C. elegans kemotaxianalys

Summary

En metod för att kvantitativt utvärdera den kemotaktiska responsen av

Abstract

Många organismer använder chemotaxis att söka mat källor, undvika skadliga ämnen, och hitta kompisar. Caenorhabditis elegans har imponerande chemotaxis beteende.

Premissen bakom testa svaret av maskar till en luktämnen är att placera dem i ett område och observera rörelsen framkallade ett svar på ett doftämne. Även med de många tillgängliga analyser, optimera mask startplatsen i förhållande till både skydds-och provningsmetoder, samtidigt minimera interaktionen av maskar med varandra, samtidigt som en betydande urvalsstorleken fortfarande ett pågående arbete ^1-10. Den metod som beskrivs här syftar till att hantera dessa frågor genom att modifiera analysen utvecklats av Bargmann et al. ^1. En petriskål är indelad i fyra kvadranter, är två motsatta kvadranter märkta "Test" och två betecknas "Control". Narkos placeras i alla tester och platser kontroll. Maskarna är placerade i mitten av plattan med en circle märkta kring ursprunget för att säkerställa att icke-rörliga maskar kommer att ignoreras. Använda en fyra-kvadranten system snarare än en 2 eller två 1 eliminerar bias i rörelse maskar, eftersom de är på samma avstånd från test-och kontrollprover, oavsett vilken sida av ursprunget de började. Detta kringgår problemet med maskar tvingas att resa genom ett kluster av andra maskar att svara på ett doftämne, vilket kan försena maskar eller tvinga dem att ta en mer omväg, vilket gav en felaktig tolkning av den avsedda banan. Denna metod visar också praktiska fördelar genom att ha en större urvalsstorlek och låta forskare för att köra analysen obevakad och göra maskarna när den tilldelade tiden har gått ut.

Introduction

Ward utvecklades först kemotaxianalys 1973 ^5, och sedan dess har haft långtgående program. Neurobiologi är ett område som har dragit nytta av att använda en variation av kemotaxi-analyser. Olfactory anpassning, en enkel form av inlärning och minne, har visats i C. elegans använder chemotaxis analyser ^6. De har också använts för att visa att C. elegans kan utveckla etanol tolerans-ett resultat som inte bara visar den beteendemässiga plasticitet av maskar, men det visar också att maskarna kan vara mycket användbar i studiet av alkoholberoende hos människor ^3. Analyser har även utvecklats för att visa förmågan hos C. elegans för att lagra kort och lång sikt minne genom att visa att föreningar görs av maskar mellan kemoattraktanter och livsmedel (OP50) ^7. Dessutom, med tanke på den omfattande information som för närvarande finns tillgänglig angående C. elegans genomet, den kemotaxis beteende C. elegans har ändrats flera gånger genom att inducera mutationer ^1,8. Detta möjliggör många spännande tekniska möjligheter, t.ex. utvecklingen av C. elegans som en biologisk rening verktyg. Således, eftersom den inledande utvecklingen av kemotaxianalys 1973, har det ofta ändrats och används för att belysa mysterier i en mängd olika discipliner.

Vissa analyser som syftar till att upptäcka den specifika resväg som maskar mot ett mål. Den prototypiska analysen av detta slag har utvecklats av Ward ^5. Tre maskar placerades på smält agar i 15 min. Deras rörelser spårades av avtryck de lämnade när de reste från plattans periferi uppförslut till ett lockmedel i mitten av plattan. Alla maskar på plattan greps med kloroform vid slutet av varje prov. En ättling av denna metod placeras en enda mask i mitten av plattan med attraktant och kontrollen ent lika och motsatta avstånd från ursprunget ^2.

Pierce-Shimomura et al. utvecklat ett test för att observera exakt vilken typ av rörelse involverad i kemotaxis ^9. Enskilda maskar placerades i 9 cm petriskålar antingen innehåller en likformig koncentration av lockbete eller ett radiellt formad gradient, som kulminerade i källan av lockmedel. Ett datorprogram program som kände igen masken användes för att registrera det observerade beteendet. En videokamera ansluten till ett mikroskop arbetade i samband med steget att justera petriskål automatiskt Som analysmetod sprang att säkerställa masken kvar i synfältet. Från denna, var mer detaljerad information upptäckt om orsaken till piruetter visas av C. elegans.

Andra analyser, mer liknar den som beskrivs här, testade svaret av en stor population av maskar till testföreningar. Två-kvadrant kemotaxi analyser haranvänds för att utforska de roller som olika nervceller, receptorer, och signalmolekyler transduktion spelas när C. elegans utsattes för olika föreningar ^1. Mellan 20-50 tvättade maskar placerades nära mitten av plattan med ett lockmedel och en kontroll vid polära ändar tillsammans med bedövningsmedel, natriumazid _(NaN3). Efter 60 minuter, var en kemotaktiskt index med värden från -1.0 till +1.0 genereras baserat på skillnaden mellan hur många maskar var fäst på lockmedel eller kontrollen. En liknande kemotaktiskt index användes i analysen redovisas i denna artikel, även om den tidigare analysen misslyckats med att strikt utvärdera icke-rörliga maskar. Denna analys sedan ytterligare appliceras testa effekterna av neuronal ablation på kemotaxi.

En annan variant av den tidigare nämnda analysen utfördes där 100-200 maskar placerades vid mitten av en platta innehållande fyra kvadranter ^3. Intilliggande kvadranter innehöll antingen testet ellerstyra ämnet. Liksom i tidigare analyser, var maskar immobiliserades genom inverkan av natriumazid innan de scored. En liknande metod beskrivs här som ett sätt att utvärdera svaret av C. elegans till olika föreningar. Däremot har metoden nedan den extra fördelen att endast utvärdera maskar som har passerat en tröskel avståndet mellan mobil från orörliga maskar.

Andra analyser har införlivat liknande riktlinjer för att ignorera orörliga maskar. Frøkjær-Jensen et al. utvecklat en mångsidig analys som kan användas för att testa både flyktiga och vattenlösliga föreningar ^10. En petriskål var uppdelad i fyra kvadranter. De övre och nedre kvadranter inte innehåller lösningsmedel. Den vänstra kvadranten innehöll vatten, och rätten innehöll lockmedel. Vid testning av flyktiga doftämnen, var analyten placeras på locket på skålen, över den riktiga kvadranten, medan vattenlösliga föreningar placerades direkt på agar.

De metoder som för närvarande existerar för att utvärdera det kemotaktiska svaret av C. elegans ständigt förfinas för att optimera sin användarvänlighet, effektivitet, och noggrannhet. Så, medan analysen beskrivs här har förmågan att bedöma det största antalet maskar (maximal genomströmning:. 250 maskar / timme per platta, något större än genomströmningen demonstreras av Lee et al ^3), den verkliga styrkan i denna metod är att kortfattad kulmen på många av de attribut av tidigare analyser (tabell 1).

Protocol

Ett. Förbereda / tvätta Worms

1. Synkronisera maskar till unga vuxna ^11.
2. Pipettera 2 ml av S Basal på en 5 cm Chemotaxis tallrik iscensatt maskar som just har rensat gräsmattan av OP50 E. coli. Luta plattan som behövs för att säkerställa maskar tvättas från plattans yta i bufferten.
3. Pipettera 1 ml av masken-S Basal lösningen i ett mikrocentrifugrör.
4. Centrifugera i 10 sekunder med hjälp av en PicoFuge vid 6.600 rpm.
5. Sug S Basal, lämnar pellet av maskar ostörda.
6. Tillsätt 1 ml S Basal lösning på mikrocentrifugrör, invertera ett par gånger för att tvätta maskar.
7. Upprepa steg 1,4-1,6 ytterligare tre gånger.
8. Centrifugera i 10 sek en femte gång, denna gång aspirera supernatanten till en slutlig volym av ca. 100 | il.
9. Pipettera 2 mikroliter av maskar på en NGM platta att se till att det finns mellan 50 och 250 maskar i varje 2 pl prov. Justerakoncentrationen av maskar i S Basal efter behov genom återsuspendering av maskar i en mindre eller större volym S Basal.
10. Använd maskar i analysen omedelbart efter tvättning av maskar i upp till 1 timme.

2. Förbereda provplattorna

1. Märkning undersidan av en 5 cm platta, dela upp skålen i 4 lika stora kvadranter. Kemotaxi agar eller NGM kan användas. Minst 3 försök krävs per genetisk belastning testas.
2. Markera en cirkel med radien 0,5 cm runt ursprung (figur 1).
3. Markera en punkt i varje kvadrant med antingen ett "T" för "Test" eller ett "C" för "Control" se till att platserna är på samma avstånd från origo och varandra. Poängen skall vara minst 2 cm från ursprunget. Markera de bästa vänstra och nedre högra kvadranter som testar kvadranter och den övre högra och nedre vänstra kvadranter som kontroller (Figur 1).

Tre. Körning av analysen

Blanda provlösningen genom att kombinera lika volymer av test föreningen och 0,5 M azid (ett bedövningsmedel som används för att arrestera de maskar på att nå en kvadrant). Blanda kontrollösningen genom att kombinera det lösningsmedel som används för att späda testföreningen med 0,5 M azid.

Pipettera 2 ìl av masken lösningen (beredd enligt 1.8) från pelleten till origo (där två linjer korsar varandra).

Omedelbart efter, pipett 2 | il av testlösningen på de två "T"-platser. Likaså pipettera samma mängd kontrollösningen på de två "C"-platser.

När masken och luktämnen droppar har absorberats i agar, byt locken och vänd plattorna.

Efter 60 minuter, placera maskar i ett 4 ° C inkubator. Bara ta en tallrik ur kuvösen när det kan räknas. Lämnar maskar i rumstemperatur kan tillåta dem att mobilisera igen.

Anteckna antalet maskar i varje kvadrant som helt korsade inre circle.

Upprepa steg från 3,2 till 3,6 med hjälp av kontrollen lösningen i både test och kvadranter kontroll. Detta kommer att fungera som kontroll plattan. Tre sådana plattor bör göras och springa för att tjäna som en lämplig kontroll.

4. Tolka Scores / Bestämma Chemotaxis Index

1. Beräkna chemotaxis index med ekvation 1. Detta kommer att ge en kemotaktiskt index mellan -1,0 och +1,0.

(1)

Kemotaxi Index = (# Worms I båda Test Quadrants - # Worms i både kontroll Quadrants) / (Totalt # skårade Worms)

A +1,0 poäng visar maximal attraktion mot målet och representerar 100% av de maskar som anländer i kvadranter som innehåller den kemiska målet. Ett index av -1,0 är bevis av maximal repulsion. Liknande analysmetoder har redan använts ³ (tabell 1).

2. Redovisa genomsnittet kemotaxis Index (CI) och standard error av medelvärdet (SEM). Utför ett Students t-test som jämförde data från test-och kontroll plattor.

Representative Results

Jämföra vildtyp (N2) C. elegans till ODR-10 (KY10)-mutant.

Vi använde diacetyl, en känd C. elegans kemoattrahent, att jämföra vild typ maskar till det av en mutant som saknar receptorn för diacetyl ^1,12. För vildtyp (N2) maskar den kemotaktiska index var 0,100 ± 0,066 till etanol, och 0,839 ± 0,031 till 0,5% diacetyl. Som förväntat framkallar diacetyl en betydande chemoattractive svar från vildtyp maskar (P <0,003). I motsats ODR-10 (KY10) mutanter som saknar diacetyl receptorerna hade en diacetyl CI som inte skilde sig signifikant från kontrollerna (Figur 3).

Författare	# Maskar / platta	Varaktighet (min)	1 timme genomströmning (max # maskar)	Pros	Nackdelar
Ward 5	3	15	12	• spåra rörelse • redogöra för orörliga maskar genom tydlig observation	beroende av forskare medverkan @ korta tidsintervall (15 min)
Bargmann & Horvitz 2	1	60	1		• låg genomströmning • attraherande diffunderar för 12-24 tim
Bargmann, Hartwieg, Horvitz en	20-50	60	50	• minimal forskare inblandning (NaN 3 används) • Medel # maskar	• ingen diskret orörlig scoringmetod • inte spåra rörelse
Lee, Jee, McIntire 3	100-200	60	200	• minimal forskare inblandning (NaN 3 används) • hög #maskar
Pierce-Shimomura, Morse, Lockery 9	1	20 (eller tills masken träffar kanten på plattan)	3	• spåra rörelse • redogöra för orörliga maskar genom tydlig observation • detaljerad, permanent bevis på masken rörelse	kräver avancerade system dator tracking
Margie, Palmer, Chin-Sang (denna metod)	50-250	60	250	• minimal forskare inblandning (NaN 3 används) • HIGH # maskar • står för orörliga maskar	• inte spåra rörelse

Tabell 1. Jämförelse av analysmetoder beskrivits.

Figur 1. Den 5 cm petriskål är uppdelad i fyra kvadranter, varje designerad antingen som Test ("T") eller Control ("C")-området. Den inre cirkeln skisserar ett område där rörelsen inte görs. Detta förhindrar orörliga maskar från missvisande uppgifter. De kvadranter skapar ett växlande mönster av test och kontroll för att förhindra någon bias som kan uppstå från den ursprungliga placeringen av maskar.

Figur 2. En schematisk av analysen anpassas från Lee et al. (2009). Är uppdelade i kvadranter två prov (A & B) och två kontroller (C & D) Plattorna. Natriumazid ingår också med test-och kontroll fläckar att paralysera maskar. Worms är placerade i mitten av plattan och efter 60 minuter maskar räknas på varje quadrant. Individer som inte korsar den inre cirkeln inte gjorde. Schematiskt exempel på neutrala och lockmedel anges. Den kemotaktiska indexet (Cl) beräkning visas nedan.

Figur 3. Kemotaktiska index som genereras från analyser utförda med vildtyp (wt) och ODR-10 (KY10) maskar använder antingen diacetyl som ett test lockmedel eller etanol (manövreringsplattorna). Värdena är medelvärden från minst tre oberoende experiment (n> 200 maskar) för varje tillstånd. Felstaplar återspeglar standardfelet för medelvärdet (SEM) * = P <0,003 Student T-test.

Discussion

Chemotaxis, men styrs av en komplex uppsättning av neuronala och cellulära mekanismer, kan vara enkelt och objektivt kvantifieras med hjälp chemotaxis analyser. För att få bästa resultat från analyserna, måste vissa viktiga steg tas. För det första iscensättning maskarna är nödvändigt ger konsekventa experimentella resultat. Worms vid olika livsstadier beter sig annorlunda ^13, så blandade skede maskar får skeva experimentella resultat. Det andra, säkerställer att allt E. coli tvättas bort maskarna är avgörande, eftersom kvarvarande bakterier kan störa analysen. Det är också viktigt att notera att bedövningsmedlet, 0,5-1 M-natriumazid, griper maskar inom en 1 cm radie av där den placerades. Mot denna bakgrund är det av största vikt att azid placeras minst 2 cm från ursprunget. Om azid är fläckig 1,5 cm eller mindre från ursprunget maskar kommer bli förlamad i den inre kretsen och inget görs. Ju längre aziden är placerad, ju längre in ikvadranter maskarna kan röra sig. Plattorna bör också hållas för att säkerställa enhetlighet i studierna och för att säkerställa resultat inte förväxlas med gravitationen fördomar. Dessutom bör inte mer än 250 maskar användas i experimentet. Trängsel kan hindra masken rörlighet för ett antal skäl. Vi fann att klustrade maskar tenderar att hålla ihop, till förmån för att resa till en kvadrant. Slutligen placera analysplattoma vid 4 ° C efter det att 60 min håller maskar från att röra sig, vilket gör att forskaren att bevara tillståndet av plattan tills den kan räknas. Plattorna kan lagras vid 4 ° C och avslutade flera dagar senare utan att påverka resultaten.

Några processuella förändringar kan ytterligare öka nyttan av detta protokoll. Som är, kan detta protokoll används som en metod för att testa en mängd olika fenotyper i separata försök. Helst bör resultaten av de mutanta försöken jämföras under samma betingelser. Använda stammar som uttrycker fluorescerent proteiner såsom GFP eller RFP skulle åstadkomma detta. Denna ändring skulle ge forskaren större experimentella konsistens genom att placera de olika stammarna på samma analys plattan och nyttan av att ha gjort en platta i stället för att ha dödat test-kontra kontroll plattor.

Chemotaxis analyser kan också användas för att karaktärisera kemotaktiska beteende genmanipulerade nematod maskar. Detta medger att bindningsaffiniteten av receptorer som tagits från andra arter som skall testas. Om dessa receptorer uttrycks i kemoattraktanten eller chemorepulsive nervceller i masken på ett kompatibelt sätt, bör förväntade kemotaktiska resultat observeras ^8.

Detta protokoll kan anpassas ytterligare för att passa andra behov också. För närvarande tillåter inte denna metod inte utredaren att följa utvecklingen av maskar. Eftersom 5 cm plattor är acceptabelt för dessa analyser, kan en videokamera kopplad till ett stereomikroskop filma effektivt rörelsenav maskarna mot en kvadrant av analysen utan användning av en motoriserad scen och mask mjukvara. Slutligen, även kemoattraktanter främst kallas testföreningarna i protokollet, får chemorepellents också användas. Detta protokoll, som är eller modifieras, är enkel och effektiv och kan fungera som ett effektivt verktyg för att kvantifiera chemotactic beteende C. elegans, eller för att demonstrera beteende till eleverna på högstadiet eller grundnivå.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave
PicoFuge	Stratagene	400552
Microscopes	Leica
Dissecting	Leica
P1000 Pipette	Gilson
P10 Pipette	Gilson
0.5 M Sodium Azide
Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Ethanol/Distilled Water
Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)
Agar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0.25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531