Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Klinisk anvendelse av Published: February 1, 2013 doi: 10.3791/50070
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1
1Division of Pediatrics, U.T. MD Anderson Cancer Center, 2Department of Stem Cell Transplantation and Cellular Therapy, U.T. MD Anderson Cancer Center

Summary

T-celler uttrykker en CD19-spesifikt chimeric antigen reseptor (CAR) er tilført som utprøvende behandling på B-celle maligniteter i våre første i menneskelige genterapiforsøk. Vi beskriver genetisk modifisering av T-celler ved hjelp

Abstract

Styrken av klinisk-grade T-celler kan forbedres ved å kombinere genterapi med immunterapi å konstruere en biologisk produkt med potensial for overlegen (i) anerkjennelse av tumorassosierte antigener (TAA), (ii) etter infusjon persistens, (iii) potensial for migrering til tumor nettsteder, og (iv) evne til å resirkulere effektorfunksjoner i svulsten mikromiljøet. De fleste tilnærminger til genetisk manipulering av T-celler konstruert for menneskelig bruk har brukt retrovirus og lentivirus for den stabile uttrykk for CAR 1-3. Denne tilnærmingen, selv kompatibel med dagens Good Manufacturing Practice (GMP), kan være dyrt som det er avhengig av produksjon og frigjøring av klinisk-grade rekombinant virus fra et begrenset antall produksjonsanlegg. Elektro-overføring av Nonviral plasmider er en tiltalende alternativ til transduksjon siden DNA arter kan produseres til klinisk klasse ved ca 1/10 th kostnaden for recombinmaur GMP-klasse virus. For å forbedre effektiviteten av integrasjon vi tilpasset Sleeping Beauty (SB) transposon og transposase for menneskelig bruk 4-8. Vår SB systemet bruker to DNA plasmider som består av en transposon koder for et gen av interesse (f.eks 2. generasjons CD19-spesifikk CAR transgenet, betegnet CD19RCD28) og en transposase (f.eks SB11) som setter transgenet inn TA dinucleotide gjentar 9-11 . Å generere klinisk tilstrekkelig antall genmodifiserte T celler bruker vi K562-avledede kunstige antigenpresenterende celler (AAPC) (klon # 4) modifiserte for å uttrykke et TAA (f.eks CD19) så vel som T-celle-costimulatory molekyler CD86, CD137L, en membran-bundet versjon av interleukin (IL) -15 (peptid fusjonert til modifisert IgG4 Fc regionen) og CD64 (Fc-γ reseptor 1) for lasting av monoklonale antistoffer (mAb) 12. I denne rapporten viser vi de prosedyrer som kan gjennomføres i compliance med cGMP å generere CD19-spesifikk CAR + T celler egnet for menneskelig bruk. Dette ble oppnådd ved den synkrone elektro-overføring av to DNA plasmider, en SB transposon (CD19RCD28) og en SB transposase (SB11) etterfulgt av gjenfinning av stabile integrants ved hver-7-dagers tilsetninger (stimulering syklus) av γ-bestrålt AAPC (klone # 4) i nærvær av løselig rekombinant humant IL-2 og IL-21 13. Vanligvis 4 sykluser (28 dager med kontinuerlig kultur) er gjennomført for å generere klinisk tiltalende antall T-celler som stabilt uttrykker CAR. Denne metode for å produksjon klinisk-grade CD19-spesifikke T-celler kan brukes til T-celler avledet fra perifert blod (PB) eller navlestrengsblod (UCB). Videre kan denne tilnærmingen bli brukt til å generere T-celler til ulike tumortyper ved sammenkobling spesifisiteten av introdusert CAR med uttrykk for TAA, anerkjent av bilen, på AAPC.

Protocol

Dag 0 eller Før

1. Isolering av mononukleære celler (MNC) fra PB og UCB

  1. Fortynn PB med likt volum, og UCB med fire volumer av PBS-EDTA.
  2. Langsomt sjikt fortynnet blod (25 ml) på Ficoll (12 ml) i en 50 ml sentrifugerør (er) og sentrifuger ved 400 xg i 30 til 40 min (ingen brems).
  3. Utlevering og overføre det mononukleære celle fraksjonen (grensesnitt) ved hjelp av en overføring pipette til en frisk 50 ml sentrifugerør.
  4. Ta opp volumet til 50 ml med PBS-EDTA og sentrifuger ved 450 xg i 10 min.
  5. Aspirer supernatanten forsiktig resuspendere cellepelleten (e) i 50 ml Complete Dyrkningsmedier (CCM) og, sentrifuger ved 400 xg i 10 min.
  6. Forsiktig re-suspendere og basseng cellen pellets i CCM og utføre en celletall ved hjelp Trypan blå utelukkelse metode (Cellometer, PBMC program).
  7. MNC kan nå brukes for elektroporering (Nucleofection) eller fryses ned for fremtidig bruk.
title "> 2. Forberedelse av T-celler for Electroporation på dag 0

  1. Hvis bruker fryses ned MNC, raskt tine tilstrekkelige celler for en fullskala elektroporering (2 x 10 8 legge ~ 20% å gjøre rede for celletap under sentrifugering og 2 timers inkubasjon) i 37 ° C vannbad. Hvis du bruker fersk isolert MNC videre til trinn 2.3.
  2. Forsiktig re-suspendere og overføre celler til en passende størrelse sentrifugerør (s) inneholdt forvarmet Komplett Phenol-Free RPMI kultur media (PF-RPMI) og sentrifuger ved 200 xg i 10 minutter (ingen brems), aspirat supernatant.
  3. Resuspendere MNC i PF-RPMI, utfør en celletall (Cellometer) og overføre cellene til en tilstrekkelig størrelse cellekultur fartøy (er) ved en konsentrasjon på 10 6 celler / ml.
  4. Inkuber i en fuktet 37 ° C / 5% CO 2 inkubator i 2 timer ± 30 min.
  5. Overfør MNC til sterilt sentrifugerør (r), spinn ved 200 xg i 5 minutter (ingen bremser), aspirer supernatanten og forsiktig re-suspendere og kombinere cellepelleten (r) i PF-RPMI.
  6. Utfør en celletall (Cellometer) og beregne volumet av cellesuspensjonen kreves (2 x 10 8 MNC).
  7. Overfør det beregnede volumet til et sterilt 50 ml sentrifugerør og spinn ved 200 xg i 10 min (ingen brems).
  8. Aspirer supernatanten slik at ingen rester media fortsatt og forsiktig re-suspendere ved å trykke side av røret.

3. Electroporation (Nucleofection) av MNC (Full Scale prosessen ved hjelp av 10 Kyvetter) på dag 0

  1. Pre-inkuber en steril 12-brønns plate med 10 brønner inneholdende 4 ml varm PF-RPMI i en fuktet 37 ° C / 5% CO 2 inkubator.
  2. Forbered og forvarme den Lonza Nucleofector Solution Human T cell kit (rekonstituert i henhold til produsentens instruksjoner, www.lonza.com ) til omgivelsestemperatur i et biosikkerhet Cabinet (BSC).
  3. Forbered Nucleofector løsning / DNA Master Mix ved tilleggsarbeidsbokg 100 ul supplert Nucleofector løsning, 15 pg av transposon (supercoil DNA plasmid betegnet som CD19RCD28/pSBSO) og 5 ug transposase (supercoil DNA plasmid betegnet som pCMV-SB11) per reaksjon / kyvetten.
  4. Disperse cellepelleten (fra trinn 2.8) ved å banke den siden av sentrifugerøret og resuspendere i Nucleofection løsning / DNA konsentrat-blanding (Endelig cellekonsentrasjon: 2 x 10 7 cells/100 ul).
  5. Nøye overføre 100 ul av cellesuspensjonen (fra trinn 3.4) til hver av ti (10) Lonza Nucleofection kyvetter, er forsiktig med å unngå bobler.
  6. Pek kyvetten gang, og ved hjelp av programmet electroporate U-014 (for ustimulert T-celler).
  7. Overfør kyvettene og 12-brønners plate (Trinn 3.1) til BSC.
  8. Høste electroporated cellene fra hver kyvette ved hjelp av en fin spiss Amaxa overføringspipetten, ved tilsetning ~ 500 ul av den forvarmede kulturmediet fra tilsvarende brønn (12-brønns plate fremstilt i Stes. 3,1) og returnere platen til en fuktet 37 ° C / 5% CO 2 inkubator i 2 timer ± 30 min.
  9. Etter 2-timers inkubering, innhøsting og overføre cellene fra alle brønner til et sterilt sentrifugerør.
  10. Vask cellene ved sentrifugering ved 140 xg i 8 min, omgivelsestemperatur, ingen brems og aspirere og kast supernatanten slik at ingen gjenværende mediet dekker cellepellet.
  11. Disperse cellepelleten ved å banke den siden av sentrifugerøret og forsiktig resuspendere i CCM å oppnå en enkel cellesuspensjon.
  12. Utfør celletall og justere celle konsentrasjonen til 10 6 celler / ml i CCM.
  13. Overføre cellesuspensjon til cellekultur kolbe (r) og plasser i inkubator over natten.
  14. Prosesstrinn 02.01 til 03.08 ble gjentatt for kontroll: EGFP-transfekterte celler (5 x 10 6 celler / kyvette med 5 mikrogram Amaxa kontroll EGFP supercoil plasmid, pmaxGFP).

Dag 1 av 1. og EtterfølgendeStimulering Cycles

4. Analyse av CAR Expression ved flowcytometri på dag 1

  1. Høste electroporated celler og utføre en celletall ved hjelp Trypan blå eksklusjon metoden (hemocytometer).
  2. Stain celler (1-2 x 10 6) med antistoff spesifikt for CD3, CD4, CD8, og humant IgG Fcγ (som et mål av CAR uttrykk).
  3. Erverve celler på FACS Calibur og analysere data ved hjelp av FCS Express programvare for å beregne uttrykk for CAR.
    1. Beregn bil + celler i kultur ved formelen:
      (Antall Totalt levedyktige celler) x (% CAR + celler) = Antall CAR +-celler

5. Fremstilling av AAPC (klone # 4) på ​​dag 1. AAPC (klone # 4) ble avledet fra K562 Cells (Parental Linje Innhentet fra American Type Culture Collection) til Co-express Ønsket T Cell Co-stimulerende Molecule

  1. Tine en delmengde av frosne 100 Gy bestrålt AAPC i en 37 °, C vannbad.
  2. Celler blir vasket to ganger ved sentrifugering ved 400 xg, 10 min i CCM og telles ved hjelp av Cellometer (Trypan blå eksklusjon).
  3. Beregn antall levedyktig AAPC kreves for stimulering:
    (Antall bil + celler) x 2 = Antall bestrålt AAPC nødvendig

6. AAPC-mediert Stimulering av CAR + T celler på dag 1 Begynnelsen av 1. og Påfølgende Stimulering Cycles

  1. Bland electroporated celler (uttrykker bil) og γ-bestrålt AAPC (klone # 4) i en steril beholder ved et forhold på 1:2 (CAR + celle: levedyktig AAPC) i CCM.
    1. Legg merke til AAPC forholdet er justert for uttrykket av bil basert på flowcytometri dagen etter electroporation.
  2. Legg IL-21 (30 ng / ml) til cellesuspensjonen.
  3. Aliquot i T-75 cm 2 kolbe (r) og / eller Vue Liv Kultur poser ved en konsentrasjon på 10 6 celler / ml og gå tilbake til incubateller.

Dager 3, 5

7. Fortsatt Culture of CAR + T celler

  1. Utføre en halv media endring, etterfylle IL-21, og opprettholde T-celler ved en konsentrasjon på 10 6 celler / ml.

Dag 7

8. Utgangen av første AAPC-mediert stimulering Cycle

  1. Høste celler, telle og beis for CD3, CD4, CD8 og Fcγ (CAR) og fortsett til trinn 10.1.

9. Nedbryting av CD56 + celler (vanligvis mellom 7 og 14 dager etter electroporation)

  1. Utføre en CD56 uttømming hjelp paramagnetiske perler hvis CD56 + CD3 neg lymfocytter ≥ 10%.

Stimulering Cycles # 2, # 3, og # 4 Tilsvarende til Days 8 → 14, dager 15 → 21, og dager 22 → 28

10. Rekursiv Tilsetting av AAPC å utbre T celler til Klinisk-tilstrekkelig antall

  1. Gjenta stimulation prosess (4 ganger), som beskrevet i trinn 4.3 til 8.1.
  2. Legg IL-2 (50U/ml) til kulturene begynner på dager 7, 14 og 21, og deretter på hver media endring (tre ganger i uken, på en mandag-onsdag-fredag ​​tidsplanen).
  3. Cryopreservere (arkiv) overflødig T-celler etter behov.
    1. T-celler frosset ved hjelp kontrollert fryser.

Dag 28

11. Slutten av forrige AAPC-mediert stimulering Cycle: Harvest T celler

  1. Cryopreservere T celler for frigjøring testing og infusjon.

Representative Results

Vi rapporterer at elektro-overføring av DNA plasmider og forplanting av T-celler på γ-bestrålt AAPC kan brukes til å generere klinisk tiltalende antall T-celler avledet fra PB og UCB for menneskelige applikasjoner. Disse genmodifiserte T-celler uttrykker en introdusert bil som gjenkjenner CD19 TAA, uavhengig av store histocompatibility kompleks. De SB-avledede DNA plasmider å uttrykke (i) transposon, en 2 nd generasjon CAR (CD19RCD28) at signaler gjennom CD28 og CD3-ε 14, og (ii) transposase, SB11 15, har tidligere blitt beskrevet 13, 16,17 . Plasmidene brukt i denne studien ble produsert kommersielt av Waisman Klinisk Biomanufacturing Facility (Madison, Wisconsin). Den AAPC (klone # 4), avledet fra K562 celler (foreldrenes linje oppnådd fra American Type Culture Collection), co-express ønsket T celle co-stimulerende molekyler (hver innført molekyl 3 90% på celleoverflaten av AAPC),som tidligere beskrevet 12. Her viser vi at CD19-spesifikke T-celler kan bli generert fra mononukleære celler (MNC) utledet fra PB eller UCB med SB transponering å introdusere CAR etterfulgt av tilsetning av AAPC til tallmessig utvide T-cellene i en bil-avhengig måte (Figur 1 , 4) 13,18. Ti kyvetter (2x10 7 MNC / kyvette) er electroporated for hver mottaker ved hjelp av 15 pg av DNA-plasmid (CD19RCD28/pSBSO) koder for transposon (CAR) og 5 ug DNA-plasmid (pCMV-SB11) koder for transposase (SB11). Antallet kyvetter kan reduseres dersom MNC er begrensende eller skalert tilbake for laboratoriearbeid. Dagen for electroporation er definert som "Dag 0" av stimulering syklus nr. 1. Som kontroller for flowcytometri og kultur forhold, autologe T-celler er mock electroporated (uten DNA plasmid) og numerisk utvidet på γ-bestrålt AAPC (klone # 4) som hadde vært pre-lastet med OKT3 å krysse-link CD3 å opprettholde T-celle spredning. Vi routinely vurdere effektiviteten av electrotransfer og levedyktigheten til de T-celler dagen etter elektroporering (figur 2B). Uttrykket av EGFP fra kontroll DNA plasmid (betegnet pmaxGFP) og bil på denne første tidspunkt gjenspeiler protein uttrykk fra den integrerte og episomal plasmid. Vanligvis, dagen etter electroporation måler vi EGFP uttrykk på ~ 60% og CAR uttrykk på ~ 40% (figur 2A) med T celleviabilitet mellom 40-50%. Rekursive tilsetninger av γ-bestrålt AAPC i nærvær av løselig rekombinant humant IL-2 og IL-21 hente T celler stabilt uttrykkende CAR (CD19RCD28). CD3 neg CD56 + NK celler utarmet fra kulturen ved hjelp av CD56-spesifikke paramagnetiske perler hvis prosentandelen av disse NK celler er ≥ 10% og spesielt hvis andelen av CAR uttrykt på T-celler er lav. Dette uttømming hindrer den raske overvekst av NK-celler som forstyrrer evnen til AAPC å opprettholde proliferation av CAR + T-celler. Noen ganger er uttømming av NK-celler fra CAR + T celler foretatt i løpet av de to siste stimulering sykluser, men dette introduserer et tap av ønskede celler på grunn av co-uttrykk for CD56 på noen CAR + T celler. T-cellene ble dyrket i et funksjonelt lukket system ved hjelp av Vue Livet kultur poser forbi Dag 14. Et delsett av genmodifiserte og spres T-celler er vanligvis fryses ned ved dag 14 eller dag 21 (slutten av Stimulering sykluser # 2 eller # 3) av co-kultur på AAPC å tjene som en kilde for arkivert materiale for fremtidige analyser og for å være tint hvis uforutsette problemer senere oppstår under produksjonsprosessen. T-celler er typisk høstes på eller omkring dag 28 av kultur (figur 3) som rutinemessig express> 90% CAR og er> 80% levedyktig (Figur 2C, D). Vi har tidligere vist at etter fire uker med co-kulturen på AAPC gjennomsnittlig fold-utvidelse av CD3 + T-celler er 19800 ± 11313 med CA R + uttrykk blir 90% ± 7,5 13. Disse T-cellene fryses ned og gjennomgår in-prosess og slipp testing som informerer om sikkerhet og terapeutiske potensialet i produsert produkt. År testing er gjennomført i samsvar med kliniske laboratorium forbedring endringer (CLIA) for å generere et sertifikat for analyse før infusjon i mottakere på kliniske studier.

Figur 1
Figur 1. Steps skisserte prosessen for å electroporate og spre CAR + T-celler fra PB og UCB. Klikk her for å se større figur .

upload/50070/50070fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg "/>
Figur 2. Karakterisering av genmodifiserte T-celler fra PB. (A) Ekspresjon av EGFP ved dag 0 av første stimulering syklus å vurdere effektiviteten av genoverføring. Uttrykk for CD19-spesifikk CAR (CD19RCD28) som vurderes av flowcytometri på CD3 +, CD8 + og CD4 + T celler ved (B) ca 24 timer etter electroporation og (C) 28 dager etter co-kultur på AAPC. Lignende uttrykk for CAR ble observert med UCB-deriverte T-celler. (D) Kinetics av CAR uttrykk. Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. Forplantning av PB-derived CAR+ T-celler. Valuta numeriske utvidelse av CD3 + og CAR + T-celler avledet fra PB ved gjentatt co-kultur på γ-bestrålt AAPC i nærvær av rekombinant humant løselig IL-2 og IL-21. Oppadgående piler indikerer tillegg av γ-bestrålt AAPC som markerer begynnelsen av hver stimulering syklus. UCB-derived CAR + T-celler viser lignende forekomst av numerisk ekspansjon.

Figur 4
Figur 4. Skjematisk av produksjonsprosessen ved hjelp av SB og AAPC systemer for å genetisk modifisere og spre CAR + T celler avledet fra PB og UCB. CD19-spesifikk bil + T celler ble generert av elektro-overføring av SB-avledet supercoil DNA plasmider og påfølgende co-kultur på K562-avledet AAPC (klone # 4) i nærvær of rekombinant humant løselig IL-2 og IL-21. Klikk her for å se større figur .

T-celle kilde Transposon * Transposase T-celle infusjon IRB # NIH-OBA # IND #
Autolog (pasient-derived) ** CD19RCD28 SB11 Etter autolog hematopoetisk stamcelletransplantasjon 2007-0635 0804-922 14193
Allogene (donor-avledet) CD19RCD28 SB11 Etter allogen hematopoietisk stamcelletransplantasjon 2009-0525 0910-1003
Allogene (donor-avledet) CD19RCD28 SB11 Etter allogen navlestreng blod transplantasjon 2010-0835 1001-1022 14739

* Tabell 1. Kliniske studier i regi av FDA på MDACC å sette CD19-spesifikk bil + T-celler dyrket på AAPC. T-celler er gjengitt spesifikke for CD19 gjennom tvungen uttrykk for SB transposon koder for et 2. generasjon CAR, utpekt CD19RCD28 at signaler gjennom CD28 og CD3-ε. ** Prøve beskrevet i referanseeksempel 5.

Discussion

Transposon og transposase systemer, for eksempel fra piggyBac 12,19 og SB 18,20-22, er ikke-virale tilnærminger til genterapi som er et alternativ til viral-mediert transduksjon av klinisk karakter CAR + T celler. SB ble valgt som genoverføring system basert på dens potensial for menneskelig genterapi 1,6,23. Vi utviklet den doble teknologier for SB transponering (å innføre en CAR) og rekursiv tillegg av γ-bestrålt AAPC (for å hente genmodifiserte T-celler stabilt uttrykker en CAR) til å tjene som plattform teknologier i produksjon av TAA-spesifikke T-celler i samsvar med cGMP for fase I / II-studier (figur 4). Etter 28 dager (fire 7-dagers stimulering sykluser) av co-kulturen på γ-bestrålt AAPC, er vi vanligvis i stand til å generere minst ~ 10 10 genmodifiserte T-celler egnet for menneskelig bruk. Etter behov, kan ytterligere stimulering sykluser foretas to generere større antall genmodifiserte T-celler. Videre, hvis mindre CAR + T-celler er nødvendig, kan tilnærmingen til elektroporering og forplantning skaleres tilbake ansette færre kyvetter og fremføring bare en sub-sett av de tallmessig ekspanderte T-cellene for påfølgende runder av proliferasjonen AAPC ved begynnelsen av hver Stimulering syklus. Flertallet av de electroporated og spres T-celler høstet for infusjon stabilt uttrykke CAR. Den utvekst av CD4 + og CD8 + T-celler som uttrykker vår 2 nd generasjon CAR har celler med et minne / naiv fenotype og viser tre kjennetegnene på re-regisserte spesifisitet. For det første, de genmodifiserte T-celler spesifikt lyse CD19 + mål, dernest produsere IFN-γ respons på CD19 + stimulator celler og for det tredje, spre svar på CD19 + mater celler, alt i en CAR-avhengig måte 13,18. Vår tilnærming til integrertspiste en CAR transgene av elektro-overføring av ikke-virale DNA plasmider fra SB-systemet kan foretas på hvilende primære T celler avledet fra PB og UCB. Vi og andre har genmodifiserte K562 celler for å tjene som AAPC å effektivt forplante klinisk tilstrekkelig antall av T-celler for infusjon 24,25. Den AAPC og vevskultur miljø (f.eks tilsetningen av IL-21) er blitt er blitt modifisert for å generere pasient-og giver-avledet CD19-spesifikke T-celler for infusjon etter hematopoetisk stamcelletransplantasjon (tabell 1) 13,18. Vi kan produsere CAR + T celler fra PB bare oppnås ved venepunksjon som unngår kostnadene, ubehag, og ulemper med å skaffe MNC fra PB ved aferese. Evnen å utlede et stort antall CAR + T celler fra et lite antall MNC er spesielt attraktivt for infusjonen T celler etter allogen UCB transplantasjon. Den lille størrelsen og anonymitet på neonatal donor utelukker re-Tilgang til dette individ ved en senere tidspunkt og kun begrensede antall slaktet MNC er tilgjengelig som utgangsmateriale for T celle produksjon å unngå å forstyrre hematopoiesis. Ytterligere fremskritt i produksjonsprosessen er for tiden i gang med å inkludere en høy gjennomstrømming electroporation enheten kombinert med en helt stengt WAVE bioreaktor for å minimere håndtering. Samlet, er SB og AAPC tiltalende plattformer for å generere CD19-spesifikk CAR + T-celler som kan tilpasses for å generere et stort antall genmodifiserte T-celler som kan gjenkjenne alternative celle-overflate TAA i samsvar med cGMP.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke dr. Carl juni (University of Pennsylvania) for å få hjelp generere og gi AAPC klone # 4 og Dr. Perry Hackett (University of Minnesota) for å få hjelp med SB-systemet.

Grant støtte: Cancer Center Kjerne Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); SPORE (CA136411); Albert J Ward Foundation; Burroughs Wellcome fondet, Gillson Longenbaugh Foundation; Cancer Prevention og Research Institute of Texas, CLL Global Research Foundation; Department of Defense, Estate of Noelan L. Bibler, Harry T. Mangurian, Jr, Fond for leukemi Immunterapi, Institute of Personalized Cancer Therapy, leukemi og lymfom Society, lymfom Research Foundation; MDACC søster Institution Network fondet, Miller Foundation; Mr. Herb Simons, Mr. og Mrs. Joe H. Scales, Mr. Thomas Scott, Utsmykkingsfondet for Cancer Research, Pediatric Cancer Research Foundation; Produksjon assistance for Cellular Terapi (PACT), William Lawrence og Blanche Hughes Barnas Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DNA plasmid expressing GFP (pmaxGFP) Lonza VPA-1002 (kit)
PBS Sigma D8537
CliniMACS PBS-EDTA Miltenyi Biotec 70026
HyQ RPMI-1640 Thermo Scientific SH30096.01
Phenol Free RPMI-1640 Thermo Scientific SH30605.01
Hyclone Fetal Bovine Serum Thermo Scientific SH3007003HI
GlutaMAX (100x) Gibco 3505-061
Ficoll-Paque GE Healthcare Biosciences 17-1440-02
Recombinant human IL-21 PeproTech AF-200-21
Recombinant human IL-2 (Proleukin) Novartis NDC 65483-116-07
Human T cell Kit (Nucleofector Solution) Lonza VPA-1002
CliniMACS CD56 Reagent Miltenyi 70206
FITC-conjugated to mouse mAb specific for human CD3 BD Biosciences 349201
APC-conjugated to mouse mAb specific for human CD4 BD Biosciences 340443
PerCPCy5.5-conjugated to mouse mAb specific for human CD8 BD Biosciences 341051
PE-conjugated to F(ab')2 fragment of goat antibody specific for human Fcγ Invitrogen H10104
Sodium Azide Sigma S2002
Disposables
12-well plate Corning 3513
T-75 cm2 flask Corning 430641
Culture bags Vue Life 290C; 750C
50 ml centrifuge tube BD Biosciences 352098
Equipment
Amaxa Nuceleofector II Lonza AAB-1001
Cellometer Nexcelom Bioscience Cellometer Vision
Sorvall Legend RT Centrifuge Sorvall 75004377
BD FACS Calibur BD Biosciences 342975
Controlled rate freezer Planer Kryo 750
Irradiator CIS bio International IBL-437 C#09433
Expression of Molecules (Endogenous and Introduced)
Cell Line Common Name Cell Type Molecules Expressed
CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 Clone 4 K562 CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP co-expressed with membrane bound IL-15

Complete Culture Media (CCM) (stored at 4 °C for up to 30 days)
HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640
10% FBS
1% GlutaMAX

Flow Cytometry Buffer (stored at 4 °C for up to 30 days)
PBS
2% FBS
0.1% Sodium Azide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor. Blood. 116, 1035-1044 (2010).
  2. Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held. Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).
  3. Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. CARs on track in the clinic. Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).
  4. Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy. Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).
  5. Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).
  6. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32, 756-767 (2010).
  7. Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies. Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).
  8. Williams, D. A. Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States. Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).
  9. Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes. Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).
  10. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
  11. Izsvak, Z., Ivics, Z. Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy. Mol Ther. 9, 147-156 (2004).
  12. Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).
  13. Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies. Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).
  14. Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).
  15. Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18, 849-856 (2011).
  16. Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).
  17. Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity. Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).
  18. Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).
  19. Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor. Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).
  20. Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases. Cancer Res. 72, 271-281 (2012).
  21. Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies. Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).
  22. Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes. Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).
  23. Hackett, P. B. Jr, Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies. Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).
  24. Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules. Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).
  25. Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells. Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).

Tags

Immunologi cellebiologi medisin Molecular Biology Cancer Biology Biomedical Engineering hematologi biokjemi genetikk T-lymfocytter antigenpresenterende celler leukemi Lymfoid lymfom Antigener CD19 Immunterapi Adoptive Electroporation Genetic Engineering Gene Therapy Tornerose CD19 T-celler Chimerisk Antigen Receptor Kunstige antigenpresenterende celler Clinical Trial perifert blod navlestrengsblod Nedfrysing Electroporation
Klinisk anvendelse av<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; Og kunstig antigenpresenterende celler å genmodifisere T celler fra perifert og navlestrengsblod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huls, M. H., Figliola, M. J.,… More

Huls, M. H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., Olivares, S., Kebriaei, P., Shpall, E. J., Champlin, R. E., Singh, H., Cooper, L. J. N. Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood. J. Vis. Exp. (72), e50070, doi:10.3791/50070 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter