C. elegans Chemotaxis-Assay

Summary

Verfahren zur quantitativen Bewertung der chemotaktischen Reaktion von

Abstract

Viele Organismen verwenden Chemotaxis zu suchen, Nahrungsquellen, vermeiden Schadstoffe und finden mates. Caenorhabditis elegans hat eine beeindruckende Chemotaxis Verhalten.

Die Prämisse Prüfung des Ansprechens die Würmer zu einem Duftstoff ist, sie in einem Bereich zu platzieren und beobachten die Bewegung in Reaktion auf einen Geruchsstoff hervorgerufen. Auch mit den vielen verfügbaren Assays optimieren Wurm Ausgangsposition relativ zu sowohl der Steuer-und Testflächen, bei gleichzeitiger Minimierung der Interaktion von Würmern mit einander, während eine signifikante Stichprobengröße bleibt ein work in progress ^1-10. Die hier beschriebene Methode zielt darauf ab, diese Probleme durch Änderung der Assay durch Bargmann et al. ¹ entwickelt anzugehen. Eine Petrischale in vier Quadranten unterteilt ist, sind zwei gegenüberliegende Quadranten mit der Aufschrift "Test" und zwei "Control" bezeichnet. Betäubungsmittel wird in allen Test-und Kontrollgruppe Websites platziert. Die Würmer sind in der Mitte der Platte mit einem circl platzierte um den Ursprung markiert, um sicherzustellen, dass unbewegliche Würmer werden ignoriert. Mit Hilfe eines Vier-Quadranten-System anstatt einer 2 oder zwei 1 eliminiert Verzerrungen bei der Bewegung der Würmer, da sie gleich weit von Test-und Kontrollproben sind, unabhängig davon, auf welcher Seite des Ursprungs sie begann. Dies umgeht das Problem der Würmer ist gezwungen, durch ein Cluster von anderen Würmern zu reisen, um zu einem Geruchsstoff, die Würmer verzögern können oder sie zu zwingen, einen Umweg zu nehmen, was zu einer falschen Interpretation ihrer vorgesehenen Weg zu reagieren. Diese Methode zeigt auch praktische Vorteile durch einen größeren Stichprobenumfang und so der Forscher, um die Assay unbeaufsichtigt laufen und schießen die Würmer, wenn die Redezeit ist abgelaufen.

Introduction

Ward entwickelte die erste Chemotaxisassay 1973 ^5, und seitdem hat weitreichende Anwendungen. Neurobiologie ist ein Feld, das von der Verwendung einer Vielzahl von Chemotaxisassays profitiert hat. Olfaktorischen Adaption, eine einfache Form von Lernen und Gedächtnis, hat in C nachgewiesen elegans mit Chemotaxisassays ^6. Sie sind auch verwendet worden, um zu zeigen, dass C. elegans entwickeln können Ethanol-Toleranz ein Ergebnis, das zeigt nicht nur das Verhalten Plastizität der Würmer, aber das zeigt auch, dass die Würmer kann sehr nützlich sein bei der Untersuchung der Abhängigkeit von Alkohol in Menschen ^3. Assays wurden auch entwickelt, um die Fähigkeit zu demonstrieren C. elegans zu speichern kurz-und langfristigen Speicher durch die zeigen, dass Verbände von den Würmern zwischen Lockstoffe und Nahrungsmittel (OP50) ⁷ gemacht werden. Darüber hinaus die umfangreichen derzeit verfügbaren Informationen über die C gegeben elegans Genoms, die chemotaxis Verhalten von C. elegans wurde mehrfach durch Mutationen induzieren ^1,8 verändert. Dies ermöglicht viele spannende Möglichkeiten Engineering, wie die Entwicklung von C. elegans als bioremediation Tool. So, da die anfängliche Entwicklung des Chemotaxis-Assay im Jahr 1973 hat es sich häufig verändert und verwendet, um Geheimnisse in einer Vielzahl von Disziplinen aufzuklären.

Bestimmte Tests zum Ziel, die spezifische Route von den Würmern zu einem Ziel gemacht zu entdecken. Die prototypische Assay dieser Art wurde von Ward ⁵ entwickelt. Drei Würmer wurden am geschmolzene Agar für 15 min platziert. Ihre Bewegungen wurden durch den Aufdruck sie bleiben, wie sie von der Peripherie der Platte bis zu einer Steigung ein Lockmittel in der Mitte der Platte reiste zurückverfolgt. Alle Würmer auf der Platte wurden verhaftet mit Chloroform am Ende jeder Studie. Ein Nachkomme dieser Methode platziert einen einzigen Wurm in der Mitte der Platte mit dem Lockstoff und der Kontrolle einert gleich und entgegengesetzt Abstände vom Ursprung ^2.

Pierce-Shimomura et al. entwickelte einen Test, um die genaue Art der Bewegung in Chemotaxis ⁹ beteiligt beobachten. Einzelne Würmer wurden in 9 cm Petrischalen entweder mit einer einheitlichen Konzentration der Lockstoff oder einer radialen geformten Verlauf angeordnet ist, die ihren Höhepunkt in der Quelle der Lockstoff. Ein Computer-Software-Programm, das die Schnecke erkannt wurde verwendet, um das beobachtete Verhalten aufzuzeichnen. Ein Video-Kamera, die an einem Mikroskop gearbeitet in Verbindung mit der Stufe, um die Petrischale automatisch als der Test lief, um sicherzustellen, die Schnecke blieb im Blickfeld. Daraus wurde mehr detaillierte Informationen über die Ursache entdeckt Pirouetten von C. angezeigt elegans.

Andere Tests, ähnlich wie die hier beschriebenen, testeten die Reaktion von einer großen Population von Würmern zu testen Verbindungen. Zwei-Quadranten-Chemotaxis-Assays wurdenverwendet werden, um die Rollen zu erforschen, die verschiedenen Neuronen, Rezeptoren und Signaltransduktionsmoleküle wenn C gespielt elegans wurde verschiedenen Verbindungen ¹ ausgesetzt. 20-50 gewaschenen Würmer in der Nähe der Mitte der Platte mit einem Lockstoff und eine Steuereinheit an polaren Enden zusammen mit dem Anästhetikum, Natriumazid (NaN ₃₎ angeordnet ist. Nach 60 min wurde eine chemotaktischen Index mit Werten von -1,0 bis +1,0 der Grundlage der Differenz zwischen dem, wie viele Würmer wurden dem Lockstoff oder der Steuerung befestigt erzeugt. Eine ähnliche chemotaktischen Index wurde in dem Assay in diesem Artikel berichtet verwendet, obwohl die zuvor Assay nicht streng bewerten unbewegliche Würmer. Dieser Assay wurde dann weiter auf das Testen der Wirkungen von neuronalen Ablation auf die Chemotaxis aufgebracht.

Eine weitere Variante des vorstehend genannten Assay wurde durchgeführt, wobei 100-200 Würmer in der Mitte einer Platte mit vier Quadranten ³ angeordnet wurden. Benachbarten Quadranten enthalten entweder den Test oderKontrollsubstanz. Wie in früheren Untersuchungen wurden die Würmer durch Einwirkung von Natriumazid bevor erzielt immobilisiert. Ein ähnliches Verfahren wird hier als eine Möglichkeit der Auswertung der Reaktion von C beschrieben elegans, um verschiedene Verbindungen. Jedoch hat das Verfahren unter den zusätzlichen Vorteil, nur die Bewertung Würmer, die einen Schwellenwert trennende Abstand von unbeweglichen Würmer mobilen bestanden haben.

Andere Tests haben ähnliche Richtlinien zu ignorieren immobile Würmer eingearbeitet. Frøkjær-Jensen et al. entwickelten ein vielseitiges Assay, der zum Testen sowohl flüchtige als auch wasserlösliche Verbindungen ¹⁰ werden kann. Eine Petrischale wurde in vier Quadranten unterteilt. Die oberen und unteren Quadranten nicht enthalten Lösungsmittel. Die linken Quadranten enthalten Wasser und die rechte enthielt das Lockmittel. Beim Testen flüchtige Riechstoffe wurde der Analyt auf dem Deckel der Schale angeordnet ist, über den entsprechenden Quadranten, während wasserlösliche Verbindungen wurden direkt am aga platziertr.

Die Verfahren, die derzeit existieren für die Bewertung der chemotaktischen Reaktion von C. elegans werden ständig verfeinert, um ihre Benutzerfreundlichkeit, Effizienz und Genauigkeit zu optimieren. Also, während der Test hier beschrieben hat die Fähigkeit zur Beurteilung der größten Anzahl von Würmern (maximaler Durchsatz:. 250 Würmer / Stunde pro Platte, etwas größer als der Durchsatz von Lee et al ³ gezeigt), die wahre Stärke dieser Methode ist die prägnanten Höhepunkt von vielen der Attribute der früheren Assays (Tabelle 1).

Protocol

1. Vorbereiten / Waschen der Worms

1. Synchronisieren Würmer jungen Erwachsenen ^11.
2. Pipette 2 ml der S Basal auf eine 5 cm Chemotaxis Platte inszenierter Würmer, die nur den Rasen von OP50 E. gelöscht haben coli. Kippen Sie die Platte wie notwendig, um sicherzustellen, dass die Würmer aus der Plattenoberfläche in den Puffer gewaschen werden.
3. Je 1 ml der Wurm-S Basal Lösung in ein Reaktionsgefäß.
4. Zentrifuge für 10 sec mit einer PicoFuge bei 6.600 Umdrehungen pro Minute.
5. Saugen Sie die S Basal, so dass die Pellets von Würmern ungestört.
6. 1 ml S Basal Lösung des Mikrozentrifugenröhrchens, kehren ein paar Mal, um die Würmer zu waschen.
7. Wiederholen Sie die Schritte 1,4 bis 1,6 noch dreimal.
8. Zentrifuge für 10 sec ein fünftes Mal, diesmal Absaugen der Überstand auf ein Gesamtvolumen von ca. 100 ul.
9. Pipette 2 ul der Würmer auf eine NGM Platte, um sicherzustellen, gibt es zwischen 50 und 250 Würmer in jedem 2 ul Probe. Einstellendie Konzentration von Würmern in der S Basal durch Resuspendieren die Würmer in einem kleineren oder größeren Volumens von S Basal benötigt.
10. Verwenden Sie die Würmer in dem Test sofort nach dem Waschen die Würmer für bis zu 1 Stunde.

2. Vorbereitung der Test-Platten

1. Kennzeichnung der Unterseite eines 5 cm Platte, teilen Sie die Schale in 4 gleich große Quadranten. Chemotaxis NGM-Agar oder verwendet werden. Ein Minimum von 3 Versuche pro genetische Belastung getestet erforderlich.
2. Markieren Sie einen Kreis mit einem Radius von 0,5 cm um den Ursprung (Abbildung 1).
3. Markieren Sie einen Punkt in jedem Quadranten entweder mit einem "T" für "Test" oder "C" für "Control", um sicherzustellen, dass die Seiten gleich weit vom Ursprung und zueinander stehen. Die Punkte müssen mindestens 2 cm vom Ursprungs sein. Markieren Sie die oben links und unten rechts Quadranten als Test-Quadranten und dem oberen rechten und unteren linken Quadranten als Kontrollen (Abbildung 1).

3. Ausführen des Assay

Mischen Sie die Testlösung durch die Kombination von gleichen Volumina der Testverbindung und 0,5 M Azid (ein Anästhetikum verwendet werden, um die Würmer bei Erreichen eines Quadranten verhaften). Mischen der Kontrolllösung durch Kombinieren des verwendeten Lösungsmittels, um die Testverbindung mit 0,5 M Azid verdünnen.

Pipette 2 ul der Wurm-Lösung (hergestellt in 1.8) aus dem Pellet auf die Herkunft (wo sich die beiden Linien schneiden).

Unmittelbar nach, Pipette 2 ul der Testlösung auf die beiden "T"-Websites. Ebenso pipettieren die gleiche Menge der Kontroll-Lösung auf die beiden "C"-Sites.

Sobald die Schnecke und Geruchsstoff Tropfen in den Agar absorbiert wurden, ersetzen Sie den Deckel und drehen Sie die Platten.

Nach 60 min, legen die Würmer in einem 4 ° C Inkubator. Nur nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator, wenn sie gezählt werden können. Weggehen Würmer bei Raumtemperatur kann es ihnen ermöglichen, wieder zu mobilisieren.

Notieren Sie sich die Anzahl der Würmer in jedem Quadranten, die vollständig überquert die innere circle.

Wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.6 mit der Kontroll-Lösung sowohl in der Test-und Kontrollgruppe Quadranten. Dies wird als der Steuerscheibe dienen. Drei solcher Platten werden sollten, und laufen als entsprechende Steuerung dienen.

4. Die Interpretation der Ergebnisse / Bestimmung der Chemotaxis Index

1. Berechnen Sie die Chemotaxis Index mit Gleichung 1. Dies ergibt eine chemotaktische Index zwischen -1.0 und +1.0.

(1)

Chemotaxis Index = (# Worms in beiden Versuchsreihen Quadranten - # Worms bei den Kontroll-Quadranten) / (Gesamtanzahl erzielter Worms)

A +1.0 Punkte zeigt maximale Anziehungskraft in Richtung des Ziels und stellt 100% der Würmer Ankunft in den Quadranten mit der chemischen Ziel. Ein Index von -1.0 ist ein Beweis für maximale Abstoßung. Ähnliche Testverfahren wurden bereits ³ (Tabelle 1) eingesetzt.

2. Melden Sie den Mittelwert Chemotaxis Index (CI) und Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Mache eine Student-T-Test Vergleich der Daten aus den Versuchs-und Kontrollgruppen Platten.

Representative Results

Vergleich Wildtyp (N2) C. elegans zur odr-10 (KY10)-Mutante.

Wir verwendeten Diacetyl, eine bekannte C. elegans Lockstoff, um Wildtyp-Würmern der einer Mutante, die den Rezeptor für Diacetyl ^1,12 fehlt vergleichen. Für Wildtyp (N2) Würmer die chemotaktische Index war 0,100 ± 0,066 zu Ethanol und 0,839 ± 0,031 bis 0,5% Diacetyl. Wie erwartet, löst Diacetyl einen signifikanten chemoattractive Antwort von Wildtyp-Würmer (P <0,003). Dagegen sind die ODR-10 (KY10) Mutanten, welche die Rezeptoren fehlt Diacetyl hatte eine Diacetyl CI, das war nicht signifikant verschieden von den Kontrollen (Abbildung 3).

Verfasser	# Würmer / Platte	Dauer (min)	1 h Durchsatz (max # Würmer)	Pros	Cons
Ward 5	3	15	12	• Spur Bewegung • Konto für immobile Würmer durch klare Beobachtung	abhängig Forscher Beteiligung @ kurzen Zeitabständen (15 min)
Bargmann & Horvitz 2	1	60	1		• geringe Durchsatz • Lockstoff diffundiert für 12-24 h
Bargmann, Hartwieg, Horvitz 1	20-50	60	50	• minimale Forscher Beteiligung (NaN 3 verwendet) • moderate # Würmer	• keine diskrete immobile Scoring-Methode • nicht verfolgen Bewegung
Lee, Jee, McIntire 3	100-200	60	200	• minimale Forscher Beteiligung (NaN 3 verwendet) • hohe #Würmer
Pierce-Shimomura, Morse, Lockery 9	1	20 (oder bis Wurm Treffern Kante der Platte)	3	• Spur Bewegung • Konto für immobile Würmer durch klare Beobachtung • detaillierte, permanente Aufzeichnung der Wurm Bewegung	erfordert fortgeschrittenen Computer-Tracking-System
Margie, Palmer, Chin-Sang (diese Methode)	50-250	60	250	• minimale Forscher Beteiligung (NaN 3 verwendet) • hohe # Würmer • Konten für immobile Würmer	• nicht verfolgen Bewegung

Tabelle 1. Vergleich der beschriebenen Testverfahren.

Abbildung 1. Die 5 cm Petrischale wird in vier Quadranten, die jeweils entweder als Test ("T") oder Control ("C") bezeichneten Bereich unterteilt. Der innere Kreis umreißt eine Fläche, wo die Bewegung nicht fällt. Dadurch wird verhindert, immobile Würmer aus Schiefstellung der Daten. Die Quadranten erstellen ein abwechselndes Muster von Test-und Kontrollgruppe, jede Voreingenommenheit, die von der erstmaligen Platzierung der Würmer auftreten können zu vermeiden.

Abbildung 2. Eine schematische Darstellung des Assays von Lee et al. (2009) angepasst. Die Platten werden in Quadranten zwei Test (A & B) und zwei Steuerelemente (C & D) unterteilt. Natriumazid wird auch mit den Test-und Kontroll-Spots, um Würmer zu lähmen enthalten. Worms sind in der Mitte der Platte gegeben und nach 60 Minuten Würmer sind auf jeder quadra gezähltnt. Personen, die nicht überqueren wollte den inneren Kreis werden nicht gewertet. Schematische Beispiele für neutrale und Lockstoff angegeben. Die Chemotactic Index (CI)-Berechnung ist unten dargestellt.

Abbildung 3. Chemotactic Indizes von Assays mit Wildtyp-(wt) und odr-10 (KY10) Würmer entweder mit Diacetyl als Test Lockstoff oder Ethanol (Kontrolle Platten) durchgeführt generiert. Werte sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Experimenten (n> 200 Würmer) für jede Bedingung. Fehlerbalken geben die Standardfehler des Mittelwerts (SEM) * = P <0,003 Student-t-Test.

Discussion

Chemotaxis, obwohl durch eine komplexe Reihe von neuronalen und zellulären Mechanismen gesteuert werden, können leicht und objektiv quantifiziert mit Chemotaxisassays sein. Um die besten Ergebnisse aus den Tests zu erhalten, müssen bestimmte kritische Schritte unternommen werden. Erstens, die Inszenierung der Würmer ist wichtig, was in Einklang experimentellen Ergebnisse. Worms in verschiedenen Lebensphasen unterschiedlich verhalten ^13; so gemischten Bühne Würmer können Skew experimentellen Ergebnisse. Zweitens, um jede E. coli wird die Würmer gewaschen ist entscheidend, da Restbakterien den Assay stören kann. Es ist auch wichtig anzumerken, dass das Anästhetikum, 0,5-1 M-Natriumazid wird Würmer in einem 1 cm Radius, wo er eingesetzt verhaften. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass das Azid mindestens 2 cm von dem Ursprung angeordnet werden. Wenn das Azid 1,5 cm oder weniger von der Herkunft gesichtet wird die Würmer innerhalb des inneren Kreises gelähmt sein und keine werden erzielt. Je weiter die Azid gelegt, das weiter in dieQuadranten die Würmer bewegen kann. Teller sollte auch gehalten werden, um die Konsistenz zu gewährleisten und Studien, um sicherzustellen, Ergebnisse nicht durch die Schwerkraft spannt verwechselt. Darüber hinaus sollte nicht mehr als 250 Würmer in dem Experiment verwendet werden. Verdrängung kann Schnecke Bewegung für eine Reihe von Gründen, zu behindern. Wir fanden, dass Cluster Würmer zusammen bleiben, zu Gunsten des Reisens zu einem Quadranten neigen. Schließlich Anordnen der Testplatten bei 4 ° C nach 60 min hält die Würmer bewegt, so dass die Forscher, um den Zustand der Platte zu erhalten, bis sie in der Lage, gezählt wird. Die Platten können bei 4 ° C gelagert und hat ein paar Tage später, ohne die Ergebnisse.

Ein paar formale Änderungen können weitere Verbesserung der Nützlichkeit dieses Protokoll. Wie kann dieses Protokoll als ein Verfahren zum Testen einer Vielzahl von Phänotypen in getrennten Studien dienen. Idealerweise sollten die Ergebnisse der Mutante Versuchen unter den gleichen Bedingungen verglichen werden. Mit Stämmen dass express fluoreszent Proteine ​​wie GFP oder RFP würde dies zu erreichen. Diese Änderung würde der Forscher größere experimentelle Konsistenz, indem Sie die verschiedenen Stämme auf dem gleichen Assay-Platte und den Nutzen von Scoring eine Platte anstelle von Scoring-Test im Vergleich zur Kontrollgruppe Platten.

Chemotaxis-Assays können ebenfalls verwendet werden, um die chemotaktische Verhalten gentechnisch Fadenwürmer charakterisieren. Dies ermöglicht die Bindungsaffinität von Rezeptoren aus anderen Arten getroffen werden, um zu prüfen. Wenn diese Rezeptoren in den Lockstoff oder chemorepulsive Neuronen der Schnecke in einem kompatiblen Weise ausgedrückt werden, ist zu erwarten, chemotaktische Ergebnisse ⁸ beobachtet werden.

Dieses Protokoll kann weiter angepasst werden, um andere Bedürfnisse als auch anpassen. Derzeit funktioniert diese Methode nicht zulassen, dass der Prüfer, um die Bewegung der Würmer zu verfolgen. Da 5 cm Platten akzeptabel für diese Assays sind, kann ein Video-Kamera, die an einem Stereomikroskop wirksam filmen die Bewegungder Würmer gegenüber einem Quadranten des Assays ohne die Verwendung eines motorisierten Tisch und Schnecke Tracking-Software. Schließlich, obwohl Lockstoffe in erster Linie zu den Test-Verbindungen in dem Protokoll bezeichnet werden kann chemorepellents ebenfalls verwendet werden. Dieses Protokoll, wie es ist oder modifiziert, ist einfach und effizient und kann als ein wirksames Instrument zur Quantifizierung der chemotaktische Verhalten von C. dienen elegans, oder für den Nachweis des Verhaltens zu Studenten an der High-School-oder Bachelor-Ebene.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave
PicoFuge	Stratagene	400552
Microscopes	Leica
Dissecting	Leica
P1000 Pipette	Gilson
P10 Pipette	Gilson
0.5 M Sodium Azide
Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Ethanol/Distilled Water
Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)
Agar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0.25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531