Summary
שיטת הערכת כמותית תגובת chemotactic של
Abstract
אורגניזמים רבים משתמשים chemotaxis לחפש מקורות מזון, להימנע מחומרים רעילים, ולמצוא בני זוג. Caenorhabditis elegans יש התנהגות chemotaxis מרשימה.
הנחת היסוד מאחורי בודק את התגובה של התולעים לodorant הוא למקם אותם בשטח ולבחון את התנועה עוררה בתגובה לodorant. אפילו עם מבחני הזמינים רבים, אופטימיזציה של תולעת מתחילה מיקום יחסי הן לשליטה ואזורי מבחן, תוך מזעור האינטראקציה של תולעים אחד עם השני, תוך שמירה על גודל מדגם משמעותי נשארה בתהליך עבודה 1-10. השיטה המתוארת כאן שואפת לטפל בבעיות אלה על ידי שינוי assay שפותח על ידי Bargmann et al. 1. צלחת פטרי מחולקת לארבעה רבעים, שני רביעים מול מסומנים "בדיקה" ושתיים מיועדים "שליטה". הרדמה ממוקמת בכל המבחן ובאתרי בקרה. את התולעים ממוקמים במרכזה של הצלחת עם circlדואר מסומן סביב המוצא כדי להבטיח שתולעים אינם נעימים ביהיו להתעלם ממנו. ניצול מערכת של ארבעה רביעים ולא אחד או שתיים 1 2 מבטל הטיה בתנועה של התולעים, כפי שהם במרחק שווה מדגימות בדיקה ובקרה, ללא קשר לאיזה צד של המקור שהם התחילו. זה עוקף את הבעיה של תולעים נאלצים לנסוע דרך מקבץ של תולעים אחרים להגיב לodorant, אשר יכול לעכב את התולעים או להכריח אותם לקחת דרך עקיפה יותר, מניב פרשנות שגויה של הנתיב המיועד שלהם. שיטה זו מראה גם יתרונות מעשיים על ידי בעל מדגם גדול יותר ומאפשר לחוקר להפעיל את assay ללא השגחה ולהבקיע את תולעי פעם אחת הזמן המוקצב פג.
Introduction
וורד פותח לראשונה בשנת 1973 assay chemotaxis 5, ומאז יש לו יישומים מרחיקים לכת. נוירוביולוגיה היא תחום אחד שיש לו יתרון בשימוש במגוון רחב של מבחני chemotaxis. הסתגלות חוש הריח, צורה פשוטה של למידה וזיכרון, הודגמה בג elegans באמצעות מבחני chemotaxis 6. הם גם היו בשימוש כדי להראות שג elegans יכול לפתח אתנול סובלנות-תוצאה שמדגימה את הגמישות התנהגותית של התולעים לא רק, אבל זה גם מראה כי התולעים יכולים להיות שימושיים מאוד במחקר של תלות באלכוהול בבני אדם 3. מבחני אפילו פותחו כדי להדגים את יכולתו של ג elegans לאחסון קצר וזיכרון לטווח ארוך על ידי מראה כי עמותות מבוצעות על ידי התולעים בין chemoattractants ומזון (OP50) 7. בנוסף, בהתחשב במידע הרב זמין כרגע לגבי ג elegans הגנום, chemotaxiהתנהגותו של ג של elegans השתנה פעמים רבות על ידי גרימת מוטציות 1,8. זה מאפשר להרבה אפשרויות הנדסיות מרגשות, כגון פיתוח של ג elegans ככלי bioremediation. לכן, מאז הפיתוח הראשוני של assay chemotaxis בשנת 1973, זה כבר שינה בתדירות גבוהה ומשמש להבהיר תעלומות במגוון רחב של תחומים.
מבחני מסוימים שנועדו לגלות את המסלול הספציפי שצולם על ידי את התולעים לכיוון יעד. Assay הטיפוסי מסוג זה פותח על ידי וורד 5. שלושה תולעים הונחו על אגר נמסו במשך 15 דקות. התנועות שלהם אותרו על ידי החותם שהשאיר כמו שהם נסעו מהפריפריה של הצלחת עד לשיפוע attractant במרכז הצלחת. כל התולעים על הצלחת נעצרו באמצעות כלורופורם בסופו של כל משפט. צאצא אחד של שיטה זו הניח תולעת אחת באמצע הצלחת עם attractant ושליטהמרחקים שווים והפך לא מהמקור 2.
פירס-Shimomura et al. פיתחה assay להתבוננות בטבעה של התנועה מעורבת בchemotaxis 9 המדויק. תולעים בודדים הוצבו ב9 מנות ס"מ פטרי המכילים גם ריכוז אחיד של attractant או שיפוע בצורה רדיאלית, שהגיעו לשיא במקור attractant. תוכנת מחשב שזיהתה את התולעת הייתה בשימוש כדי להקליט את ההתנהגות הנצפית. מצלמת וידאו המחוברת למיקרוסקופ עבדה בשיתוף עם הבמה כדי להתאים את צלחת פטרי באופן אוטומטי כassay רץ על מנת להבטיח את התולעת נשארה בשדה הראייה. מזה, מידע מפורט יותר התגלה לגבי הגורם לפירואטים המוצגים על ידי ג elegans.
מבחני אחרים, יותר דומים לזה שתואר כאן, בדקו את התגובה של אוכלוסייה גדולה של תולעים לתרכובות בדיקה. מבחני chemotaxis שתי כבר ברבעהשתמש כדי לחקור את התפקידים שנוירונים שונים, קולטנים, ומולקולות העברת אותות שיחק כאשר ג elegans נחשף לתרכובות שונות 1. בין 20-50 תולעי שטף הוצבו בסמוך למרכז הצלחת עם attractant ושליטה בשני קצוות קוטביים יחד עם ההרדמה, אזיד הנתרן (NAN 3). לאחר 60 דקות, מדד chemotactic עם ערכים מ -1.0 ל 1.0 נוצר על בסיס ההפרש בין כמה תולעים הוצמדו לattractant או השליטה. מדד chemotactic דומה היה בשימוש בassay דיווח במאמר זה, אם כי assay קודם לכן לא הצליח להעריך אך ורק תולעים שאינן ניעתי. assay זה היה לאחר מכן הוחל בהמשך לבדיקת ההשפעות של אבלציה העצבית בchemotaxis.
וריאציה נוספת של assay האמור בוצעה בו 100-200 תולעים הונחו במרכז צלחת המכילה ארבעה רביעים 3. רביעים סמוכים גם הכילו את המבחן אולשלוט בחומר. כמו במבחנים קודמים, התולעים היו משותקים על ידי הפעולה של אזיד הנתרן לפני שהבקיע. שיטה דומה מתוארת כאן כדרך להעריך את התגובות של ג elegans לתרכובות שונות. עם זאת, יש לו את השיטה מתחת לערך מוסף של הערכה רק תולעים שעברו מרחק סף המפריד נייד מנייחים תולעים.
מבחני אחרים לא שולבו הנחיות דומות להתעלמות תולעים נייחים. Frøkjær-ג'נסן et al. פיתחה assay תכליתי אשר יכול לשמש כדי לבדוק את תרכובות מסיסים שניהם נדיפים ומים 10. צלחת פטרי הייתה מחולקת לארבעה רבעים. הרביעים העליונים ותחתונים לא מכילים ממסים. הרבע השמאלי הכיל מים, והזכות הכילה attractant. כאשר בודקים odorants נדיפים, אנליטי הונח על המכסה של הצלחת, מעל רבע הראוי, ואילו תרכובות מסיסים במים הונחו ישירות על אגאr.
השיטות קיימים כיום להערכת תגובת chemotactic של ג elegans כל הזמן להיות מעודן כדי לייעל את נוחות השימוש, יעיל, ודיוק שלהם. כך, בעוד שיש לו את assay המתואר כאן את היכולת להעריך את המספר הגדול ביותר של תולעים (תפוקה המקסימלית:. 250 תולעים / לשעה לכל צלחת, מעט גדולה יותר מהתפוקה שהפגינה לי ואח' 3); הוא כוח האמיתי של שיטה זו שיאו תמציתי של רבים מהמאפיינים של מבחני קודמים (טבלת 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה / שטיפת התולעים
- לסנכרן את התולעים עד 11 בוגרים צעירים.
- מיליליטר פיפטה 2 מתוך סל S על צלחת Chemotaxis ס"מ 5 של מבוים תולעים שפשוט ניקית את הדשא של OP50 E. coli. הטה את הצלחת לפי צורך כדי להבטיח את התולעים נשטפים מפני שטח הצלחת לתוך המאגר.
- 1 מיליליטר פיפטה של הפתרון בסל תולעת-S לתוך צינור microcentrifuge.
- צנטריפוגה במשך 10 שניות תוך שימוש בPicoFuge 6,600 סל"ד.
- לשאוב סל S, משאיר את הכדור ללא הפרעה של תולעים.
- הוסף פתרון 1 S מ"ל בסל לצינור microcentrifuge, להפוך כמה פעמים כדי לשטוף את התולעים.
- חזור על שלבים 1.4-1.6 עוד שלוש פעמים.
- צנטריפוגה במשך 10 שניות פעם החמישית, הפעם aspirating supernatant לנפח סופי של CA. 100 μl.
- פיפטה μl 2 של התולעים על גבי צלחת NGM על מנת להבטיח שיש בין 50 ל 250 תולעים בכל דגימת μl 2. להתאיםהריכוז של תולעים בסל S לפי צורך על ידי resuspending את התולעים בנפח קטן יותר או גדול יותר של סל S.
- השתמש בתולעים בassay מייד לאחר שטיפה את התולעים עד שעה 1.
2. הכנת לוחות המבחן
- סימון התחתון של צלחת 5 ס"מ, לחלק את המנה ל 4 רבעים שווים. ניתן להשתמש בו אגר chemotaxis או NGM. מינימום של 3 ניסויים נדרשים לזן גנטי הנבדקים.
- סמן את העיגול ברדיוס של 0.5 ס"מ סביב המוצא (איור 1).
- סמן את נקודה בכל רבע עם או "T" עבור "מבחן" או "C" עבור "בקרה", להבטיח כי באתרים הם במרחק שווה ממקורו ואחד את השני. הנקודות חייבים להיות לפחות 2 ס"מ מהמקור. סמן את הרביעים שמאליים והימניים תחתון כעליונים רביעים מבחן וצד ימין למעלה ורביעים שמאליים תחתונים כקבוצת ביקורת (איור 1).
3. פועל Assay
4. לפרש את הציונים / קביעת מדד Chemotaxis
- לחשב את מדד chemotaxis באמצעות משוואה 1. זו תניב מדד chemotactic בין -1.0 ו 1.0.
(1)
Chemotaxis מדד = (# תולעים בשני רביעי מבחן - # תולעים בשני רביעי בקרה) / (סה"כ # מוורמס הבקיע)
ציון 1.0 מציין משיכה מקסימלי לעבר המטרה ומייצג 100% מהתולעים המגיעים ברביעים המכילים את היעד הכימי. מדד -1.0 מעיד על דחייה מקסימלי. שיטות assay דומות כבר מועסקות 3 (טבלת 1).
- דווח על ממוצע Chemotaxiשל מדד (CI) ושגיאת תקן של משמעות (SEM). לבצע מבחן t של סטודנט השוואת הנתונים מצלחות הבדיקה ובקרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השוואה בין ג פראי סוג (N2) elegans לODR-10 (ky10) שעברו המוטציה.
אנחנו השתמשנו דיאצטיל, ג ידוע chemoattractant elegans, להשוות תולעי wildtype לזה של מוטציה שחסרה את הקולטן ל1,12 דיאצטיל. לwildtype (N2) תולעי מדד chemotactic היה 0.100 ± 0.066 לאתנול, ו0.839 ± .031-.5% דיאצטיל. כצפוי, דיאצטיל מעורר תגובת chemoattractive משמעותית מwild-type תולעים (P <0.003). בניגוד לODR-10 (ky10) מוטציות שחסרו את הקולטנים דיאצטיל היו CI דיאצטיל שלא היה שונה באופן משמעותי מקבוצת הביקורת (איור 3).
| מחבר | # תולעים / צלחת | משך (דקות) | 1 תפוקה לשעה (תולעי # מקסימום) | Pros | חסרונות |
| וורד 5 | 3 | 15 | 12 | • מסלול תנועה • דין וחשבון על תולעים נייחים על ידי התבוננות ברורה | תלוי בחוקר מעורבות @ מרווחי זמן קצרים (15 דקות) |
| Bargmann & הורביץ 2 | 1 | 60 | 1 | • תפוקה נמוכה • מפזר attractant במשך 12-24 שעות | |
| Bargmann, Hartwieg, 1 הורביץ | 20-50 | 60 | 50 | • מעורבות חוקר מינימאלי (NAN 3 בשימוש) • # תולעים מתונים | • אין שיטת ניקוד הנייחת דיסקרטית • לא לעקוב אחר תנועה |
| לי, ג'י, McIntire 3 | 100-200 | 60 | 200 | • מעורבות חוקר מינימאלי (NAN 3 בשימוש) • גבוה # תולעים | |
| פירס-Shimomura, מורס, Lockery 9 | 1 | 20 (או עד ללהיטי תולעת קצה הצלחת) | 3 | • מסלול תנועה • דין וחשבון על תולעים נייחים על ידי התבוננות ברורה • תיעוד מפורט, קבוע של תנועת תולעת | דורש מערכת מעקב מחשב מתקדמת |
| מרג'י, פאלמר, צ'ין-סאנג (בשיטה זו) | 50-250 | 60 | 250 | • מעורבות חוקר מינימאלי (NAN 3 בשימוש) • • תולעי חשבונות גבוהים # לתולעים נייחים | • לא לעקוב אחר תנועה |
טבלת מס '1. השוואה בין שיטות assay תאר.
עבור: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 1. צלחת פטרי 5 ס"מ מחולקת לארבעה רבעים, שכל אחד מיועד או כמבחן ("T") או באזור בקרה ("C"). המעגל הפנימי תוחם אזור שבו תנועה היא לא הבקיע. זה מונע תולעים נייחים מגרם להטיה בנתונים. הרביעים ליצור תבנית לסירוגין של בדיקה ובקרה כדי למנוע כל הטיה שעלולה להתרחש מהמיקום הראשוני של התולעים.
איור 2. סכמטי של assay מותאם Lee et al. (2009). צלחות נחלקות למבחן הרביעים שניים (A ו-B) ושני פקדים (C & D). אזיד הנתרן כלול גם עם הנקודות הבדיקה ובקרה כדי לשתק את התולעים. תולעים ממוקמים במרכז הצלחת ולאחר 60 דקות תולעים נספרים על כל QuadraNT. אנשים שלא לחצות את המעגל הפנימי לא קלעו. דוגמאות סכמטי של ניטראלי וattractant מצוינות. מדד חישוב chemotactic (CI) מוצג להלן.
איור 3. מדדי chemotactic שנוצרו ממבחנים שבוצעו עם wild-type תולעים (WT) וODR-10 (ky10) או באמצעות דיאצטיל כattractant מבחן או אתנול (צלחות שליטה). ערכים הם ממוצעים של לפחות 3 ניסויים בלתי תלויים (N> 200 תולעים) עבור כל תנאי. ברים שגיאה משקפים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM) * = P <0.003 מבחן t של הסטודנט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chemotaxis, למרות שנשלט על ידי מערכת מורכבת של מנגנונים עצביים וסלולריים, יכול להיות בקלות ובאופן אובייקטיבי לכמת באמצעות מבחני chemotaxis. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר מכל מבחני, יש לנקוט בצעדים קריטיים מסוימים. ראשית, בימוי התולעים הוא חיוני במניב תוצאות ניסוי עולות בקנה אחד. תולעים בשלבי חיים שונים מתנהגים בצורה שונה 13; תולעים בשלב כל כך מעורבים עשויים להטות תוצאות ניסוי. שנית, להבטיח לכל א ' coli הוא לשטוף את התולעים הוא קריטי, כשיירי חיידקים עלולים להפריע לassay. כמו כן, חשוב לציין כי חומר ההרדמה, 0.5-1 אזיד M-נתרן, יעצור את התולעים ברדיוס של 1 ס"מ למקום שבו הוצב. לאור זאת, זה הוא בעל חשיבות עליונה, כי אזיד להיות ממוקם לפחות 2 ס"מ מהמקור. אם אזיד הוא הבחין 1.5 ס"מ או פחות ממקור התולעים יהיו משותקים בתוך המעגל הפנימי ואף יקבלו ניקוד. עוד אזיד ממוקם, נוסף לתוךרביעים את התולעים יכולים לזוז. גם צלחות צריכים להיות כל הזמן ברמה כדי להבטיח עקביות לאורך ניסויים ועל מנת להבטיח תוצאות לא בלבלו על ידי הטיות כבידה. בנוסף לכך, לא יותר מ 250 תולעים יש להשתמש בניסוי. צפיפות עלולה לעכב תנועת תולעת למספר סיבות. מצאנו כי תולעים התקבצו נוטים להישאר ביחד, לטובת נסיעה לרבע. לבסוף, מניח את צלחות assay על 4 מעלות צלזיוס לאחר 60 דקות שומר את התולעים מההזזה, המאפשר לחוקר לשמור על המדינה של הצלחת עד שהוא מסוגל להיות בספירה. צלחות יכולות לאחסן ב 4 ° C וכבש כעבור כמה ימים מבלי להשפיע על התוצאות.
כמה שינויים פרוצדורליים יכולים לשפר עוד יותר את השירות של פרוטוקול זה. כמו שהוא, פרוטוקול זה יכול לשמש כשיטת בדיקת מגוון של פנוטיפים בניסויים נפרדים. באופן אידיאלי, את התוצאות של ניסויי מוטציה יש להשוות באותם תנאים. שימוש בזנים שהמפורש fluorescחלבוני ent כגון GFP או RFP הייתי להשיג את זה. שינוי זה ייתן חוקר עקביות ניסיונית יותר על ידי הצבת את הזנים השונים על אותה צלחת assay ויתרון של הבקיע צלחת אחת במקום הבקיע צלחות בדיקה מול בקרה.
מבחני chemotaxis עשויים לשמש גם כדי לאפיין את התנהגות chemotactic של לנמטודות מהונדס גנטי. זה מאפשר זיקה המחייבת של קולטנים שנלקחו ממינים אחרים כדי להיבדק. אם קולטנים אלה באים לידי ביטוי בנוירונים chemoattractant או chemorepulsive של התולעת באופן תואם, יש לשים לב תוצאות chemotactic צפוי 8.
פרוטוקול זה יכול להיות מותאם יותר לצורכים אחרים גם כן. נכון לעכשיו, שיטה זו אינה מאפשרת לחוקר לעקוב אחר התנועה של תולעים. בגלל 5 ס"מ צלחות מקובלות למבחנים אלה, מצלמת וידאו המחוברת לstereomicroscope יכולה למעשה לצלם התנועהשל התולעים לכיוון רבע אחד של assay ללא השימוש בבמה ממונעת ותוכנת מעקב תולעת. לבסוף, למרות שchemoattractants מופנים בעיקר כלתרכובות הבדיקה בפרוטוקול, chemorepellents עשוי לשמש גם. פרוטוקול זה, כפי שהוא או שונה, הוא פשוט ויעיל ויכול לשמש ככלי יעיל לכימות התנהגות chemotactic של ג elegans, או להוכחת ההתנהגות לתלמידים בבית הספר התיכון או ברמת התואר הראשון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Acknowledgments
אנו מודים למדעי חיים ופקולטה לאמנויות ומדעים באוניברסיטה של המלכה למימון עבודה זו. כמו כן, אנו מודים למעבדת צ'ין-סאנג במתן החומרים הכימיים הדרושים, הציוד והתמיכה טכנית. אנו מודים גם QGEM 2011, טוני במיוחד הוא על תרומתו לדיון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave | |||
| PicoFuge | Stratagene | 400552 | |
| Microscopes | Leica | ||
| Dissecting | Leica | ||
| P1000 Pipette | Gilson | ||
| P10 Pipette | Gilson | ||
| 0.5 M Sodium Azide | |||
| Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4] | |||
| Ethanol/Distilled Water | |||
| Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl) | |||
| Agar | Bio-Rad | 166-0600 | |
| NH4Cl | Amresco | CA97062-046 | |
| MOPS | VWR | CA12001-120 | |
| NH4OH | BDH | CABDH8641-2 | |
| 0.25% Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 |
References
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-527 (1993).
- Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7, 729-742 (1991).
- Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. Ethanol preference in C. elegans. Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14, 803-812 (1995).
- Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
- Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans. Cell. 91, 161-169 (1997).
- Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).
- Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 3, e2467 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Sengupta, P., Bargmann, C. I. Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans. Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).
- Hart, A. C. Behavior. WormBook. , (1895).
