C. elegans Chemiotassi Assay

Summary

Un metodo di valutazione quantitativa della risposta chemiotattica dei

Abstract

Molti organismi utilizzare chemiotassi a cercare fonti di cibo, evitare sostanze nocive, e trovare compagni. Caenorhabditis elegans è impressionante comportamento chemiotassi.

La premessa dietro testare la risposta dei vermi a un odorizzante è quello di metterli in una zona e osservare il movimento evocata in risposta a un odorizzante. Anche con i molti saggi disponibili, ottimizzando verme partendo posizione rispetto sia al controllo e aree di test, minimizzando l'interazione di vermi con l'altro, pur mantenendo dimensioni significative campione rimane un lavoro in corso ^1-10. Il metodo qui descritto mira a risolvere questi problemi modificando il saggio sviluppato da Bargmann et al. ^1. Una capsula di Petri è diviso in quattro quadranti, due quadranti opposti contrassegnati "Test" e due sono designati "Control". Anestetico viene posto in tutti i test e siti di controllo. I vermi sono collocati nel centro del piatto con un circle segnato attorno all'origine per garantire che i vermi non mobili saranno ignorati. Utilizzando un sistema a quattro quadranti piuttosto che uno o due 2 1 elimina polarizzazione nel movimento dei vermi, come sono equidistanti dai campioni di prova e di controllo, indipendentemente da quale lato della provenienza cominciarono. Questo aggira il problema di vermi essere costretti a viaggiare attraverso un cluster di altri worm per rispondere a un odorizzante, che può ritardare vermi o costringerli a prendere un percorso più tortuoso, ottenendo una interpretazione non corretta del loro percorso previsto. Questo metodo presenta anche vantaggi pratici da avere un campione più ampio e che consente al ricercatore di eseguire il test incustodito e segnare i vermi una volta che il tempo a disposizione è scaduto.

Introduction

Ward primo sviluppato il saggio di chemiotassi nel 1973 ^5, e da allora ha avuto vasta portata delle applicazioni. Neurobiologia è un campo che ha beneficiato di utilizzare una varietà di saggi di chemiotassi. Adattamento olfattivo, una semplice forma di apprendimento e memoria, è stata dimostrata in C. elegans utilizzando saggi di chemiotassi ^6. Essi sono stati utilizzati anche per dimostrare che C. elegans possono sviluppare tolleranza etanolo-un risultato che dimostra non solo la plasticità comportamentale dei vermi, ma che mostra anche che i vermi possono essere molto utile nello studio della dipendenza umana ^3. I saggi sono stati anche sviluppati per dimostrare la capacità di C. elegans per memorizzare breve e memoria a lungo termine, mostrando che le associazioni sono fatte dai vermi tra fattori chemiotattici e cibo (OP50) ^7. Inoltre, data la vasta informazioni attualmente disponibili per quanto riguarda la C. elegans genoma, il chemotaxis comportamento di C. elegans è stato modificato numerose volte inducendo mutazioni ^1,8. Ciò consente molte possibilità ingegneria eccitanti, come lo sviluppo di C. elegans come strumento di biorisanamento. Così, dal momento che lo sviluppo iniziale del saggio chemiotassi nel 1973, è stato spesso modificato e utilizzato per spiegare i misteri in una varietà di discipline.

Alcuni saggi volti alla scoperta del percorso specifico assunto dai vermi verso un bersaglio. Il saggio prototipo di questo tipo è stato sviluppato da Ward ^5. Tre i vermi sono stati collocati su agar fuso per 15 min. I loro movimenti furono rilevati dalla impronta hanno lasciato mentre viaggiavano dalla periferia della piastra un gradiente fino a un attrattivo al centro della piastra. Tutti i vermi sulla piastra sono stati arrestati utilizzando cloroformio alla fine di ogni prova. Uno discendente di questo metodo collocato un singolo verme nel mezzo della piastra con l'attrattiva e il controllo di unt distanze uguali e contrarie dall'origine ^2.

Pierce-Shimomura et al. sviluppato un saggio per osservare l'esatta natura del movimento coinvolti nella chemiotassi ^9. Vermi individuali sono stati collocati in nove centimetri piastre di Petri o che contengono una concentrazione uniforme di una sostanza attrattiva o una sfumatura a forma radiale, che si conclude con la fonte di una sostanza attrattiva. Un programma software per computer che riconosce il verme è stata usata per registrare il comportamento osservato. Una videocamera collegata ad un microscopio lavorato in collaborazione con la fase di regolare automaticamente la piastra Petri come dosaggio corse a garantire il verme rimasto nel campo visivo. Da questo, le informazioni più dettagliate è stata scoperta per quanto riguarda la causa di piroette visualizzati da C. elegans.

Altri saggi, più simile a quello descritto qui, testato la risposta di una vasta popolazione di vermi a composti di prova. Due quadranti chemiotassi test sono statiutilizzati per esplorare i ruoli che i vari neuroni, recettori e molecole di trasduzione del segnale riprodotti quando C. elegans è stato esposto a vari composti ^1. Tra 20-50 vermi lavate sono state collocate vicino al centro del piatto con una attrattiva e un controllo ad estremità polari insieme con l'anestetico, sodio azide (NaN _3). Dopo 60 minuti, un indice chemiotattica con valori da -1.0 a +1.0 è stata generata sulla base della differenza tra il numero di vermi venivano apposta sul attrattivo o il controllo. Un indice chemiotattica simile è stato utilizzato nel saggio riportato in questo articolo, sebbene il saggio precedenza omesso di valutare rigorosamente vermi non mobili. Questo saggio è stato poi ulteriormente applicata a testare gli effetti di ablazione neuronale sulla chemiotassi.

Un'altra variante del citato saggio è stato eseguito dove 100-200 vermi sono stati collocati al centro di una piastra contenente quattro quadranti ^3. Quadranti adiacenti o contenevano il test ocontrollare la sostanza. Come in saggi precedenti, i vermi state immobilizzate con l'azione del sodio azide prima di essere ottenuto. Un metodo simile è descritto qui come un modo per valutare la risposta di C. elegans a vari composti. Tuttavia, il metodo seguito ha il vantaggio di valutare solo i vermi che hanno superato una distanza limite che separa cellulare da vermi immobili.

Altri test hanno incorporato linee guida simili per ignorare i vermi immobili. Frøkjær-Jensen et al. sviluppato un saggio versatile che può essere utilizzato per testare composti solubili sia volatili e acqua ^10. Un piatto Petri è stata divisa in quattro quadranti. I quadranti superiore e inferiore non contengono solventi. Il quadrante di sinistra conteneva acqua, e il diritto di cui il attrattivo. Quando si testano odoranti volatili, l'analita è stato posto sul coperchio del piatto, sulla corretta quadrante, mentre i composti solubili in acqua sono stati posizionati direttamente sul agar.

I metodi attualmente esistenti per valutare la risposta chemiotattica di C. elegans sono costantemente in fase di perfezionamento per ottimizzare la loro facilità d'uso, efficienza e precisione. Così, mentre il saggio descritto qui ha la capacità di valutare il maggior numero di vermi (massimo throughput:. 250 vermi / ora per piastra, leggermente maggiore della velocità dimostrata da Lee et al ^3); la vera forza di questo metodo è l' succinta culmine di molti degli attributi di test precedenti (Tabella 1).

Protocol

1. Preparazione / lavaggio dei Worms

1. Sincronizzare i vermi a giovane adulto ^11.
2. Pipettare 2 ml di basale S su una piastra 5 cm Chemiotassi di scena vermi che hanno appena eliminato il prato di OP50 E. coli. Inclinare la piastra come necessario per garantire i vermi vengono lavati dalla superficie della piastra nel buffer.
3. Pipettare 1 ml della soluzione Basal verme-S in una provetta da microcentrifuga.
4. Centrifugare per 10 secondi utilizzando un PicoFuge a 6.600 giri al minuto.
5. Aspirare il basale S, lasciando il pellet di vermi indisturbati.
6. Aggiungere 1 ml di soluzione S basale alla provetta, capovolgere un paio di volte per lavare i vermi.
7. Ripetere i passaggi 1,4-1,6 altre tre volte.
8. Centrifugare per 10 sec una quinta volta, questa volta aspirando il supernatante in un volume finale di ca. 100 l.
9. Pipettare 2 ml di vermi su una piastra NGM per garantire non ci sono tra i 50 ei 250 vermi in ciascun campione 2 microlitri. Regolarela concentrazione di vermi nella basale S come richiesto da risospendere i vermi in un volume più piccolo o più grande di S basale.
10. Utilizzare i vermi nel test subito dopo il lavaggio i vermi per un massimo di 1 ora.

2. Preparazione delle piastre di prova

1. Marcatura la parte inferiore di una piastra 5 cm, dividere il piatto in 4 quadranti uguali. Agar chemiotassi o NGM possono essere utilizzati. Un minimo di 3 studi sono necessari per ceppo genetico in fase di test.
2. Segnare un cerchio di raggio 0,5 centimetri circa l'origine (Figura 1).
3. Segnare un punto in ogni quadrante sia con una "T" per "Test" o una "C" per "controllo", assicurando che i siti sono equidistanti dalla provenienza e l'altro. I punti devono essere di almeno 2 cm di distanza dall'origine. Segna i primi quadranti a sinistra e in basso come quadranti di prova e in alto a destra e quadranti in basso a sinistra come controlli (Figura 1).

3. Esecuzione del test

Miscelare la soluzione di prova, combinando volumi uguali del composto in esame e 0,5 M azide (un anestetico utilizzato per arrestare i vermi al raggiungimento di un quadrante). Miscelare la soluzione di controllo, combinando il solvente usato per diluire il composto in esame con 0,5 M azide.

Pipettare 2 ml di soluzione di vite senza fine (preparato in 1.8) dal pellet sulla origine (dove le due linee si intersecano).

Immediatamente dopo, pipetta 2 ml di soluzione di prova sulle due siti "T". Analogamente, pipettare la stessa quantità della soluzione di controllo sui due siti "C".

Una volta che i vermi e odorante gocce sono stati assorbiti in agar, sostituire i coperchi e capovolgere le piastre.

Dopo 60 minuti, mettere i vermi in un 4 ° C incubatore. Rimuovere solo una targa dal termostato quando può essere contato. Lasciando i vermi a temperatura ambiente, può consentire loro di mobilitarsi nuovamente.

Registrare il numero di vermi in ogni quadrante che ha attraversato completamente la circ interioreLe.

Ripetere i punti da 3.2 a 3.6 utilizzando la soluzione di controllo sia nel test di controllo e quadranti. Questo servirà come la piastra di controllo. Tre di tali piastre dovrebbero essere fatte e corrono per servire come un controllo appropriato.

4. Interpretazione dei punteggi / determinare l'indice di chemiotassi

1. Calcolare l'indice di chemiotassi utilizzando l'equazione 1. Questo produrrà un indice chemiotattica tra -1.0 e +1.0.

(1)

Chemiotassi Index = (# Worms in entrambi i quadranti di prova - # Worms in entrambi i quadranti di controllo) / (Totale # di Segnate Worms)

Un punteggio di 1,0 indica attrazione massima verso il bersaglio e rappresenta il 100% dei vermi che arrivano nei quadranti contenenti il ​​bersaglio chimico. Un indice di -1.0 è la prova di repulsione massima. Metodi di analisi simili sono già stati impiegati ³ (Tabella 1).

2. Segnala il Chemotaxi medias Index (CI) ed errore standard della media (SEM). Eseguire confronto T-test di Student i dati dalle piastre di prova e di controllo.

Representative Results

Confrontando wild-type (N2) C. elegans alla ODR-10 (KY10) mutante.

Abbiamo usato diacetile, un noto C. elegans chemiotattico, confrontare vermi tipo selvatico a quello di un mutante che manca il recettore per diacetile ^1,12. Per tipo selvatico (N2) vermi l'indice chemiotattico era 0.100 ± 0.066 per l'etanolo, e 0,839 ± 0,031-0,5% diacetile. Come previsto, diacetile provoca una risposta chemoattractive significativo da worm wild-type (p <0.003). In contrasto con le ODR-10 (KY10) mutanti che manca i recettori diacetile avevano un CI diacetile che non era significativamente differente dai controlli (Figura 3).

Autore	# Vermi / piastra	Durata (min)	1 ora di throughput (max # vermi)	Pro	Contro
Ward 5	3	15	12	• Movimento pista • conto per i vermi immobili dall'osservazione chiaro	dipende coinvolgimento ricercatore @ brevi intervalli di tempo (15 min)
Bargmann & Horvitz 2	1	60	1		• bassa produttività • diffonde attrattivo per 12-24 ore
Bargmann, Hartwieg, Horvitz 1	20-50	60	50	• coinvolgimento minimo ricercatore (NaN 3 usato) • Medi di vermi	• nessun metodo di punteggio immobile discreto • non tiene movimento
Lee, Jee, McIntire 3	100-200	60	200	• coinvolgimento minimo ricercatore (NaN 3 usato) • alta #vermi
Pierce-Shimomura, Morse, Lockery 9	1	20 (o fino verme colpi bordo della piastra)	3	• Movimento pista • conto per i vermi immobili dall'osservazione chiaro • dettagliato, registrazione permanente di movimento senza fine	Richiede il sistema avanzato di monitoraggio del computer
Margie, Palmer, Chin-Sang (questo metodo)	50-250	60	250	• coinvolgimento minimo ricercatore (NaN 3 usato) • HIGH # worm • conti per vermi immobili	• non tiene movimento

Tabella 1. Confronto di metodi di analisi descritto.

Figura 1. Il piatto di cm 5 di Petri è diviso in quattro quadranti, ciascuno designato sia come test ("T") o ("C") dell'area. Il cerchio interno delinea una zona in cui il movimento non è segnato. Ciò impedisce che i vermi immobili da alterando i dati. I quadranti creano uno schema alternato di prova e di controllo per evitare qualsiasi distorsione che possono verificarsi dal collocamento iniziale dei vermi.

Figura 2. Uno schema del dosaggio adattato da (2009) Lee et al.. Piastre sono divisi in due quadranti di prova (A e B) e due controlli (C & D). La sodio azide è incluso anche con i punti di prova e di controllo per paralizzare i vermi. Vermi sono posti al centro della piastra e dopo 60 minuti vermi sono contate su ciascuna quadrant. Gli individui che non attraversano il cerchio interno non sono segnati. Sono indicati esempi schematici di neutro e attrattivo. L'Index (CI) calcolo Chemotactic è mostrato sotto.

Figura 3. Indici chemiotattici generati da test eseguiti con i vermi wild-type (WT) e ODR-10 (KY10) utilizzando sia diacetile come un attrattore di prova o etanolo (placche di comando). Valori sono medie di almeno 3 esperimenti indipendenti (n> 200 vermi) per ogni condizione. Barre di errore riflettono l'errore standard della media (SEM) * = P <0,003 T-test di Student.

Discussion

Chemiotassi, anche se controllato da un complesso insieme di meccanismi neuronali e cellulari, può essere facilmente e oggettivamente quantificato utilizzando saggi di chemiotassi. Per ottenere i migliori risultati da saggi, alcuni passaggi critici devono essere prese. In primo luogo, mettendo in scena i vermi è essenziale per produrre risultati sperimentali coerenti. Worms in diverse fasi della vita comportano in modo diverso ^13; worm stage in modo misto può risultati sperimentali skew. In secondo luogo, garantendo tutti E. coli è lavato via i vermi è fondamentale, in quanto i batteri residui possono interferire con il dosaggio. E 'anche importante notare che l'anestetico, 0,5-1 M-sodio azide, arresterà vermi entro un raggio di 1 centimetro dove era stato posto. Dato questo, è fondamentale che l'azide essere posto ad almeno 2 cm dall'origine. Se l'azide è macchiato 1,5 centimetri o meno dalla origine i vermi saranno paralizzate all'interno del cerchio interno e nessuno saranno segnati. Più la azide viene inserita, il ulteriormente nellaquadranti i vermi possono muoversi. Le lastre devono essere tenuti livello per garantire la coerenza in tutti gli studi e di garantire i risultati non sono confusi da pregiudizi gravitazionali. Inoltre, non più di 250 vermi dovrebbero essere usati nell'esperimento. Affollamento può ostacolare i movimenti verme per una serie di motivi. Abbiamo scoperto che i vermi cluster tendono a rimanere insieme, a favore di un viaggio in un quadrante. Infine, ponendo le piastre di saggio a 4 ° C dopo 60 min la mantiene i vermi di muoversi, permettendo al ricercatore di preservare lo stato della piastra finché non è in grado di essere contati. Piastre possono conservati a 4 ° C e ha ottenuto parecchi giorni dopo senza influenzare i risultati.

Alcune modifiche procedurali possono migliorare ulteriormente l'utilità di questo protocollo. Come è, questo protocollo può servire come un metodo per testare una varietà di fenotipi in prove separate. Idealmente, i risultati delle prove mutanti dovrebbero essere confrontati alle stesse condizioni. Utilizzando ceppi che esprimono flproteine ​​renti come GFP o RFP sarebbero realizzare questo. Questa modifica darebbe il ricercatore maggiore coerenza sperimentale posizionando i vari ceppi sulla stessa piastra di saggio e il beneficio di aver realizzato una piastra invece di aver realizzato piastre di prova contro controllo.

Saggi di chemiotassi possono anche essere utilizzati per caratterizzare il comportamento chemiotattica dei vermi nematodi geneticamente. Questo permette l'affinità di legame dei recettori prelevati da altre specie da testare. Se questi recettori sono espressi nei neuroni chemoattractant o chemorepulsive del worm in modo compatibile, i risultati attesi chemotattici devono essere osservate ^8.

Questo protocollo può essere ulteriormente adattato per soddisfare altre esigenze pure. Attualmente, questo metodo non permette al ricercatore di seguire i movimenti dei vermi. Poiché 5 piastre cm sono accettabili per questi saggi, una videocamera collegata ad un stereomicroscopio può filmare efficacemente il movimentodei vermi verso un quadrante del dosaggio senza l'uso di uno stadio motorizzato e software di monitoraggio verme. Infine, sebbene chemoattractants sono indicati principalmente come i composti di prova nel protocollo, possono anche essere utilizzati chemorepellents. Questo protocollo, come è o modificato, è semplice ed efficace e può servire come uno strumento efficace per quantificare il comportamento chemiotattica di C. elegans, o per dimostrare il comportamento di studenti della scuola superiore o di livello universitario.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave
PicoFuge	Stratagene	400552
Microscopes	Leica
Dissecting	Leica
P1000 Pipette	Gilson
P10 Pipette	Gilson
0.5 M Sodium Azide
Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Ethanol/Distilled Water
Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)
Agar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0.25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531