर्यावरण के उपायों के लिए (जैसे, दवा उपचार, आहार, तापमान, आदि), यह करने के लिए एक से अधिक तनाव पर हस्तक्षेप के प्रभाव का अध्ययन करने की सलाह दी जाती है. अंत में, दोनों माता - पिता की उम्र 16 और 17 तनाव F1 पीढ़ी की लंबी उम्र को प्रभावित करती है, और इस कारण के लिए, स्वस्थ युवा वयस्कों अंडा उत्पादन के लिए चुना जाना चाहिए.

लार्वा / पोटा संबंधी पर्यावरण को नियंत्रित करने के महत्वपूर्ण पहलुओं भीड़भाड़ की रोकथाम और प्रकाश अंधेरे समय, नमी और तापमान के सख्त विनियमन के साथ एक नियंत्रित वातावरण के रखरखाव शामिल हैं. इन कारकों देव के समय दोनों को प्रभावित करेगाelopment और परिणामस्वरूप वयस्कों के शारीरिक गुणवत्ता. उच्च लार्वा घनत्व के रूप में प्रतिकूल लार्वा वातावरण, तनाव inducible कारकों (जैसे, गर्मी झटका प्रोटीन अभिव्यक्ति) के सक्रियण है कि वयस्क दीर्घायु 18 प्रभाव ज्ञात करने के लिए हो सकता है.

वयस्क चरण के दौरान, पर्यावरण के लिए सावधान ध्यान आवश्यक रहता है. अकेले आहार का चुनाव काफी उम्र को प्रभावित करती है और से आनुवंशिक कारकों दीर्घायु आहार पर विशेष प्रभाव का उत्पादन के साथ बातचीत कर सकते हैं कर सकते हैं. इसके अलावा, कुछ आम खाद्य आधार विकल्प (lyophilized पूरे शराब बनानेवाला है खमीर के बजाय खमीर निकालने के) नाटकीय रूप से 19 उम्र छोटा कर सकते हैं, खुला संभावना है कि खाना ही organismal तनाव है कि लंबी उम्र के मूल्यांकन क्षीण हो सकता है पैदा कर रहा है छोड़ने. इस अनुच्छेद में, हम भोजन में शारीरिक विसंगतियों (जैसे, बुलबुले, फोम, दरारें, बैक्टीरिया, आदि) है कि पी सकते हैं आहार सहित वातावरण में तनाव के संभावित स्रोतों पर प्रकाश डाला हैhysically जानवरों को फंसाने. ताजा भोजन के साथ पुराने भोजन (कम से कम तीन बार एक सप्ताह) के नियमित प्रतिस्थापन इन कठिनाइयों के कई दूर कर सकते हैं. इसके अलावा, 20 तापमान, आर्द्रता (व्यक्तिगत टिप्पणियों), प्रकाश 21, और की उपस्थिति conspecifics (सामाजिक वातावरण) 22 सभी उम्र मिलाना कर सकते हैं, और प्रयोग में इन कारकों को नियंत्रित करने के लिए ध्यान परिणामों में पूर्वाग्रह से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. जबकि एक शीशी के भीतर मक्खियों की संख्या समय के साथ कम हो जाती है, हमने पाया है कि मक्खियों की संख्या को समायोजित करने के लिए संज्ञाहरण के उपयोग के तरीके उम्र पर निर्भर (Pletcher, व्यक्तिगत टिप्पणियों) में मृत्यु दर में वृद्धि कर सकते हैं, और हम इस प्रक्रिया नहीं की सिफारिश करते हैं. एक मशीन में शीशियों की सटीक स्थिति भी एक कारक है, एक मालूम होता है नियंत्रित वातावरण में भी. नियंत्रण के साथ प्रयोगात्मक समूहों के बेतरतीब शारीरिक वितरण शीशी स्थापन के साथ जुड़ा हुआ है और उचित सांख्यिकी निष्कर्ष के लिए आवश्यक है पूर्वाग्रह को कम कर सकते हैं. यहां तक ​​कि साथसावधानी से नियंत्रित शर्तों, मामूली अंतर प्रयोगों के बीच मनाया जा सकता है और भीतर प्रयोग नियंत्रण के उपयोग के लिए आवश्यक है.

वैकल्पिक खिला दृष्टिकोण एक केशिका फीडर (कैफे विधि) दृष्टिकोण सहित 23 उम्र के विश्लेषण के लिए प्रस्तावित किया गया है. भोजन की खपत के सटीक मापन प्रदान करने की क्षमता में इस विधि excels, लेकिन स्पष्ट रूप से अल्पकालिक 24 मक्खियों में यह परिणाम है. संभावित खिला वातावरण के साथ जुड़े तनावों जब आहार और समग्र दीर्घायु में आनुवंशिक कारणों के बीच संयुक्त संबंध का आकलन करने पर विचार किया जाना चाहिए.

उत्तरजीविता और मृत्यु घटता उम्र बढ़ने की आबादी की गतिशीलता के बारे में ज्यादा जानकारी प्रकट कर सकते हैं की गणना सहित जनसांख्यिकीय विश्लेषण. एक लंबी अवधि के लिए एक ठेठ उत्तरजीविता की अवस्था अपेक्षाकृत सपाट प्रारंभिक जीवन में बनी रहती है और बड़ी उम्र में गिरावट की दर, जो कम मृत्यु दर च की एक अवधि के लिए संगत में वृद्धिमृत्यु दर में एक घातीय वृद्धि की अवधि के द्वारा ollowed. एक तनावपूर्ण माहौल आमतौर पर जनसंख्या और उत्तरजीविता वक्र में एक विषम डुबकी में जल्दी होने वाली मौतों की एक अतिरिक्त के रूप में प्रकट होगा. जबकि इस तरह के परिणाम उपचार के बीच महत्वपूर्ण मतभेद का संकेत हो सकता है, यह सामान्य रूप से नकल करने के लिए मजबूत नहीं होगा. इसलिए हम अनुशंसा करते हैं कम से कम दो स्वतंत्र (यानी, गैर - समकालीन) दोहराने प्रयोगों से पहले किसी भी फर्म निष्कर्ष को तैयार कर रहे हैं क्रियान्वित किया जा. यह नमूने का आकार बढ़ाने, पशुपालन शर्तों को नियंत्रित करने, और माता पिता के शेयरों के स्वास्थ्य में सुधार की आवश्यकता है की ओर है कि अतिरिक्त प्रयास हो सकता है.

राइट पर रोक लगाए (भागने कि प्रयोग से पशुओं को हटाने या आकस्मिक कारणों से मृत प्रकल्पित) जानवरों है कि तनावपूर्ण पर्यावरणीय स्थितियों से मरने की अत्यधिक सावधानी के साथ लागू किया जाना चाहिए. बोलने वाले कड़ाई से रोक लगाए प्रयोगात्मक उपचार में बेतरतीब ढंग से होते हैं, और चाहिए अगर interventi प्रयोगात्मकmodulates तनाव संवेदनशीलता पर, एक अनजाने में आबादी के लिए उपचार के स्तर चयन लागू हो सकते हैं. एक सामान्य नियम के रूप में, कारकों की उपस्थिति है कि अस्पष्ट जल्दी मौत का उत्पादन (मुख्य रूप से खाद्य स्रोत के साथ जुड़े) से बचने पर रोक लगाए की तुलना में बेहतर है, और रोक लगाए केवल जीव है कि मरने के लिए या शारीरिक हैंडलिंग के दौरान बचने के लिए मनाया गया के लिए लागू किया जाना चाहिए.

एक अंतिम विचार सांख्यिकीय महत्व का आकलन है. जबकि बड़ी काउहोट नमूना आकार प्रभावशाली शक्ति प्रदान करने के लिए उपचार के बीच छोटे मतभेदों भेद है, इस तरह के एक अंतर के संभावित जैविक महत्व भी माना जाना चाहिए. यथोचित आकार दीर्घायु प्रयोगों के साथ, कम के रूप में 1-2% के रूप में मतभेद अक्सर अत्यधिक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण हैं, लेकिन स्वास्थ्य की स्थिति पर हस्तक्षेप के समग्र प्रभाव मामूली हो सकता है. इसलिए, दोनों सांख्यिकीय और जैविक महत्व जब प्रयोग के समग्र परिणाम की व्याख्या पर विचार किया जाना चाहिए. Infeअस्तित्व प्रयोगों से उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के बारे में rence 25 क्षमता और जठरांत्र दीवार 7 अखंडता चढ़ाई सहित व्यवहार या शारीरिक स्वास्थ्य उपायों में उम्र से संबंधित गिरावट के उपायों द्वारा संवर्धित किया जा सकता है.

सारांश में, ड्रोसोफिला मॉडल जीव उम्र बढ़ने के तंत्र के अध्ययन के लिए एक आकर्षक विकल्प है. सावधान प्रयोगात्मक तकनीक के साथ, मजबूत जनसांख्यिकीय विश्लेषण उम्र बढ़ने की प्रक्रिया पर औषधीय और आनुवंशिक कारकों के प्रभाव में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम एलिसन मेडिकल (SDP, फाउंडेशन से धन के द्वारा समर्थित किया गया http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), 5T32GM007315-35 NIH (जेआर) और NIH R01AG030593 (SDP). यह काम P30 एजी 013,283 (उम्र बढ़ने के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित उम्र बढ़ने के जीवविज्ञान में उत्कृष्टता के नाथन शॉक केंद्र के ड्रोसोफिला एजिंग कोर (डीएसी) के संसाधनों का उपयोग http://www.nih.gov/ ). लेखकों के लिए उपयोगी और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए विचार - विमर्श के लिए विशेष रूप से ब्रायन चुंग Pletcher प्रयोगशाला का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. हम डेटा संग्रह के साथ सहायता के लिए निक आशेर और कॅथ्रीन Borowicz स्वीकार करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active Dry Yeast Fleishmann’s Yeast 2192
Grape Agar Powder Premix Genesee Scientific 47-102
Large Embryo Collection Cages Genesee Scientific 59-101
Large Replacement End Caps Genesee Scientific 59-103
6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene Genesee Scientific 32-130
Flugs Closures for Stock Bottles Genesee Scientific 49-100
Drosophila Vials, Wide, Polystrene Genesee Scientific 32-117
Flugs Closures for Wide Vials Genesee Scientific 49-101
Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul Denville Scientific P1105-CP
Flystuff Flypad, Standard Size Genesee Scientific 59-114
BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; Fisher Scientific 08-757-12
Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow Fisher Scientific 10-200-47
PBS pH 7.4 10x Invitrogen 70011044
Gelidium Agar Mooragar n/a
Brewer's Yeast MP Biomedicals 0290331280
Granulated Sugar Kroger n/a
Tegosept Genesee Scientific 20-266 Fly Food Preservative
Propionic Acid, 99% Acros Organics 149300025 Fly Food Preservative
Kanamycin Sulfate ISC BioExpress 0408-10G
Tetracycline HCl VWR 80058-724

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References

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उम्र के मापन में<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em
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Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (71), e50068, doi:10.3791/50068 (2013).More

Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (71), e50068, doi:10.3791/50068 (2013).

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