Summary
T-celler udtrykker et CD19-specifikt kimære antigen receptor (CAR) er infunderes som undersøgte behandling af B-cellesygdomme i vores first-in-forsøg med human genterapi. Vi beskriver gensplejsning af T-celler ved hjælp af
Abstract
Styrken af klinisk kvalitet T-celler kan forbedres ved at kombinere genterapi med immunterapi at konstruere et biologisk produkt med mulighed for bedre (i) erkendelse af tumorassocierede antigener (TAA'er), (ii) persistens efter infusion, (iii) potentiale for migration til tumorpositionen, og (iv) evnen til at genbruge effektorfunktioner i tumoren mikromiljø. De fleste tilgange til genetisk manipulation af T-celler manipuleret til anvendelse til mennesker har brugt retrovirus og lentivirus for den stabile ekspression af CAR 1-3. Denne fremgangsmåde, selvom overensstemmelse med gældende god fremstillingspraksis (GMP), kan være dyre, da det bygger på fremstilling og frigivelse af klinisk kvalitet rekombinant virus fra et begrænset antal produktionsanlæg. Den elektro-overførsel af ikke-virale plasmider er en tiltalende alternativ til transduktion da DNA-arter kan produceres til klinisk kvalitet på ca 1/10 th udgifterne til recombinant GMP-kvalitet virus. For at forbedre effektiviteten af integration, vi tilpassede Tornerose (SB) transposon og transposase for human anvendelse 4-8. Vores SB system anvender to DNA-plasmider, der består af et transposon koder for et gen af interesse (f.eks 2. generation CD19-specifikke CAR transgen, betegnet CD19RCD28) og en transposase (f.eks SB11), som indsætter transgenet i TA dinucleotid gentager 9-11 . For at generere klinisk tilstrækkelige antal genetisk modificerede T-celler vi bruger K562-afledte kunstige antigenpræsenterende celler (AAPC) (klon # 4) modificeret til at udtrykke et TAA (fx CD19) samt de T-celle-costimulerende molekyler CD86, CD137L, en membranbundet version af interleukin (IL) -15 (peptid fusioneret til modificeret IgG4 Fc region) og CD64 (Fc-γ-receptor 1) til indladning af monoklonale antistoffer (mAb) 12. I denne rapport, viser vi de procedurer, der kan gennemføres i compliance med cGMP at generere CD19-specifik CAR + T-celler der er egnede til anvendelse på mennesker. Dette blev opnået ved den synkrone elektro-overførsel af to DNA-plasmider, en SB transposon (CD19RCD28) og en SB transposase (SB11) efterfulgt af hentning af stabile integranter ved hver-7 dages tilsætninger (stimulation cycle) af γ-bestrålede AAPC (klon # 4) i nærvær af opløseligt rekombinant humant IL-2 og IL-21 13. Typisk 4 cyklusser (28 dages vedvarende dyrkning) sted at frembringe klinisk tiltalende antal af T-celler, som stabilt udtrykker CAR. Denne metode til fremstilling af klinisk kvalitet CD19-specifikke T-celler kan anvendes til T-celler afledt fra perifert blod (PB) eller navlestrengsblod (UCB). Endvidere kan denne fremgangsmåde udnyttes til at generere T-celler til forskellige tumortyper ved at parre den specifikke karakter af den indførte CAR med ekspression af TAA, anerkendt af bilen, på AAPC.
Protocol
Dag 0 eller Før
1. Isolering af mononukleære celler (MNC) fra PB og UCB
- Fortynd PB med samme volumen, og UCB med fire volumener PBS-EDTA.
- Langsomt lag fortyndede blod (25 ml) på Ficoll (12 ml) i et 50 ml centrifugerør (s) og centrifugeres ved 400 x g i 30 - 40 min (ingen bremse).
- Indsamle og overføre den mononukleære cellefraktion (interface) under anvendelse af en transfer pipette til et frisk 50 ml centrifugerør.
- Bring op rumfang på 50 ml med PBS-EDTA og centrifuger ved 450 xg i 10 min.
- Aspirer supernatanten forsigtigt resuspender cellepelleten (e) i 50 ml komplette dyrkningsmedier (CCM), og centrifugeres ved 400 x g i 10 minutter.
- Forsigtigt resuspendere og pool cellepellets i CCM og udføre en celletælling ved hjælp af trypanblåt udelukkelse metode (Cellometer, PBMC program).
- MNC kan nu anvendes til elektroporering (Nucleofection) eller kryokonserveres til fremtidig brug.
- Hvis der anvendes kryopræserveret MNC, tø hurtigt tilstrækkelige celler til fuld skala elektroporering (2 x 10 8 tilsætning ~ 20% at tage højde for celletab under centrifugering og 2 timers inkubering) i 37 ° C vandbad. Hvis du bruger frisk isolerede MNC videre til trin 2,3.
- Forsigtigt genopslæmmes og overføre cellerne til en passende størrelse centrifugeglas (er) indeholdt forvarmet Complete Phenol-frit RPMI dyrkningsmedier (PF-RPMI) og centrifugeres ved 200 x g i 10 minutter (ingen bremse), aspirat supernatant.
- Genopslæmmes MNC i PF-RPMI, udføre en celletælling (Cellometer) og overføre cellerne til en passende størrelse cellekultur fartøj (er) i en koncentration på 10 6 celler / ml.
- Inkuber i en fugtig 37 ° C / 5% CO2-inkubator i 2 timer ± 30 min.
- Overfør MNC til sterilt centrifugerør (s), centrifugering ved 200 x g i 5 minutter (ingen bremser), aspireres supernatanten og forsigtigt re-suspendere og kombinere cellepelleten (er) i PF-RPMI.
- Udfør en celletal (Cellometer) og beregne volumen af cellesuspensionen kræves (2 x 10 8 MNC).
- Overfør den beregnede mængde til et sterilt 50 ml centrifugerør og centrifugering ved 200 x g i 10 minutter (ingen bremse).
- Aspirer supernatanten, så ingen rester medier fortsat og forsigtigt resuspender ved at trykke på siden af røret.
3. Elektroporation (Nucleofection) af MNC (Full Scale proces med 10 Kuvetter) på dag 0
- Præ-inkuber en steril 12-brønds plade med 10 brønde indeholdende 4 ml varm PF-RPMI i en befugtet 37 ° C / 5% CO2 inkubator.
- Forberede og præ-opvarmes Lonza Nucleofector Solution human T-celle-kit (rekonstitueret ifølge producentens anvisninger, www.lonza.com ) til omgivelsestemperatur i et biosikkerhed kabinet (BSC).
- Forbered Nucleofector løsning / DNA mester mix af adding 100 pi suppleret Nucleofector opløsning, 15 ug transposon (supersnoet DNA-plasmid betegnet som CD19RCD28/pSBSO) og 5 ug transposase (supersnoet DNA-plasmid betegnet som pCMV-SB11) pr reaktion / cuvette.
- Dispergere cellepelleten (fra trin 2.8) ved forsigtigt at banke på siden af centrifugerøret og resuspender i Nucleofection opløsning / DNA stamblanding (endelig cellekoncentration: 2 x 10 7 celler/100 pl).
- Forsigtigt overføre 100 pi af cellesuspensionen (fra trin 3,4) til hver af ti (10) Lonza Nucleofection kuvetter, være omhyggelig med at undgå bobler.
- Tryk på kuvetten én gang, og elektroporere bruge programmet U-014 (for ustimulerede T-celler).
- Overfør kuvetterne og den 12-brønds plade (trin 3.1) til BSC.
- Høste elektroporerede celler fra hver kuvette ved anvendelse af en Amaxa fine spids transfer pipette, ved at tilføje ~ 500 ul af forvarmet dyrkningsmedium fra den tilsvarende brønd (plade med 12 brønde fremstillet i Stes. 3.1) og returnere pladen til en befugtet 37 ° C / 5% CO2-inkubator i 2 timer ± 30 min.
- Efter 2 timers inkubering, høst og overføre cellerne fra alle brønde til et sterilt centrifugerør.
- Vask cellerne ved centrifugering ved 140 x g i 8 min, stuetemperatur, uden bremse og opsuge og supernatanten fjernes, således at ingen residual medium omfatter cellepelleten.
- Dispergere cellepelleten ved forsigtigt at banke på siden af centrifugerøret og forsigtigt genopslæmmes i CCM at opnå en enkelt cellesuspension.
- Udfør celletal og justere celle-koncentrationen til 10 6 celler / ml i CCM.
- Overførsel cellesuspension til cellekultur kolbe (er) og placeres i inkubatoren natten over.
- Fremgangsmådetrin 2,1-3,8 blev gentaget til kontrol: EGFP-transficerede celler (5 x 10 6 celler / kuvette med 5 ug Amaxa kontrol EGFP supersnoet plasmid, pmaxGFP).
Dag 1 af 1 m og efterfølgendeStimulation Cycles
4. Analyse af CAR ekspression ved flowcytometri på dag 1
- Høste elektroporerede celler og udføre en celletælling med Trypan-blå eksklusion metode (hæmocytometer).
- Stain celler (1-2 x 10 6) med antistof specifikt for CD3, CD4, CD8 og humant IgG Fcy (som en måling af CAR ekspression).
- Erhverve celler på FACS Calibur og analysere data ved hjælp af FCS Express software til at beregne udtryk for CAR.
- Beregn Car + celler i kultur ved formlen:
(Antal Total levedygtige celler) x (% bil + celler) = Antal CAR +-celler
- Beregn Car + celler i kultur ved formlen:
5. Fremstilling af AAPC (klon # 4) på dag 1.. AAPC (klon # 4) var afledt af K562-celler (parentale linje opnået fra American Type Culture Collection) til Co-express ønskede T celle co-stimulerende molekyle
- Tø en alikvot af frosne 100 Gy bestrålede AAPC i et 37 °, C vandbad.
- Celler vaskes to gange ved centrifugering ved 400 x g, 10 minutter i CCM og talt under anvendelse Cellometer (Trypan-blå eksklusion).
- Beregn antallet af levedygtige AAPC kræves for stimulation:
(Antal bil + celler) x 2 = Antal bestrålet AAPC kræves
6. AAPC-medieret Stimulation af CAR + T-celler på dag 1, der begynder på 1 m og efterfølgende stimulation Cycles
- Bland elektroporerede celler (der udtrykker CAR) og γ-bestrålede AAPC (klon nr. 4) i en steril beholder i et forhold på 1:2 (CAR + cell: levedygtig AAPC) i CCM.
- Bemærk den AAPC forhold justeres for ekspressionen af CAR baseret på flowcytometri dagen efter elektroporering.
- Tilføj IL-21 (30 ng / ml) til cellesuspensionen.
- Portion anbringes i T-75 cm2 kolbe (er) og / eller Vue Life Culture poser i en koncentration på 10 6 celler / ml og vende tilbage til incubateller.
Dag 3, 5
7. Fortsat Culture of CAR + T-celler
- Udfør en halv media ændring, genopbygge IL-21, og fastholde T-celler i en koncentration på 10 6 celler / ml.
Dag 7
8. Slut på første AAPC-medieret stimulering Cycle
- Harvest celler, tælle og plette for CD3, CD4, CD8, og Fcy (CAR) og fortsæt til trin 10,1.
9. Udtømning af CD56 +-celler (sædvanligvis mellem 7 og 14 dage efter elektroporering)
- Udfør en CD56 udtynding ved hjælp af paramagnetiske kugler, hvis CD56 + CD3 neg lymfocytter ≥ 10%.
Stimulation Cycles # 2, # 3, & # 4 svarende til Days 8 → 14, Dage 15 → 21, og Dage 22 → 28
10. Rekursiv Tilsætning af AAPC at udbrede T-celler til klinisk tilstrækkeligt antal
- Gentag stimulation-processen (4 gange) som beskrevet i trin fra 4,3 til 8,1.
- Tilføj IL-2 (50U/ml) til kulturerne begynder på dag 7, 14 og 21, og derefter ved hver medierne forandring (tre gange om ugen, på en mandag-onsdag-fredag tidsplan).
- Kryopræservere (archive) overskud af T-celler efter behov.
- T-celler fryses ved hjælp af kontrolleret hastighed fryser.
Dag 28
11. Slutningen af sidste AAPC-medieret Stimulation Cycle: Harvest T-celler
- Kryopræservere T-celler for frigivelse test og infusion.
Representative Results
Vi rapporterer, at elektro-overførsel af DNA-plasmider og formering af T-celler på γ-bestrålede AAPC kan anvendes til at frembringe klinisk tiltalende antal af T-celler afledt fra PB og UCB til anvendelse på mennesker. Disse genetisk modificerede T-celler udtrykker et indført CAR der genkender TAA CD19, uafhængigt af større histokompatibilitetskompleks. The SB-afledte DNA-plasmider til at udtrykke de (i) transposon, en 2. generations CAR (CD19RCD28), at signaler gennem CD28 og CD3-ε 14, og (ii) transposase, SB11 15, er tidligere blevet beskrevet 13, 16,17 . Plasmiderne, der anvendes i den aktuelle undersøgelse blev fremstillet kommercielt af Waisman Clinical bioproduktion Facility (Madison, WI). The AAPC (klon # 4), afledt fra K562-celler (parentale linje opnået fra American Type Culture Collection), co-express ønsket T-celle-co-stimulerende molekyler (hver indførte molekyle til 3 90% på celleoverfladen af AAPC),som tidligere beskrevet 12. Her viser vi, at CD19-specifikke T-celler kan genereres fra mononukleære celler (MNC) afledt fra PB eller UCB hjælp SB gennemførelse at indføre CAR efterfulgt af tilsætning af AAPC til numerisk ekspandere T-cellerne i en CAR-afhængig måde (figur 1 , 4) 13,18. Ti kuvetter (2x10 7 MNC / kuvette) er elektroporeret for hver modtager ved anvendelse af 15 ug DNA plasmid (CD19RCD28/pSBSO) koder for transposon (CAR) og 5 ug DNA plasmid (pCMV-SB11) koder for transposase (SB11). Antallet af kuvetter kan reduceres, hvis MNC er begrænsende eller skaleret tilbage til laboratoriearbejde. Dagen for elektroporation er defineret som "dag 0" af Stimulation cyklus nr. 1. Som kontroller for flowcytometri og dyrkningsbetingelser, er autologe T-celler mock elektroporerede (uden DNA plasmid) og numerisk udbygget på γ-bestrålet AAPC (klon # 4), der var blevet præinstalleret med OKT3 til cross-link CD3 at opretholde T-celle proliferation. Vi routinely vurdere effektiviteten af elektrotransfer og levedygtigheden af T-cellerne dagen efter elektroporering (figur 2B). Ekspressionen af EGFP fra kontrol-DNA plasmid (betegnet pmaxGFP) og CAR på dette indledende tidspunkt afspejler proteinekspression fra den integrerede og episomal plasmid. Typisk dagen efter elektroporering måler vi EGFP ekspression på ~ 60% og CAR ekspression på ~ 40% (figur 2A) med T-celle-levedygtighed mellem 40-50%. Rekursive tilsætninger af γ-bestrålede AAPC i nærværelse af opløselig rekombinant human IL-2 og IL-21 opdaterer T-celler der stabilt udtrykker CAR (CD19RCD28). CD3 neg CD56 + NK-celler er depleteret fra kulturen ved hjælp af CD56-specifikke paramagnetiske perler hvis procentdelen af disse NK-celler er ≥ 10%, og især hvis den procentvise andel af CAR udtrykt på T-cellerne er lav. Denne udtømning forhindrer den hurtige vækst af NK-celler, som interfererer med evnen af AAPC at opretholde proliferation af CAR + T-celler. Den lejlighed, er udtømning af NK-celler fra CAR + T-celler gennemført i løbet af de sidste to stimulation cyklusser, men denne indfører et tab af ønskede celler på grund af co-ekspression af CD56 på nogle CAR + T-celler. T-cellerne blev dyrket i et funktionelt lukket system ved hjælp Vue Life kultur poser sidste dag 14. En undergruppe af de genetisk modificerede og opformeres T-celler typisk kryokonserveret på dag 14 eller dag 21 (slut på Stimulation cyklusser # 2 eller # 3) i co-kultur på AAPC at tjene som en kilde til arkiveret materiale til fremtidige analyser og være optøet hvis uventede problemer senere opstår under fremstillingsprocessen. T-celler høstes typisk på eller omkring dag 28 af kulturen (figur 3), der rutinemæssigt udtrykker> 90% CAR og er> 80% levedygtige (figur 2C, D). Vi har tidligere vist, at der efter fire ugers samdyrkning på AAPC den gennemsnitlige fold-ekspansion af CD3 + T-celler, er 19.800 ± 11.313 med CA R + ekspression var 90% ± 7,5 13. Disse T-celler kryokonserveret og undergår in-proces og frigivelse test, der informerer om sikkerhed og terapeutiske potentiale af det fremstillede produkt. Frigivelsesprøvning sker i overensstemmelse med kliniske laboratorium forbedring ændringer (CLIA) til at generere en attest for analyse forud for infusion i modtagerne på kliniske forsøg.
Figur 1. Trin skitserer processen til elektroporere og udbrede CAR + T-celler fra PB og UCB. Klik her for at se større figur .
upload/50070/50070fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg "/>
Figur 2. Karakterisering af genetisk modificerede T-celler fra PB. (A) Ekspression af EGFP på dag 0 den første stimulation cycle at vurdere effektiviteten af genoverførsel. Ekspression af CD19-specifikt CAR (CD19RCD28) som vurderet ved flowcytometri på CD3 +, CD8 + og CD4 + T-celler ved (B) ca 24 timer efter elektroporering og (C) 28 dage efter co-dyrkning på AAPC. Lignende ekspression af CAR blev observeret med UCB-afledte T-celler. (D) Kinetik af CAR udtryk. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Formering af PB-afledt CAR+ T-celler. Rate af numeriske udvidelse af CD3 + og CAR +-T-celler afledt fra PB ved gentagne co-kultur på γ-bestrålede AAPC i nærvær af rekombinant human opløselig IL-2 og IL-21. Opadgående pile angiver tilsætninger af γ-bestrålet AAPC, der markerer begyndelsen af hver Stimulation cyklus. UCB-afledt BIL + T-celler udviser lignende satser for numerisk ekspansion.
Figur 4. Skematisk af fremstillingsprocessen ved hjælp af SB og AAPC systemer til genetisk at modificere og udbrede CAR +-T-celler afledt fra PB og UCB. CD19-specifik BIL + T-celler blev dannet ved elektro-overførsel af SB-afledte supercoilede DNA-plasmider og efterfølgende co-kultur på K562-afledt AAPC (klon # 4) i nærvær of rekombinant humant opløseligt IL-2 og IL-21. Klik her for at se større figur .
| T-celle-kilde | Transposon * | Transposase | T-celle-infusion | IRB # | NIH-OBA # | IND # |
| Autologe (patient-afledt) ** | CD19RCD28 | SB11 | Efter autolog hæmatopoietisk stamcelle transplantation | 2007-0635 | 0804-922 | 14.193 |
| Allogen (donor-afledt) | CD19RCD28 | SB11 | Efter allogen hæmatopoietisk stamcelle transplantation | 2009-0525 | 0910-1003 | |
| Allogen (donor-afledt) | CD19RCD28 | SB11 | Efter allogen navlestrengsblod transplantation | 2010-0835 | 1001-1022 | 14.739 |
* Tabel 1. Kliniske forsøg i regi af FDA i MDACC at indgyde CD19-specifik bil + T-celler opformeret på AAPC. T-celler gøres specifik for CD19 ved tvungen ekspression af SB transposon koder for et 2. generations CAR, betegnet CD19RCD28, at signaler gennem CD28 og CD3-ε. ** Trial beskrevet i reference 5.
Discussion
Transposon-og transposase systemer, såsom fra piggyBac 12,19 og SB 18,20-22, er ikke-virale fremgangsmåder til genterapi, som er et alternativ til viral-medieret transduktion af klinisk kvalitet CAR + T-celler. SB blev valgt som genoverførsel baseret på dens potentiale til human genterapi 1,6,23. Vi udviklede den dobbelte teknologier SB gennemførelse (at indføre en CAR) og rekursiv tilføjelse af γ-bestrålet AAPC (at hente genetisk modificerede T-celler stabilt udtrykker en CAR) at tjene som platform teknologier i fremstillingen af TAA-specifikke T-celler i overensstemmelse med cGMP for fase I / II-forsøg (fig. 4). Efter 28 dage (fire 7-dages stimulering cykler) i co-kultur på γ-bestrålet AAPC, er vi typisk i stand til at generere mindst ~ 10 10 genetisk modificerede T-celler egnet til anvendelse på mennesker. Efter behov kan yderligere stimulering cykler foretages to generere et større antal af genetisk modificerede T-celler. Desuden, hvis mindre bil + T-celler er nødvendige, kan tilgangen til elektroporering og opformering blive nedtrappet ansætte færre kuvetter og fremførsel bare et sub-sæt af de numerisk ekspanderede T-celler til efterfølgende runder af proliferation på AAPC ved begyndelsen af hver Stimulation cyklus. Størstedelen af den elektroporeret og opformeres T-celler høstet til infusion stabilt udtrykker CAR. Den udvækst af CD4 + og CD8 + T celler, der udtrykker vores 2 nd generation CAR omfatter celler med en hukommelse / naiv fænotype og udstille tre kendetegnende for re-dirigeret specificitet. For det første er de genetisk modificerede T-celler specifikt lyserer CD19 + mål for det andet producerer IFN-γ som reaktion på CD19 +-stimulatorceller og for det tredje, prolifererer som reaktion på CD19 + feeder-celler, alle i en CAR-afhængig måde 13,18. Vores tilgang til integrspiste en CAR transgenet ved elektro-overførsel af ikke-virale DNA-plasmider fra SB-systemet kan foregå i hvilende primære T-celler afledt fra PB og UCB. Vi og andre har genetisk modificerede K562-celler til at tjene som AAPC effektivt at udbrede klinisk tilstrækkeligt antal T-celler til infusion 24,25. The AAPC-og vævskultur miljø (f.eks tilsætning af IL-21) er blevet modificeret til at generere patient-og donor-afledt CD19-specifikke T-celler infusion efter hæmatopoietisk stamcelle transplantation (tabel 1) 13,18. Vi kan fremstille CAR + T-celler fra PB simpelthen opnået ved venepunktur, som undgår de omkostninger, ubehag, og besvær med at opnå MNC fra PB ved aferese. Evnen til at udlede et stort antal CAR + T-celler fra et lille antal MNC appellerer især til infusion T-celler efter allogen UCB transplantation. Den lille størrelse og anonymitet neonatal donor til hinder for re-Adgang til denne person på et senere tidspunkt, og kun et begrænset antal høstede MNC er tilgængelige som udgangsmateriale for T-celle produktion for at undgå at forstyrre hæmatopoiese. Yderligere forskud til fremstillingsprocessen er i øjeblikket i gang at inkludere et højt gennemløb elektroporation enhed kombineret med en helt lukket WAVE bioreaktor for at minimere håndtering. I alt blev der SB og AAPC tiltalende platforme til at generere CD19-specifik CAR + T-celler, der kan tilpasses til at frembringe store antal genetisk modificerede T-celler, der kan genkende alternative celleoverflade-TAA'er i overensstemmelse med cGMP.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Carl juni (University of Pennsylvania) for at få hjælp generering og give AAPC klon # 4 og Dr. Perry Hackett (University of Minnesota) for at få hjælp med SB-systemet.
Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672) RO1 (CA124782, CA120956, CA141303), R33 (CA116127), P01 (CA148600), SPORE (CA136411), Albert J Ward Foundation, Burroughs Wellcome fondens Gillson Longenbaugh Foundation; Cancer Prevention og Research Institute of Texas, CLL Global Research Foundation, Department of Defense, Estate af Noelan L. Bibler, Harry T. Mangurian, Jr., Fonden for leukæmi immunterapi, Institut for Personlig Cancer Therapy, leukæmi og lymfom Society, Lymphoma Research Foundation; MDACC søster Institution Network fondens Miller Foundation, Mr. Herb Simons, Mr. og Mrs Joe H. Scales, Mr. Thomas Scott, National Foundation for Cancer Research, Pediatric Cancer Research Foundation; Production Assistance for Cellular Terapier (PACT), William Lawrence og Blanche Hughes Børns Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||
| Reagents | |||||||||||||||
| DNA plasmid expressing GFP (pmaxGFP) | Lonza | VPA-1002 (kit) | |||||||||||||
| PBS | Sigma | D8537 | |||||||||||||
| CliniMACS PBS-EDTA | Miltenyi Biotec | 70026 | |||||||||||||
| HyQ RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30096.01 | |||||||||||||
| Phenol Free RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30605.01 | |||||||||||||
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007003HI | |||||||||||||
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 3505-061 | |||||||||||||
| Ficoll-Paque | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-02 | |||||||||||||
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | AF-200-21 | |||||||||||||
| Recombinant human IL-2 (Proleukin) | Novartis | NDC 65483-116-07 | |||||||||||||
| Human T cell Kit (Nucleofector Solution) | Lonza | VPA-1002 | |||||||||||||
| CliniMACS CD56 Reagent | Miltenyi | 70206 | |||||||||||||
| FITC-conjugated to mouse mAb specific for human CD3 | BD Biosciences | 349201 | |||||||||||||
| APC-conjugated to mouse mAb specific for human CD4 | BD Biosciences | 340443 | |||||||||||||
| PerCPCy5.5-conjugated to mouse mAb specific for human CD8 | BD Biosciences | 341051 | |||||||||||||
| PE-conjugated to F(ab')2 fragment of goat antibody specific for human Fcγ | Invitrogen | H10104 | |||||||||||||
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |||||||||||||
| Disposables | |||||||||||||||
| 12-well plate | Corning | 3513 | |||||||||||||
| T-75 cm2 flask | Corning | 430641 | |||||||||||||
| Culture bags | Vue Life | 290C; 750C | |||||||||||||
| 50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |||||||||||||
| Equipment | |||||||||||||||
| Amaxa Nuceleofector II | Lonza | AAB-1001 | |||||||||||||
| Cellometer | Nexcelom Bioscience | Cellometer Vision | |||||||||||||
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Sorvall | 75004377 | |||||||||||||
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | 342975 | |||||||||||||
| Controlled rate freezer | Planer | Kryo 750 | |||||||||||||
| Irradiator | CIS bio International | IBL-437 C#09433 | |||||||||||||
Complete Culture Media (CCM) (stored at 4 °C for up to 30 days) Flow Cytometry Buffer (stored at 4 °C for up to 30 days) |
|||||||||||||||
References
- Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor. Blood. 116, 1035-1044 (2010).
- Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held. Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).
- Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. CARs on track in the clinic. Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).
- Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy. Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).
- Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32, 756-767 (2010).
- Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies. Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).
- Williams, D. A. Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States. Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).
- Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes. Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
- Izsvak, Z., Ivics, Z. Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy. Mol Ther. 9, 147-156 (2004).
- Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).
- Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies. Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).
- Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).
- Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18, 849-856 (2011).
- Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).
- Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity. Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).
- Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).
- Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor. Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).
- Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases. Cancer Res. 72, 271-281 (2012).
- Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies. Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).
- Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes. Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).
- Hackett, P. B. Jr, Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies. Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).
- Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules. Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).
- Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells. Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).
