Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

السريرية تطبيق Published: February 1, 2013 doi: 10.3791/50070
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1
1Division of Pediatrics, U.T. MD Anderson Cancer Center, 2Department of Stem Cell Transplantation and Cellular Therapy, U.T. MD Anderson Cancer Center

Summary

وغرست الخلايا T تعبر عن CD19 محددة مستضد خيالية مستقبلات (CAR)، والعلاج الفحص من الأورام الخبيثة الخلايا B-من خلال موقعنا الأول في التجارب البشرية العلاج الجيني. وصفنا التعديل الوراثي للخلايا T باستخدام

Abstract

يمكن تحسين فعالية الخلايا T-السريرية الصف من خلال الجمع بين العلاج الجيني مع العلاج المناعي لهندسة منتج بيولوجي مع إمكانية الاعتراف (ط) متفوقة من الورم المستضدات المرتبطة (TAAs)، (الثاني) بعد استمرار التسريب، (الثالث) إمكانية الهجرة إلى مواقع الأورام، و (رابعا) القدرة على إعادة تدوير وظائف المستجيب داخل الورم المكروية. وقد استخدمت معظم النهج للتلاعب الجيني للخلايا T هندسيا للتطبيق الارتجاعي الإنسان والفيروسة البطيئة للتعبير مستقرة. 1-3 CAR. هذا النهج، على الرغم متوافقة مع ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (GMP)، ويمكن أن تكون مكلفة لأنها تعتمد على تصنيع وإطلاق السريرية الصف فيروس المؤتلف من عدد محدود من مرافق الإنتاج. نقل الكهربائية من البلازميدات nonviral هو بديل جذاب لتنبيغ منذ الأنواع يمكن أن تنتج DNA إلى الصف السريرية في حوالي 1/10 ال تكلفة recombinالنمل GMP الصف الفيروس. لتحسين كفاءة التكامل أننا تكييفها الجميلة النائمة (SB) ينقول وtransposase لتطبيق 4-8 الإنسان. نظامنا يستخدم SB البلازميدات DNA اللذين تتكون من ينقول الترميز لجين ذات الاهتمام (مثل الجيل الثانية 2 CD19 محددة التحوير CAR، CD19RCD28 المعينة) وtransposase (مثل SB11) الذي يدرج في التحوير ثنائي النوكليوتيد TA يكرر 9-11 . لإنشاء أرقام سريريا ذاتيا من الخلايا T المعدلة وراثيا التي نستخدمها K562 المستمدة من الخلايا مستضد تقديم الاصطناعي (AAPC) (استنساخ # 4) تعديل للتعبير عن TAA (مثل CD19) وكذلك جزيئات الخلية costimulatory T CD86، CD137L، وهو غشاء محدد إصدار انترلوكين (IL) -15 (الببتيد تنصهر المنطقة لتعديل التيسير IgG4) وCD64 (FC-γ مستقبلات 1) لتحميل الاجسام المضادة (ماب) 12. في هذا التقرير، إلا أننا شرح الإجراءات التي يمكن القيام بها في compliaNCE مع المركب لتوليد CD19 محددة CAR + T الخلايا البشرية المناسبة للتطبيق. وقد تحقق ذلك من قبل متزامن الكهربائية نقل البلازميدات DNA اثنين، ينقول SB (CD19RCD28) وtransposase SB (SB11)، يليه استرجاع integrants مستقرة من قبل كل الإضافات-7-اليوم (دورة التحفيز) من γ-المشع AAPC (استنساخ # 4) في حضور IL-2 للذوبان الإنسان المؤتلف و 13 IL-21. وتجري عادة 4 دورات (28 يوما للثقافة مستمر) لإنشاء أرقام سريريا-T جاذبية من الخلايا التي تعبر عن ثابت جمهورية أفريقيا الوسطى. ويمكن تطبيق هذه المنهجية لتصنيع الخلايا السريرية الصف T-CD19 محددة لخلايا T المستمدة من الدم المحيطي (PB) أو دم الحبل السري (UCB). وعلاوة على ذلك، يمكن تسخير هذا النهج لتوليد خلايا T لأنواع الأورام المختلفة من إقران خصوصية CAR المقدمة مع التعبير عن TAA، معترف بها من قبل CAR، على AAPC.

Protocol

أو قبل يوم 0

1. عزل خلايا وحيدات النوى (MNC) من PB وUCB

  1. تمييع PB مع حجم مساو، وUCB مع أربعة مجلدات من PBS-EDTA.
  2. الدم ببطء طبقة المخفف (25 مل) على Ficoll (12 مل) في أنبوب الطرد المركزي 50 مل (ق) وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 - 40 دقيقة (بدون فرامل).
  3. جمع ونقل جزء الخلية وحيدات النوى (واجهة) باستخدام ماصة نقل إلى أنبوب جديد 50 مل الطرد المركزي.
  4. طرح وحدة التخزين إلى 50 مل PBS-EDTA مع وأجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة.
  5. نضح طاف، بلطف إعادة تعليق بيليه الخلية (الخلايا) في 50 مل من وسائل الإعلام الثقافة كاملة (CCM)، وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
  6. بلطف واعادة تعليق الكريات تجمع الخلايا في CCM وتنفيذ عدد خلايا باستخدام أسلوب الاستبعاد التريبان الأزرق (برنامج Cellometer PBMC،).
  7. ويمكن الآن أن تستخدم لMNC الصعق الكهربائي (Nucleofection) أو cryopreserved لاستخدامها في المستقبل.
عنوان "2>. خلايا T إعداد لالصعق الكهربائي على يوم 0

  1. إذا باستخدام MNC cryopreserved، ذوبان الجليد بسرعة كافية لخلايا الصعق الكهربائي على نطاق كامل (2 × 10 8 مضيفا ~ 20٪ لتصل إلى فقدان الخلايا خلال الطرد المركزي و 2 حضانة ساعة) في 37 ° C حمام مائي. إذا كنت تستخدم طازجة معزولة MNC انتقل إلى الخطوة 2.3.
  2. بلطف اعادة تعليق ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي بحجم مناسب (ق) الواردة قبل تحسنت كاملة RPMI ثقافة خالية من الفينول وسائل الإعلام (PF-RPMI) وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة (لا فرامل)، الرشفة طاف.
  3. إعادة تعليق MNC في PF-RPMI، تنفيذ عدد خلايا (Cellometer) ونقل الخلايا إلى خلايا سفينة الثقافة بحجم مناسب (ق) عند تركيز من الخلايا 6 10 / مل.
  4. احتضان في 37 مرطب ° C / 5٪ CO 2 حاضنة لمدة 2 ساعة 30 دقيقة ±.
  5. نقل إلى أنبوب الطرد المركزي MNC العقيمة (ق)، وتدور في 200 XG لمدة 5 دقائق (بلا فرامل)، نضح طاف ص وبلطفتعليق البريد والجمع بين بيليه الخلية (الخلايا) في PF-RPMI.
  6. تنفيذ عدد خلايا (Cellometer) وحساب حجم الخلية المطلوبة التعليق (2 × 10 8 MNC).
  7. نقل حجم المحسوبة إلى 50 مل العقيمة أنبوب الطرد المركزي وتدور في 200 XG لمدة 10 دقيقة (لا فرامل).
  8. نضح طاف بحيث لا يبقى سائل الإعلام المتبقية وبلطف من خلال استغلال جانب من أنبوب إعادة تعليق.

3. الصعق الكهربائي (Nucleofection) من MNC (كامل عملية مقياس باستخدام 10 Cuvettes) على يوم 0

  1. قبل احتضان معقمة جيدا 12-وحة مع 10 آبار تحتوي على 4 مل من RPMI-PF دافئة في 37 مرطب ° C / 5٪ CO 2 الحاضنة.
  2. وقبل إعداد الحارة الحل Nucleofector Lonza الإنسان T عدة خلايا (في تشكيل تعليمات الشركة الصانعة، www.lonza.com ) لدرجة الحرارة المحيطة في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية (BSC).
  3. إعداد الحل Nucleofector / DNA مزيج من الدين سيد100 غ ميكرولتر من حل Nucleofector تستكمل، 15 ميكروغرام من ينقول (DNA البلازميد supercoiled تسمى CD19RCD28/pSBSO) و 5 ميكروغرام من transposase (DNA البلازميد supercoiled تسمى pCMV-SB11) في رد فعل / كوفيت.
  4. تفريق بيليه الخلية (من الخطوة 2.8) من خلال استغلال بلطف إلى جانب أنبوب الطرد المركزي والرئيسي في مزيج Nucleofection حل / DNA (النهائي تركيز الخلية: 2 × 10 7 cells/100 ميكرولتر) إعادة تعليق.
  5. نقل 100 ميكرولتر بعناية لتعليق الخلية (من الخطوة 3.4) لكل من عشرة (10) cuvettes Nucleofection Lonza، والحرص على تجنب الفقاعات.
  6. اضغط على كوفيت مرة واحدة، وelectroporate باستخدام برنامج U-014 (للخلايا T unstimulated).
  7. ونقل cuvettes لوحة 12-جيدا (الخطوة 3.1) إلى BSC.
  8. حصاد الخلايا electroporated من كل كوفيت باستخدام نقل معلومات سرية غرامة Amaxa ماصة، وذلك بإضافة ~ 500 ميكرولتر من ثقافة المتوسط ​​قبل تحسنت من المقابلة بشكل جيد (12-أعدت بشكل جيد في سانت لوحةف 3.1) والعودة إلى لوحة بحجم 37 مرطب ° C / 5٪ CO 2 حاضنة لمدة 2 ساعة 30 دقيقة ±.
  9. بعد ساعة 2-الحضانة، والحصاد ونقل الخلايا من جميع الآبار إلى أنبوب الطرد المركزي العقيمة.
  10. غسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 140 x ج لمدة 8 دقائق، ودرجة الحرارة المحيطة، والفرامل لا نضح وتجاهل طاف بحيث لا يغطي المتوسطة المتبقية بيليه الخلية.
  11. تفريق بيليه الخلية بالنقر برفق على جانب أنبوب الطرد المركزي وبلطف في CCM إعادة تعليق لتحقيق تعليق خلية واحدة.
  12. أداء عدد خلايا وضبط تركيز الخلية إلى الخلايا 6 10 / مل في CCM.
  13. نقل التعليق الخلية إلى خلية قارورة الثقافة (ق) ووضعت في الحاضنة بين عشية وضحاها.
  14. الخطوات العملية تكررت 2،1 حتي 3،8 من أجل السيطرة: EGFP-بالنقل الخلايا (5 × 10 6 خلية / كوفيت مع 5 ميكروغرام Amaxa تحكم EGFP supercoiled البلازميد، pmaxGFP).

يوم 1 من 1 ش واللاحقةالتحفيز دورات

4. تحليل التعبير CAR بواسطة قياس التدفق الخلوي في اليوم 1

  1. حصاد الخلايا electroporated وإجراء تعداد الخلايا باستخدام أسلوب الاستبعاد التريبان الأزرق (عدادة الكريات).
  2. وصمة عار خلايا (1 إلى 2 × 10 6) مع الأجسام المضادة المحددة لCD4، CD3، CD8، ومفتش Fcγ الإنسان (كما قياس التعبير CAR).
  3. الحصول على الخلايا Calibur FACS وتحليل البيانات باستخدام برنامج FCS سريع لحساب تعبير عن CAR.
    1. حساب الخلايا في الثقافة + CAR بواسطة الصيغة:
      (عدد خلايا قابلة للحياة المجموع) × (CAR٪ + الخلايا) = عدد الخلايا + CAR

5. إعداد AAPC (استنساخ # 4) في يوم 1. وقد استمدت AAPC (استنساخ # 4) من خلايا K562 (الخط الأبوية تم الحصول عليها من أمريكا نوع كوكتيل الثقافة) للمشاركة في التعبير عن جزيء T المرجوة المشارك تنشيطية الخليوي

  1. ذوبان الجليد في قسامة من المجمدة AAPC جراى 100 المشع في 37 °؛ C ماء الحمام.
  2. تغسل مرتين الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج، 10 دقيقة في CCM وتحسب باستخدام Cellometer (التريبان الأزرق الاستبعاد).
  3. حساب عدد AAPC قابلة للحياة اللازمة لتحفيز:
    (عدد الخلايا + CAR) × 2 = عدد AAPC المشع المطلوب

6. AAPC بوساطة حفز خلايا T + CAR في يوم 1 بداية من 1 ش ودورات تحفيز اللاحقة

  1. خلط الخلايا electroporated (التعبير عن CAR) وγ-المشع AAPC (استنساخ # 4) في وعاء معقم في نسبة 1:2 (CAR + الخلية: AAPC قابلة للحياة) في CCM.
    1. ملاحظة يتم ضبط نسبة AAPC للتعبير عن سيارة على أساس التدفق الخلوي في اليوم التالي الصعق الكهربائي.
  2. إضافة IL-21 (30 نانوغرام / مل) إلى تعليق خلية.
  3. قسامة في T-75 سم 2 قارورة (ق) و / أو أكياس فيو ثقافة الحياة عند تركيز من الخلايا 6 10 / مل والعودة إلى incubatأو.

3 أيام، 5

7. استمرار ثقافة CAR + T خلايا

  1. إجراء تغيير نصف وسائل الإعلام، تجديد IL-21، والحفاظ على خلايا T في تركيز الخلايا 6 10 / مل.

يوم 7

8. نهاية أول دورة تحفيز AAPC بوساطة

  1. خلايا الحصاد، عد وصمة عار لCD4، CD3، CD8، وFcγ (CAR)، وانتقل إلى الخطوة 10.1.

9. نضوب خلايا CD56 + (عادة ما بين 7 و 14 أيام بعد الصعق الكهربائي)

  1. إجراء استنزاف CD56 باستخدام الخرز ممغطس إذا CD56 + CD3 الخلايا الليمفاوية NEG ≥ 10٪.

دورات التحفيز # 2، # 3، # 4 و 8 أيام الموافق → 14، لمدة 15 يوما → 21، أيام 22 و 28 →

10. عودي إضافة AAPC لنشر خلايا T إلى أرقام سريريا ذاتيا

  1. تكرار stimulatioن عملية (4 مرات) كما هو موضح في الخطوات 4،3-8،1.
  2. إضافة IL-2 (50U/ml) إلى الثقافات التي تبدأ في أيام 7 و 14 و 21، وبعد ذلك عند كل تغيير وسائل الإعلام (ثلاث مرات في الأسبوع، وفقا لجدول من الاثنين إلى الأربعاء إلى الجمعة).
  3. Cryopreserve (الأرشيف) خلايا T الزائد حسب الحاجة.
    1. خلايا T تجميد الفريزر باستخدام معدل للرقابة.

اليوم 28

11. نهاية آخر دورة تحفيز AAPC بوساطة: خلايا T الحصاد

  1. Cryopreserve الخلايا T للاختبار وإصدار التسريب.

Representative Results

نفيد يمكن استخدامها الكهربائية نقل البلازميدات الحمض النووي وانتشار الخلايا T-γ على المشع AAPC لتوليد أرقام سريريا-T جاذبية من الخلايا المشتقة من PB وUCB للتطبيقات الإنسان. هذه الخلايا المعدلة وراثيا T إبداء CAR عرض تعترف TAA CD19، مستقلة عن مجمع التوافق النسيجي الرئيسي. والبلازميدات DNA SB-المشتقة للتعبير عن ينقول (ط)، سيارة الجيل 2 الثانية (CD19RCD28) أن إشارات من خلال CD28-ε CD3 و14، و (الثاني) تم transposase، SB11 15، التي سبق وصفها 13، 16،17 . تم إنتاج البلازميدات المستخدمة في الدراسة الحالية تجاريا من قبل مرفق ايزمان Biomanufacturing السريرية (ماديسون، WI). وAAPC (استنساخ # 4)، والمستمدة من الخلايا K562 (خط الوالدين الحصول عليها من أمريكا نوع كوكتيل الثقافة)، وشارك في التعبير عن خلية T المرجوة جزيئات شارك في تنشيطية (كل جزيء في عرض 3 90٪ على سطح الخلية من AAPC)،كما هو موضح سابقا 12. هنا نعرض التي يمكن أن تتولد خلايا CD19 محددة من الخلايا T وحيدات النوى (MNC) المستمدة من PB أو باستخدام UCB SB تبديل لتقديم CAR تليها إضافة AAPC لتوسيع الخلايا T عدديا بطريقة CAR التي تعتمد على (الشكلان 1 ، 4) 13،18. وelectroporated عشرة cuvettes (2X10 7 MNC / كوفيت) لكل مستلم باستخدام 15 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد (CD19RCD28/pSBSO) الترميز لينقول (CAR) و 5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد (pCMV-SB11) الترميز لtransposase (SB11). ويمكن تخفيض عدد cuvettes إذا MNC تحد أو تقليص للعمل المختبر. ويعرف اليوم من الصعق الكهربائي و"0 يوم" دورة تحفيز # 1. كما ضوابط لظروف التدفق الخلوي والثقافة، وخلايا T هي ذاتي electroporated وهمية (DNA البلازميد دون) وتوسعت عدديا على γ-المشع AAPC (استنساخ # 4) أنه تم محملة مسبقا مع OKT3 إلى الارتباط عبور CD3 للحفاظ على الخلية T الانتشار. نحن صتقييم كفاءة outinely electrotransfer وبقاء خلايا T في اليوم التالي الصعق الكهربائي (الشكل 2B). التعبير عن EGFP من DNA البلازميد التحكم (المعين pmaxGFP) وCAR في هذه المرحلة الأولية الوقت يعكس التعبير عن البروتين المتكامل والبلازميد episomal. عادة، بعد يوم من الصعق الكهربائي و نقيس EGFP التعبير في التعبير ~ 60٪ وبنسبة 40٪ في CAR ~ (الشكل 2A) مع بقاء الخلية T بين 40-50٪. إضافات متكررة من γ-المشع AAPC في حضور IL-2 للذوبان الإنسان المؤتلف وIL 21-T استرداد الخلايا معربا عن ثابت CAR (CD19RCD28). ونضبت CD3 + CD56 NEG خلايا NK من ثقافة استخدام الخرز ممغطس CD56 محددة إذا كانت نسبة هذه الخلايا NK هو ≥ 10٪ وخاصة إذا كانت نسبة CAR أعرب عن خلايا T منخفضة. هذا النزف يمنع فرط السريع لخلايا NK التي يتداخل مع قدرة AAPC للحفاظ على proliferatioن من الخلايا T + CAR. في بعض الأحيان، يجري استنزاف خلايا NK من خلايا T + CAR خلال دورات التحفيز مشاركة اثنين، ولكن هذا يدخل فقدان الخلايا المطلوب بسبب التعبير المشارك للCD56 على بعض الخلايا T + CAR. كانت تزرع الخلايا T في نظام مغلق وظيفيا استعمال الأكياس فيو ثقافة الحياة اليوم 14 الماضية. وعادة cryopreserved مجموعة فرعية من الخلايا T والمعدلة وراثيا ونشر في يوم 14 أو يوم 21 (نهاية دورات تحفيز # # 2 أو 3) الثقافة المشتركة على AAPC لتكون بمثابة مصدر للمواد المحفوظة لتحاليل المستقبل وتكون ل إذابة إذا تحدث مشاكل غير متوقعة في وقت لاحق أثناء عملية التصنيع. ويتم حصاد الخلايا T عادة في أو حول يوم 28 من ثقافة (الشكل 3) التي تعبر عن روتيني> CAR 90٪ وهي> 80٪ قابلة للحياة (الشكل 2C، D). لقد أظهرنا سابقا أنه بعد أربعة أسابيع من الثقافة المشتركة على AAPC المتوسط ​​أضعاف توسيع CD3 + T الخلايا هو 19800 11313 ± مع CA R + التعبير كونها 90٪ ± 7.5 13. وهذه الخلايا T cryopreserved والخضوع في عملية الافراج والاختبار التي تبلغ عن سلامة والعلاجية المحتملة للمنتج المصنعة. ويجري اختبار إطلاق امتثالا السريرية التعديلات تحسين المختبرات (CLIA) لإنشاء شهادة التحليل قبل التسريب في المتلقين على التجارب السريرية.

الشكل 1
الشكل 1. إبراز الخطوات العملية لنشر وelectroporate CAR + T من الخلايا PB وUCB. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

upload/50070/50070fig2highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg "/>
الشكل 2. توصيف الخلايا T المعدلة وراثيا من PB. (A) في التعبير عن EGFP يوم 0 دورة التحفيز الأولى لتقييم كفاءة نقل الجينات. التعبير عن CD19 محددة CAR (CD19RCD28) وفقا لتقييم التدفق الخلوي على CD3 +، + CD8 CD4 + الخلايا وT في ساعة حوالي 24 (B) بعد الصعق الكهربائي و(C) 28 يوما بعد المشاركة في الثقافة على AAPC. ولوحظ التعبير مماثلة من الخلايا T CAR مع UCB المشتقة. (D) حركية التعبير CAR. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3
الشكل 3. نشر PB-مشتقة CAR+ T الخلايا. معدل التوسع الرقمية من CD3 + + وCAR خلايا T المستمدة من PB بتكرار الثقافة المشتركة على γ-المشع AAPC في وجود الإنسان المؤتلف للذوبان IL-2 وIL 21-. الأسهم إلى أعلى تشير إلى إضافات من γ-المشع AAPC التي تميز بداية كل دورة التحفيز. UCB المستمدة من الخلايا T + CAR يحمل معدلات مماثلة من التوسع رقمية.

الشكل 4
الشكل 4. التخطيطي لعملية التصنيع باستخدام SB ونظم AAPC لتعديل وراثيا ونشر CAR + T تم إنشاؤها الخلايا المشتقة من PB وUCB. CD19 محددة CAR + T الخلايا عن طريق التحويل الكهربائي من SB-DNA supercoiled المستمدة البلازميدات واللاحقة شارك في الثقافة على K562 المستمدة AAPC (استنساخ # 4) في س الوجودو IL-2 المؤتلف للذوبان الإنسان وIL-21. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

T الخلية المصدر ينقول * Transposase T الخلية التسريب IRB # NIH-OBA # IND #
ذاتي (المشتقة من المريض) ** CD19RCD28 SB11 بعد ذاتي زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم 2007-0635 0804-922 14193
خيفي (المانحة المشتقة) CD19RCD28 SB11 بعد خيفي زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم 2009-0525 0910-1003
خيفي (المانحة المشتقة) CD19RCD28 SB11 بعد خيفي زرع الحبل السري الدم 2010-0835 1001-1022 14739

* الجدول 1. التجارب السريرية تحت رعاية ادارة الاغذية والعقاقير في MDACC لبث CD19 محددة CAR نشر خلايا T + على AAPC. يتم تقديم الخلايا T محددة لCD19 التعبير من خلال القسري للSB ينقول الترميز لسيارة الجيل الثاني 2، CD19RCD28 المعينة، أن إشارات من خلال CD28 وCD3 ε. ** الابتدائية الموضحة في المرجع 5.

Discussion

ينقول ونظم transposase، مثل من piggyBac 12،19 وSB 18،20-22، غير أن النهج للفيروسات العلاج الجيني التي هي بديل لالفيروسي بوساطة تنبيغ من CAR الصف السريرية + الخلايا التائية. تم اختيار SB كما نقل الجين نظام يعتمد على قدرته على العلاج الجيني البشري 1،6،23. قمنا بتطوير التكنولوجيات المزدوجة للتبديل SB (لإدخال CAR) وإضافة العودية من γ-المشع AAPC (لاسترداد خلايا T المعدلة وراثيا معربا عن ثابت سيارة) لتكون بمثابة منصة التقنيات في صناعة الخلايا T-TAA محددة في الامتثال مع المركب للمرحلة I / II التجارب (الشكل 4). بعد 28 يوما (أربعة دورات التحفيز لمدة 7 أيام) من الثقافة المشتركة على γ-المشع AAPC، ونحن عادة ما تكون قادرة على توليد ما لا يقل عن 10 10 ~ خلايا T المعدلة وراثيا مناسبة للتطبيقات الإنسان. حسب الحاجة، ويمكن القيام دورات التحفيز إضافية رس توليد أعداد أكبر من الخلايا T المعدلة وراثيا. وعلاوة على ذلك، إذا كانت هناك حاجة أقل CAR + T الخلايا، يمكن تحجيم النهج المتبع في الصعق الكهربائي وانتشار توظيف عدد أقل من عودة cuvettes والمضي قدما مجرد مجموعة فرعية من الخلايا T وتوسعت عدديا لجولات لاحقة من انتشار على AAPC في بداية كل دورة التحفيز. electroporated غالبية خلايا T ونشر حصاد للتسريب التعبير عن ثابت جمهورية أفريقيا الوسطى. آل إليه CD4 + + CD8 الخلايا وT معربا عن جيلنا الثانية 2 CAR تشمل خلايا الذاكرة مع النمط الظاهري / ساذجة وسيعرض ثلاث بصمات إعادة توجيه خصوصية. أولا، T الخلايا المعدلة وراثيا على وجه التحديد الأهداف ليز + CD19، وثانيا، إنتاج الإنترفيرون γ استجابة لمحفز الخلايا CD19 + وثالثا، تتكاثر ردا على CD19 + الخلايا المغذية، كل بطريقة CAR-تعتمد 13،18. لدينا نهج لintegrيمكن القيام بها يأكلون التحوير CAR عن طريق التحويل الكهربائي من البلازميدات DNA غير الفيروسية من النظام SB في الخلايا T هادئة الأولية المستمدة من PB وUCB. عدلت وراثيا وغيرها ونحن K562 الخلايا لتكون بمثابة AAPC للنشر الأرقام بكفاءة سريريا ذاتيا من الخلايا T للتسريب 24،25. لقد تم AAPC والأنسجة البيئة ثقافة (مثل إضافة IL-21) قد تم تعديلها لتوليد المريض والجهات المانحة المستمدة CD19 خلايا T محددة للتسريب بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (الجدول 1) 13،18. نحن يمكن ان تنتج خلايا T + CAR من PB حصل ببساطة عن طريق بزل الوريد الذي يتجنب تكلفة، وعدم الراحة، والحصول على إزعاج MNC من PB بواسطة فصادة. القدرة على استخلاص عدد كبير من الخلايا T + CAR من أعداد صغيرة من MNC جذابة بشكل خاص لغرس الخلايا T بعد زرع خيفي UCB. صغر حجم وعدم الكشف عن الجهة المانحة يحول دون إعادة حديثي الولادة-الوصول إلى هذا الشخص في وقت لاحق نقطة وأرقام محدود فقط من الشركات متعددة الجنسيات المقطوع تتوفر المواد اللازمة لبدء تصنيع الخلايا T لتجنب التداخل مع تكون الدم. مزيد من التقدم في عملية التصنيع يتم تنفيذها حاليا لتشمل الصعق الكهربائي و جهاز إنتاجية عالية إلى جانب وجود مفاعل حيوي WAVE مغلقة تماما للحد من التعامل معها. في مجموعها، وSB وAAPC جذابة لتوليد منصات CD19 محددة CAR + T الخلايا التي يمكن تكييفها لتوليد أعداد كبيرة من الخلايا T المعدلة وراثيا التي يمكن التعرف البديلة سطح الخلية TAAs في الامتثال المركب.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور كارل يونيو (جامعة بنسلفانيا) لمساعدة توليد وتوفير استنساخ AAPC رقم 4 والدكتور بيري هاكيت (جامعة مينيسوتا) للحصول على مساعدة مع نظام SB.

منحة الدعم: منح مركز السرطان الأساسية (CA16672)؛ RO1 (CA124782، CA120956، CA141303)؛ R33 (CA116127)؛ P01 (CA148600)؛ SPORE (CA136411)، وألبرت J وارد المؤسسة؛ بوروز ويلكوم الصندوق؛ Gillson Longenbaugh المؤسسة؛ الوقاية من السرطان ومعهد بحوث تكساس؛ CLL مؤسسة أبحاث العالمية؛ زارة الدفاع؛ العقارية من Noelan L. Bibler؛ هاري T. Mangurian، الابن، صندوق لعلاج مناعي اللوكيميا؛ معهد علاج السرطان شخصية؛ اللوكيميا سرطان الغدد الليمفاوية والمجتمع؛ الغدد اللمفاوية مؤسسة البحوث؛ MDACC شقيقة مؤسسة شبكة الصندوق؛ ميلر مؤسسة، والسيد هيرب سيمونز، والسيد والسيدة جو H. الموازين، والسيد توماس سكوت، المؤسسة الوطنية لأبحاث السرطان، أمراض الأطفال مؤسسة أبحاث السرطان؛ Assistanc الإنتاجه لالعلاجات الخلوية (PACT)؛ وليام لورانس ومؤسسة هيوز بلانش للطفولة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DNA plasmid expressing GFP (pmaxGFP) Lonza VPA-1002 (kit)
PBS Sigma D8537
CliniMACS PBS-EDTA Miltenyi Biotec 70026
HyQ RPMI-1640 Thermo Scientific SH30096.01
Phenol Free RPMI-1640 Thermo Scientific SH30605.01
Hyclone Fetal Bovine Serum Thermo Scientific SH3007003HI
GlutaMAX (100x) Gibco 3505-061
Ficoll-Paque GE Healthcare Biosciences 17-1440-02
Recombinant human IL-21 PeproTech AF-200-21
Recombinant human IL-2 (Proleukin) Novartis NDC 65483-116-07
Human T cell Kit (Nucleofector Solution) Lonza VPA-1002
CliniMACS CD56 Reagent Miltenyi 70206
FITC-conjugated to mouse mAb specific for human CD3 BD Biosciences 349201
APC-conjugated to mouse mAb specific for human CD4 BD Biosciences 340443
PerCPCy5.5-conjugated to mouse mAb specific for human CD8 BD Biosciences 341051
PE-conjugated to F(ab')2 fragment of goat antibody specific for human Fcγ Invitrogen H10104
Sodium Azide Sigma S2002
Disposables
12-well plate Corning 3513
T-75 cm2 flask Corning 430641
Culture bags Vue Life 290C; 750C
50 ml centrifuge tube BD Biosciences 352098
Equipment
Amaxa Nuceleofector II Lonza AAB-1001
Cellometer Nexcelom Bioscience Cellometer Vision
Sorvall Legend RT Centrifuge Sorvall 75004377
BD FACS Calibur BD Biosciences 342975
Controlled rate freezer Planer Kryo 750
Irradiator CIS bio International IBL-437 C#09433
Expression of Molecules (Endogenous and Introduced)
Cell Line Common Name Cell Type Molecules Expressed
CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 Clone 4 K562 CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP co-expressed with membrane bound IL-15

Complete Culture Media (CCM) (stored at 4 °C for up to 30 days)
HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640
10% FBS
1% GlutaMAX

Flow Cytometry Buffer (stored at 4 °C for up to 30 days)
PBS
2% FBS
0.1% Sodium Azide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor. Blood. 116, 1035-1044 (2010).
  2. Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held. Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).
  3. Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. CARs on track in the clinic. Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).
  4. Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy. Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).
  5. Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).
  6. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32, 756-767 (2010).
  7. Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies. Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).
  8. Williams, D. A. Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States. Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).
  9. Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes. Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).
  10. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
  11. Izsvak, Z., Ivics, Z. Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy. Mol Ther. 9, 147-156 (2004).
  12. Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).
  13. Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies. Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).
  14. Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).
  15. Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18, 849-856 (2011).
  16. Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).
  17. Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity. Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).
  18. Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).
  19. Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor. Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).
  20. Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases. Cancer Res. 72, 271-281 (2012).
  21. Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies. Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).
  22. Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes. Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).
  23. Hackett, P. B. Jr, Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies. Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).
  24. Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules. Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).
  25. Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells. Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).

Tags

علم المناعة، العدد 72، الخليوي علم الأحياء، الطب، علم الأحياء الجزيئية، علم الأحياء السرطان، الهندسة الطبية الحيوية، أمراض الدم، الكيمياء الحيوية، علم الوراثة، الخلايا اللمفاوية T-، مستضد تقديم الخلايا وسرطان الدم واللمفاوية، سرطان الغدد الليمفاوية، المستضدات، CD19، العلاج المناعي، بالتبني، الصعق الكهربائي، الهندسة الوراثية والعلاج الجيني، والجمال النائم، CD19، وخلايا T، همي مستقبلات مستضد، الخلايا مستضد تقديم الاصطناعي، التجارب السريرية، الدم المحيطي، دم الحبل السري، الحفظ بالتبريد، الصعق الكهربائي
السريرية تطبيق<em&gt; الجمال النائم</em&gt; ومستضد تقديم الخلايا الاصطناعية لتعديل وراثيا خلايا T من دم الحبل السري والمحيطية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huls, M. H., Figliola, M. J.,… More

Huls, M. H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., Olivares, S., Kebriaei, P., Shpall, E. J., Champlin, R. E., Singh, H., Cooper, L. J. N. Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood. J. Vis. Exp. (72), e50070, doi:10.3791/50070 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter