Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

C. elegans Chemotaxis Assay

doi: 10.3791/50069 Published: April 27, 2013

Summary

Werkwijze voor het kwantitatief beoordelen van de chemotactische respons van

Abstract

Veel organismen gebruiken chemotaxis te zoeken naar voedsel bronnen, vermijd schadelijke stoffen, en vind mates. Caenorhabditis elegans heeft indrukwekkende chemotaxis gedrag.

Het idee achter het testen van de respons van de wormen een geurstof is om ze in een gebied en let op de beweging opgewekt in reactie op een geurstof. Zelfs met de vele beschikbare testen, optimaliseren worm startlocatie ten opzichte van zowel de controle-en test-gebieden, terwijl het minimaliseren van de interactie van wormen met elkaar, met behoud van een significante omvang steekproef blijft een work in progress 1-10. De hier beschreven methode is bedoeld om deze problemen aan te pakken door een wijziging van de test is ontwikkeld door Bargmann et al.. 1. Een petrischaal verdeeld in vier kwadranten, worden twee tegengestelde kwadranten gemerkt "Test" en twee aangeduid als "Controle". Verdoving wordt geplaatst in alle test-en controle sites. De wormen worden geplaatst in het midden van de plaat met een circle gemarkeerd rond de oorsprong te waarborgen dat niet-beweeglijke wormen zullen worden genegeerd. Met behulp van een vier-kwadrant systeem in plaats van een 2 of twee 1 elimineert bias in de beweging van de wormen, omdat ze op gelijke afstand van test-en controlemonsters, ongeacht welke kant van de oorsprong zij begonnen. Dit omzeilt het probleem van de wormen worden gedwongen om te reizen via een cluster van andere wormen om te reageren op een geurstof, die wormen kunnen vertragen of hen dwingen om een ​​meer omslachtige route te nemen, waardoor een onjuiste interpretatie van de beoogde pad. Deze methode toont ook praktische voordelen van het hebben van een grotere steekproef en waardoor de onderzoeker aan de test zonder toezicht draaien en scoren de wormen zodra de toegewezen tijd is verstreken.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ward eerst de chemotaxis assay ontwikkeld in 1973 5, en sindsdien is het verreikende toepassingen heeft gehad. Neurobiology is een veld dat heeft geprofiteerd van met verschillende chemotaxis assays. Olfactorische aanpassing, een eenvoudige vorm van leren en geheugen, is aangetoond in C. elegans gebruikt chemotaxis assays 6. Zij zijn ook gebruikt om aan te tonen dat C. elegans kan ontwikkelen ethanol tolerantie-een resultaat dat niet alleen toont de gedrags plasticiteit van de wormen, maar toont ook dat de wormen zeer nuttig zijn in de studie van alcoholafhankelijkheid in mensen 3. Assays ook ontwikkeld om het vermogen van C. tonen elegans op korte en lange termijn geheugen opslaan door te laten zien dat verenigingen zijn gemaakt door de wormen tussen chemoattractanten en levensmiddelen (OP50) 7. Bovendien, gezien de uitgebreide informatie die momenteel beschikbaar is over de C. elegans genoom, de chemotaxis gedrag van C. elegans is vele malen veranderd door het induceren van mutaties 1,8. Dit zorgt voor vele interessante technische mogelijkheden, zoals de ontwikkeling van C. elegans als een bioremediation tool. Aldus, aangezien de initiële ontwikkeling van de chemotaxis assay in 1973, het is vaak gewijzigd en gebruikt om geheimen in verschillende disciplines helderen.

Bepaalde tests die gericht zijn op de specifieke route van de wormen in de richting van een doelwit te ontdekken. De prototypische assay dergelijke ontwikkeld door Ward 5. Drie wormen op gesmolten agar gedurende 15 minuten geplaatst. Hun bewegingen werden getraceerd door de afdruk ze vertrokken als zij reisden van de omtrek van de plaat tot een gradiënt van een lokstof in het midden van de plaat. Alle wormen op de plaat werden aangehouden met chloroform aan het einde van elke proef. Een afstammeling van deze methode geplaatst een worm in het midden van de plaat met de lokstof en het bedieningsorgaan eent gelijke en tegengestelde afstanden van de oorsprong 2.

Pierce-Shimomura et al.. een test ontwikkeld om de precieze aard van de beweging die deze chemotaxis 9 waarnemen. Individuele wormen werden in 9 cm Petrischalen hetzij met een uniforme concentratie van de lokstof of radiaal gevormde gradiënt, culminerend in de bron van de attractant. Een computer-softwareprogramma dat de worm opgenomen werd gebruikt om het waargenomen gedrag opnemen. Een video camera aan een microscoop werkt in samenhang met het stadium van de petrischaal automatisch de assay rende te zorgen voor de worm bleef het gezichtsveld. Hieruit werd meer gedetailleerde informatie ontdekt over de oorzaak van pirouettes weergegeven C. elegans.

Andere assays, meer vergelijkbaar met de hier beschreven, testten de reactie van een grote populatie van wormen testverbindingen. Tweekwadrantentechnologie chemotaxis assays zijn geweestgebruikt om de rollen te ontdekken dat verschillende neuronen, receptoren en signaaltransductie moleculen afgespeeld als C. elegans werd blootgesteld aan verschillende verbindingen 1. 20-50 gewassen wormen in het midden van de plaat gebracht met een attractant een controle aan polaire uiteinden samen met de verdoving, natriumazide (NaN3). Na 60 min werd een chemotactische index waarden van -1,0 tot +1,0 gegenereerd op basis van het verschil tussen het aantal wormen werden aangebracht op de lokstof of control. Een soortgelijke chemotactische index werd gebruikt in de assay die in dit artikel, zal de genoemde assay geen niet-beweeglijke wormen strikt evalueren. Deze test werd vervolgens verder toegevoerd aan het testen van de effecten van neuronale ablatie op chemotaxis.

Een andere variant van de bovengenoemde test werd uitgevoerd waarbij 100-200 wormen werden geplaatst in het midden van een plaat met vier kwadranten 3. Aangrenzende kwadranten ofwel bevatte de test ofbeheersen stof. Zoals in eerdere assays werden de wormen geïmmobiliseerd door de werking van natriumazide alvorens gescoord. Een soortgelijke werkwijze wordt beschreven als een vorm van evaluatie van de respons van C. elegans verschillende verbindingen. Echter, de onderstaande methode heeft het extra voordeel van slechts evalueren wormen die een drempel afstand tussen mobiele van immobiele wormen zijn verstreken.

Andere testen hebben soortgelijke richtlijnen voor het negeren van immobiele wormen opgenomen. Frøkjær-Jensen et al.. ontwikkelde een veelzijdige assay die kan worden gebruikt om zowel vluchtige en wateroplosbare testverbindingen 10. Een petrischaal werd verdeeld in vier kwadranten. De bovenste en onderste kwadranten geen oplosmiddelen bevatten. De linker kwadrant bevatte water, en de rechter bevatte de lokstof. Bij het testen van vluchtige geurstoffen, is de analyt geplaatst op het deksel van de schaal op de juiste kwadrant, terwijl water oplosbare verbindingen direct aan de aga geplaatstr.

De methoden die momenteel bestaan ​​voor het evalueren van de chemotactische respons van C. elegans worden voortdurend verfijnd om hun gebruiksgemak, efficiëntie en nauwkeurigheid te optimaliseren. Dus, terwijl de hier beschreven assay heeft de mogelijkheid van het beoordelen van de grootste aantal wormen (maximum throughput:. 250 worms / uur per plaat, iets groter dan de doorzet aangetoond door Lee et al. 3), de echte kracht van deze methode is de beknopte resultaat van vele kenmerken van eerdere tests (Tabel 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Voorbereiding / wassen van de Worms

  1. Synchroniseer wormen tot jong-volwassene 11.
  2. Pipetteer 2 ml van de S Basale op een 5 cm Chemotaxis plaat van geënsceneerde wormen die net het gazon van OP50 E. hebben gewist coli. Tilt de plaat als nodig is om te zorgen voor de wormen worden gewassen uit het plaatoppervlak in de buffer.
  3. Pipetteer 1 ml van de worm-S Basal oplossing in een microcentrifugebuis.
  4. Centrifugeer gedurende 10 sec met een PicoFuge bij 6.600 rpm.
  5. Zuig het S Basal, waardoor de pellet van wormen ongestoord.
  6. Voeg 1 ml S Basal oplossing voor de microcentrifugebuis, keert een paar keer om de wormen te wassen.
  7. Herhaal stappen 1,4-1,6 nog drie keer.
  8. Centrifugeer gedurende 10 sec vijfde maal, ditmaal afzuigen het supernatant tot een eindvolume van ca.. 100 pl.
  9. Pipetteer 2 pi van de wormen op een NGM plaat te verzekeren dat er tussen de 50 en 250 wormen in elk 2 pl monster. Aanpassende concentratie van wormen in de S Basal indien nodig door resuspenderen de wormen in een kleiner of groter volume Basal S.
  10. Gebruik de wormen in de test onmiddellijk na het wassen van de wormen tot 1 uur.

2. Voorbereiden van de Test Platen

  1. Markeren van de onderkant van een 5 cm bord, verdeel het gerecht in 4 gelijke kwadranten. Chemotaxis agar of NGM worden gebruikt. Een minimum van 3 proeven vereist per genetische stam getest.
  2. Markeer een cirkel met een straal van 0,5 cm rondom de herkomst (figuur 1).
  3. Markeer een punt in elk kwadrant met ofwel een "T" voor "Test" of "C" voor "Control" zodat de sites op gelijke afstand van de oorsprong en elkaar. De punten moeten minstens 2 cm van de oorsprong. Markeer de linksboven en rechtsonder kwadranten als test-kwadranten en rechtsboven en linksonder kwadranten als controles (figuur 1).

3. Rijdt de Assay

  • Meng de testoplossing door het combineren van gelijke volumes van de proefverbinding en 0,5 M azide (een anestheticum voor de wormen arresteren bij het bereiken van een kwadrant). Meng de controlevloeistof door het combineren van het gebruikte oplosmiddel voor de testverbinding met 0,5 M azide verdunnen.
  • Pipetteer 2 pi van de worm-oplossing (bereid in 1.8) van de pellet op de oorsprong (waar de twee lijnen elkaar kruisen).
  • Onmiddellijk daarna pipet 2 pl van de testoplossing op de twee "T" sites. Ook pipet dezelfde hoeveelheid controleoplossing op de twee "C" sites.
  • Zodra de worm en geurstof druppels zijn opgegaan in de agar, vervang de deksels en omkeren van de platen.
  • Na 60 min, plaatst de wormen in een 4 ° C incubator. Verwijder slechts een plaat uit de incubator wanneer het kan worden geteld. Het verlaten van wormen bij kamertemperatuur kan hen in staat stellen om opnieuw te mobiliseren.
  • Noteer het aantal wormen in elk kwadrant dat de binnenste circ volledig gekruistle.
  • Herhaal de stappen 3,2-3,6 met behulp van de controle-oplossing in zowel de test-en controle kwadranten. Dit zal dienen als controle bord. Drie van dergelijke platen moet worden gemaakt en uitgevoerd om te dienen als een geschikte controle.
  • 4. Het interpreteren van de scores / Bepaling van de Chemotaxis Index

    1. Bereken de chemotaxis index met behulp van Vergelijking 1. Dit zal een chemotactische index tussen -1,0 en +1,0 opleveren.

    (1)

    Chemotaxis index = (# Wormen in beide Test Quadrants - # Wormen in beide Controle Quadrants) / (Totale # gescoorde Worms)

    Een 1,0 score duidt op maximale aantrekkingskracht naar het doel en vertegenwoordigt 100% van de wormen die aankomen in de kwadranten met de chemische doelwit. Een index van -1.0 is het bewijs van de maximale afstoting. Soortgelijke testwerkwijzen reeds gebruikt 3 (Tabel 1).

    1. Vermeld de gemiddelden Chemotaxis Index (CI) en de standaardafwijking van de gemiddelde (SEM). Kunnen T-toets van Student vergelijken van de gegevens van de test en controle platen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Het vergelijken van wild-type (N2) C. elegans aan de ODR-10 (KY10) mutant.

    We gebruikten diacetyl, een bekende C. elegans chemoattractant te wildtype wormen vergelijken met die van een mutant de receptor diacetyl 1,12 mist. Voor wildtype (N2) wormen de chemotactische index was 0,100 ± 0,066 tot ethanol en 0,839 ± 0,031-0,5% diacetyl. Zoals verwacht, diacetyl lokt een aanzienlijke chemoattractive reactie van wildtype wormen (P <0.003). In tegenstelling tot de ODR-10 (KY10) mutanten die het diacetyl receptoren mist had een diacetyl CI die niet significant verschillend van de controles (figuur 3) was.

    Auteur # Wormen / plaat Duur (min) 1 hr doorvoer (max # wormen) Voors Cons
    Ward 5 3 15 12 • spoor beweging
    • rekening voor immobiele wormen door duidelijke observatie
    afhankelijk onderzoeker betrokkenheid @ korte tijdsintervallen (15 min)
    Bargmann & Horvitz 2 1 60 1 • lage doorvoersnelheid
    • attractant diffundeert gedurende 12-24 uur
    Bargmann, Hartwieg, Horvitz 1 20-50 60 50 • minimale onderzoeker betrokkenheid (NaN 3 gebruikt)
    • matige # wormen
    • geen discrete immobiel scoremethode
    • geen beweging te volgen
    Lee, Jee, McIntire 3 100-200 60 200 • minimale onderzoeker betrokkenheid (NaN 3 gebruikt)
    • hoge #wormen
    Pierce-Shimomura, Morse, Lockery 9 1 20 (of tot worm treffers rand van de plaat) 3 • spoor beweging
    • rekening voor immobiele wormen door duidelijke observatie
    • gedetailleerde, permanente registratie van de worm beweging
    vereist geavanceerde computer volgsysteem
    Margie, Palmer, Chin-Sang (deze methode) 50-250 60 250 • minimale onderzoeker betrokkenheid (NaN 3 gebruikt)
    • hoge # wormen • goed voor immobiele wormen
    • geen beweging te volgen

    Tabel 1. Vergelijking van testmethoden beschreven.


    Figuur 1. De 5 cm petrischaal is verdeeld in vier kwadranten, elk aangewezen hetzij als Test ("T") of Control ("C") gebied. De binnenste cirkel bakent een gebied waar beweging niet wordt gescoord. Dit voorkomt immobiel wormen van vertekening van de gegevens. De kwadranten creëren een afwisselend patroon van de test en controle om eventuele vertekening die kan ontstaan ​​vanaf de eerste plaatsing van de wormen te voorkomen.

    Figuur 2
    Figuur 2. Een schema van de assay aangepast van Lee et al.. (2009). Platen worden onderverdeeld in kwadranten twee testen (A en B) en twee controles (C en D). Natriumazide is ook opgenomen met de Test-en controle plekken om wormen te verlammen. Wormen worden geplaatst in het midden van het bord en na 60 minuten wormen geteld op elke quadrant. Personen die niet de binnenste cirkel had steken worden niet gescoord. Schematische voorbeelden van neutrale en attractant aangegeven. De chemotactische index (CI) berekening is hieronder weergegeven.

    Figuur 3
    Figuur 3. Chemotactische indexen gegenereerd uit testen uitgevoerd met wild-type (wt) en ODR-10 (KY10) wormen met behulp van diacetyl als test lokstof of ethanol (controle platen). Waarden zijn gemiddelden van minstens 3 onafhankelijke experimenten (n> 200 wormen) voor elke aandoening. Error bars geven de standaardafwijking van het gemiddelde (SEM) * = P <T-toets 0.003 Student's.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Chemotaxis, hoewel bestuurd door een complexe set van neuronale en cellulaire mechanismen gewoon objectief bepaald middels chemotaxis assays kunnen worden. Om de beste resultaten van de testen te verkrijgen, moeten bepaalde kritische stappen worden genomen. Ten eerste, de enscenering van de wormen is essentieel in waardoor consistente experimentele resultaten. Wormen in verschillende levensfasen zich anders gedragen 13; dus gemengde stadium wormen kan skew experimentele resultaten. Ten tweede, het waarborgen van alle E. coli afgewassen wormen cruciaal, aangezien resterende bacteriën kunnen interfereren met de test. Het is ook belangrijk op te merken dat de verdoving, 0,5-1 M-natrium azide, zal arresteren wormen binnen een cm straal van waar het werd geplaatst 1. Gezien dit is het zaak dat de azide zich ten minste 2 cm van de oorsprong. Als het azide wordt gespot 1,5 cm of minder van de oorsprong van de wormen zullen worden verlamd binnen de binnenste cirkel en niemand zal gescoord worden. Hoe verder het azide wordt geplaatst, het verder in dekwadranten de wormen kan bewegen. Platen moeten ook niveau worden gehouden om de consistentie in de onderzoeken te waarborgen en om ervoor te zorgen resultaten worden niet verstoord door zwaartekracht vooroordelen. Bovendien mag niet meer dan 250 wormen worden gebruikt in het experiment. Verdringing kan worm beweging belemmeren om een ​​aantal redenen. We vonden dat geclusterd wormen hebben de neiging om samen te blijven, in het voordeel van het reizen naar een kwadrant. Tenslotte plaatsen van de assay platen bij 4 ° C na 60 min houdt de wormen beweegt, waardoor de onderzoeker om de toestand van de plaat te behouden totdat het in staat te tellen. Platen bewaard bij 4 ° C en scoorde enkele dagen later zonder de resultaten.

    Enkele procedurele aanpassingen kan verder verbeteren van het nut van dit protocol. Zoals kan dit protocol dienen als een werkwijze voor het testen van een verscheidenheid van fenotypen in afzonderlijke studies. Idealiter moeten de resultaten van de mutant proeven worden vergeleken onder dezelfde omstandigheden. Met behulp van stammen die uitdrukken tlent eiwitten zoals GFP of RFP zou dit te bereiken. Deze wijziging zou de onderzoeker geven meer experimentele consistentie door het plaatsen van de verschillende stammen op dezelfde testplaat en het voordeel van scoren een plaat in plaats van het maken van test-versus controle platen.

    Chemotaxis assays kunnen ook worden gebruikt om de chemotactische gedrag van genetisch gemanipuleerde nematode wormen karakteriseren. Hierdoor kan de bindingsaffiniteit van receptoren uit andere soorten worden getest. Als deze receptoren worden uitgedrukt in de chemoattractant of chemorepulsive neuronen van de worm in een compatibele manier, moet de verwachte resultaten chemotactisch worden waargenomen 8.

    Dit protocol kan verder worden aangepast aan andere behoeften ook. Momenteel, is deze werkwijze niet mogelijk de onderzoeker de beweging van wormen te volgen. Omdat 5 cm platen zijn aanvaardbaar voor deze testen kan een video camera aan een stereomicroscoop effectief film de bewegingvan de wormen naar een kwadrant van de test zonder gebruik van een gemotoriseerde fase en worm tracking software. Tot slot, hoewel chemoattractants zijn voornamelijk bedoeld als de testverbindingen in het protocol, chemorepellents kunnen ook worden gebruikt. Dit protocol, zoals is of aangepast, is eenvoudig en efficiënt en kan dienen als een effectief instrument voor het kwantificeren van de chemotactische gedrag van C. elegans, of voor het demonstreren van het gedrag aan studenten op de middelbare school of Hbo-niveau.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Wij hebben niets te onthullen.

    Acknowledgments

    Wij danken Life Sciences en de Faculteit der Kunsten en Wetenschappen aan de Queen's University voor de financiering van dit werk. Als goed, we danken de Chin-Sang laboratorium voor het verstrekken van de noodzakelijke reagentia, apparatuur en technische ondersteuning. We danken ook QGEM 2011, vooral Tony Hij voor zijn bijdrage aan de discussie.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave
    PicoFuge Stratagene 400552
    Microscopes Leica
    Dissecting Leica
    P1000 Pipette Gilson
    P10 Pipette Gilson
    0.5 M Sodium Azide
    Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
    Ethanol/Distilled Water
    Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)
    Agar Bio-Rad 166-0600
    NH4Cl Amresco CA97062-046
    MOPS VWR CA12001-120
    NH4OH BDH CABDH8641-2
    0.25% Tween 20 Bio-Rad 170-6531

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-527 (1993).
    2. Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7, 729-742 (1991).
    3. Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. Ethanol preference in C. elegans. Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).
    4. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).
    5. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).
    6. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14, 803-812 (1995).
    7. Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
    8. Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans. Cell. 91, 161-169 (1997).
    9. Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).
    10. Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 3, e2467 (2008).
    11. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
    12. Sengupta, P., Bargmann, C. I. Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans. Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).
    13. Hart, A. C. Behavior. WormBook. (1895).
    <em>C. elegans</em> Chemotaxis Assay
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans Chemotaxis Assay. J. Vis. Exp. (74), e50069, doi:10.3791/50069 (2013).More

    Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans Chemotaxis Assay. J. Vis. Exp. (74), e50069, doi:10.3791/50069 (2013).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter