Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Staphylococcus aureus Growth met humaan hemoglobine als een ijzerbron

doi: 10.3791/50072 Published: February 7, 2013

Summary

Hier beschrijven we een test voor groei

Abstract

S. aureus is een pathogene bacterie die vereist ijzer uitvoeren vitale metabole functies en ziekte veroorzaken. De meest voorkomende reservoir van ijzer in de menselijke gastheer is heem, de cofactor van hemoglobine. Om ijzer te nemen van hemoglobine, S. aureus maakt gebruik van een uitgebreid systeem dat bekend staat als het ijzer-gereguleerde oppervlak determinant (ISD)-systeem 1. Onderdelen van de Isd systeem eerst binden gastheer hemoglobine, dan halen en importeren heem, en tenslotte ijzer te bevrijden van heem in het bacteriële cytoplasma 2,3. Deze route is ontleed door tal van in vitro studies 4-9. Verder is de bijdrage van de ISD-systeem om infecties al herhaaldelijk aangetoond in muismodellen 8,10-14. Tot vaststelling van de bijdrage van de ISD-systeem aan hemoglobine-afgeleide ijzer acquisitie en de groei heeft bewezen meer uitdagend. Groei assays met hemoglobine als enige ijzerbron ingewikkeld by de instabiliteit van commercieel beschikbare hemoglobine, verontreinigende vrij ijzer in het groeimedium en toxiciteit van ijzerchelatoren. Hier wordt een methode die deze beperkingen overwinnen. Hoogwaardige hemoglobine wordt bereid uit vers bloed en opgeslagen in vloeibare stikstof. Gezuiverd hemoglobine wordt aangevuld in ijzer-afbrekende medium nabootsen van de ijzer-arme omgeving waarmee ziekteverwekkers in de gewervelde gastheer. Door honger S. aureus vrij ijzer en aangevuld met een minimaal gemanipuleerde vorm van hemoglobine we groei te induceren op een wijze die volledig afhankelijk is van het vermogen om hemoglobine binden, extract heem passeren heem door de bacteriële cel envelop en afgebroken heem in het cytoplasma. Deze test zal nuttig zijn voor onderzoekers die aan de mechanismen van hemoglobin-/heme-derived ijzer acquisitie toe te lichten in S. aureus en eventueel andere bacteriële pathogenen.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Zuivering van Hemoglobine van Fresh Blood

  1. De verwerving van nieuwe menselijk bloed aangevuld met een antistollingsmiddel. Houden bloed op ijs of bij 4 ° C gedurende de zuivering.
  2. Centrifugeer bloed gedurende 20 min bij 1500 x g. De rode bloedcellen (RBC's) zullen op de bodem van de buis. Zorgvuldig aspireren de supernatant en resuspendeer de pellet voorzichtig in ijskoude 0,9% (w / v) NaCl-oplossing. Centrifugeer nogmaals en was 3 keer.
  3. Resuspendeer de pellet in 1 volume ijskoude 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Dit zal tot lysis van de rode bloedcellen door osmotische druk. Toevoegen tolueen ~ 20% eindvolume.
  4. Incubeer bij 4 ° C op een rotisserie nacht.
  5. Centrifugeer het lysaat bij 20.000 xg gedurende 1 uur. Verzamel de middelste hemolysaat fractie verlaten van de tolueen (drijvend op de top) en pellet onaangeroerd. Gebruik lange hals pipet om de middenfractie verzamelen.
  6. Ga door 0,44 micrometer spuitfilter. Als de oplossing deeltjes bevatmaterie en niet door het filter Herhaal stap 1.5.
  7. Zuiver hemoglobine (Hb) met een high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) anionuitwisselingskolom (Varian, PL-SAX 1000 Å 8 um, 150 mm x 4,6 mm). De mobiele fase A 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) en mobiele fase B is 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. A 0% -100% gradiënt van solvent B wordt geleid over 2 minuten bij 2,0 ml / min debiet. De elutie wordt gecontroleerd op absorptie (λ: 410 nm en 280 nm). Verzamelen alleen de fractie gekenmerkt door een helderrode kleur en een prominente absorptiepiek (figuur 1).
  8. Dialyseer de elutie tegen fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende een nacht en vervolgens een paar uur weer. Steriliseer door passage door een 0,22 urn spuitfilter.
  9. Om Hb concentratie meten standaardformulieren Hb oplossingen met bekende concentraties in PBS. Bepaal de concentratie van Hb in het monster door het mengen van de standaardoplossingen (zie de tabel met reagentia onsed) of de monsteroplossing met reagens 2x Drabkin's (bereid uit poeder) in een verhouding van 1:1. Bijvoorbeeld mix 100 ul Hb oplossing reagens 100 ul 2x Drabkin's in 96-well platen. Incubeer gedurende 15 min en meet de absorptie bij 540 nm. Teken een standaardcurve en bepaal de Hb-gehalte in het monster. Vijf tot vijftien mg / ml opbrengsten kenmerkend.
  10. Run 15-20 ug gezuiverd hemoglobine op een 15% SDS-PAGE in tweevoud. Vlek een van de gels; dragen de eiwitten van andere gel op een nitrocellulosemembraan en immunoblot voor hemoglobine (figuur 2).
  11. Invriezen en opslaan 1 ml porties van hemoglobine in vloeibare stikstof.

2. Voorbereiding van Iron-afbrekende Groei Media

  1. Bereid Roswell Park Memorial Institute (RPMI) bouillon door oplossen van het poeder in RPMI water, voeg natriumbicarbonaat zoals aanbevolen door de fabrikant en 1% cassamino zuren (CA) (w / v). Steriliseer die door een 0,2 urn filter en opslag koelkastnereerd.
  2. Bereid metaal verarmde RPMI (NRPMI) door toevoeging van 7% (w / v) Chelex 100 en overnacht mengen op een roerplaat. Verwijderen Chelex 100 door passage door een 0,2 um filter en gekoeld bewaren. Supplement media met essentiële niet-ijzermetalen: 25 uM ZnCl2, 25 uM MnCl2, 100 mM CaCl2 en 1 mM MgCl2 voorbereid als een steriele 1000 x oplossing. Gebruik wegwerp plastic containers voor deze stap om ijzercontaminatie van herbruikbare supplies te voorkomen.

3. Staphylococcus aureus met hemoglobine als enige ijzerbron

  1. Streak S. aureus voor isolatie op tryptische soja-agar (TSA) van een bevroren voorraad. Incubeer bij 37 ° C gedurende 20-24 uur.
  2. Resuspendeer ethyleendiamine-N, N'-bis (2-hydroxyfenylazijnzuur) (EDDHA) in watervrije ethanol tot 100 mM. EDDHA niet in oplossing gaan, maar wordt gesteriliseerd door ethanol.
  3. Toevoegen EDDHA aan RPMI tot een eindconcentratie van 0,5 mM. ToelatenEDDHA te ontbinden gedurende ten minste 30 min alvorens de volgende stap. Door batch-to-batch variatie kan uiteindelijke concentratie EDDHA moeten worden verlaagd tot 0,25 mm om bacteriële groei mogelijk te maken.
  4. Inoculeer enkele kolonies van S. aureus in 5 ml RPMI met EDDHA in 15 ml schroefdop conische buizen. Incubeer bij 37 ° C onder schudden bij 180 omwentelingen per minuut (rpm) gedurende 16-20 uur.
  5. Centrifugeer het 's nachts culturen gedurende 5 min bij 7500 xg en resuspendeer de pellet in NRPMI die 0,5 mM EDDHA. Normaliseren OD 600 tot ~ 3.
  6. Bereid NRPMI die 2,5 ug per ml en 0,1-1,0 mM Hb EDDHA. Door variatie tussen de batches kan de EDDHA concentratie vereist om vrije ijzerchelaat in NRPMI variëren.
  7. Subcultuur 10 pi bacteriesuspensie uit stap 3.5 tot 1 ml NRPMI + + EDDHA Hb in een 15 ml met schroefdop conische buis.
  8. Incubeer de culturen bij 37 ° C gedurende 48 uur onder schudden bij 180 rpm of een rollende trommel.
  9. 600 metingen door verwijderen van 50 ul van de cultuur en mengen met 150 pi PBS in 96-well platen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

We hebben gezuiverd humaan hemoglobine uit hemolysaat met HPLC (Protocol stap 1.7). Figuur 1 toont opgenomen absorptie van het eluaat bij 280 en 410 nm golflengte. Fractie 5 werd verzameld en andere fracties werden weggegooid. Opbrengsten van vijf tot vijftien milligram per milliliter hemoglobine eluaat worden meestal verkregen. Gezuiverd hemoglobine werd geanalyseerd door SDS-PAGE in tweevoud werden de gelen ofwel gekleurd eiwitten of overgebracht op nitrocellulose en immunoblotting (Protocol stap 1,10, figuur 2).

Wij hebben het vermogen van gezuiverd humaan hemoglobine om de groei van wildtype S. ondersteunen aureus en S. aureus dat de ISDB component van de ISD-systeem (Δ ISDB) ontbreekt. ISDB is een hemoglobine receptor die nodig is voor hemoglobine afgeleide ijzer aankoop 12. Wildtype en Δ ISDB werden gekweekt in ijzer-arme medium aangevuld met menselijke hemog lobin (NRPMI + EDDHA + Hb) zoals beschreven in paragraaf 3 van het protocol. Indien gegroeid in NRPMI + + EDDHA Hb, wildtype maar niet Δ ISDB is kunnen voortplanten zoals aangegeven door een toename in optische dichtheid van de kweken in de tijd (Figuur 3A). Daarentegen de mogelijkheid aangevuld vrij ijzer (+ FeCl3) gebruiken is identiek in wild type en Δ ISDB (Figuur 3B). Noch wild type of Δ ISDB prolifereren in afwezigheid van een ijzerbron (Figuur 3B).

We hebben de groei van S. aureus in NRPMI + EDDHA aangevuld met hemoglobine gezuiverd uit het bloed verse of gevriesdroogde hemoglobine. Figuur 4 toont dat terwijl hemoglobine gezuiverd uit bloed heeft ISDB voor groei, proliferatie van gevriesdroogde hemoglobine Δ ISDB maakt.

s/ftp_upload/50072/50072fig1.jpg "/>
Figuur 1. Absorptie van de elutiefracties tijdens hemoglobine zuivering. Absorptie bij 410 nm (specifiek heem-bindende eiwitten) en 280 nm (karakteristiek voor alle eiwitten) werd gevolgd gedurende de elutie. Fractie nummer vijf bevat hemoglobine en werd verzameld.

Figuur 2
Figuur 2. Gezuiverd humaan hemoglobine Twintig microgram gezuiverd hemoglobine werd afgescheiden met denaturerende 15% SDS-PAGE. A. Gel gekleurd voor eiwitten met Bio-Rad eiwitbepaling kleurstof reagens. B. nitrocellulosemembraan immunoblotting voor hemoglobine. De intense onderste band is een hemoglobine monomeer, terwijl de meer zwakke bovenste bands zijn hemoglobine dimeren en tertramers, die niet te krijgen volledig gedenatureerde.

/ Ftp_upload/50072/50072fig3.jpg "/>
Figuur 3. Gebruik van menselijke hemoglobine als een ijzerbron door S. aureus A. Groei van wild type (wt) of isogene hemoglobine receptor ISDB mutant (Δ ISDB) in NRPMI aangevuld met ijzerchelator EDDHA en menselijke hemoglobine statistisch verschillend bepaald door Student's t tweezijdige test, p <0,05. B. Groei NRPMI aangevuld met 10 pM ijzerchloride (+ FeCl3) of EDDHA (-FeCl3) niet verschillend tussen wt en Δ ISDB. Grafieken tonen gegevens van een representatief experiment dat drie biologische repliceert opgenomen. Foutbalken geven de standaarddeviatie van optische dichtheid op aangegeven tijdstippen tussen de herhalingen.

Figuur 4
Figuur 4. De groei van wild type (wt) of isogene hemoglobine receptor mutant (Δ ISDB) in media aangevuld met hemoglobine gezuiverd uit vers bloed of gelyofiliseerde hemoglobine. De grafiek toont gegevens van een representatief experiment dat drie biologische repliceert opgenomen. De foutstaven geven de standaarddeviatie van optische dichtheid op aangegeven tijdstippen tussen de herhalingen. Asterisks geven waarden die statistisch verschillend bepaald door Student's t tweezijdige test, p <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

IJzer is een essentiële voedingsstof die door organismen van alle koninkrijken van het leven 15. In gewervelde dieren, is ijzer afgezonderd om toxiciteit veroorzaakt door dit element te voorkomen. Deze opslag verbergt ook ijzer van microben in een proces dat bekend staat als nutritionele immuniteit 16. In reactie hierop hebben ziekteverwekkers geëvolueerd strategieën die voedingswaarde immuniteit te omzeilen. Een dergelijk mechanisme is gebaseerd op hemoglobine, de meest voorkomende bron van ijzer in de gastheer 17. Hemoglobine is opgenomen in de rode bloedcellen. Hemoglobine vrijkomt uit beschadigde rode bloedcellen gebonden gastheer haptoglobine, waardoor een snelle verwijdering van haptoglobine-hemoglobine complexen door macrofagen 18 signaleert. Om toegang te krijgen tot hemoglobine, S. aureus drukt hemolysins dat lyseren rode bloedcellen 19. Haptoglobine-geïnduceerde verwijdering hemoglobine wordt tegengegaan door binding met hoge affiniteit van hemoglobine door het celoppervlakreceptoren uitgedrukt 20.

Talrijke studies hebben aangetoond dat de bijdrage van de RBD systeem om infecties 8,10-14. Verder hebben biochemische studies toegewezen van de functies van de afzonderlijke componenten van het hemoglobine-afgeleide ijzer acquisitie 4-9. Hier beschrijven we een test die de groei van S. bewaakt aureus met hemoglobine als de enige bron van beschikbare ijzer. In dit verband moeten wij erop wijzen dat bepaalde voorwaarden zijn cruciaal voor het succes van het experiment.

De kwaliteit en het type van de reagentia gebruikt in hemoglobine-afgeleide ijzer acquisitiegroei testen kunnen grote invloed hebben op de resultaten obtained in deze testen. In tegenstelling tot hemoglobine verkregen uit vers bloed, hemoglobine die is opgeslagen in gelyofiliseerde vorm kunnen bacteriële groei onafhankelijk van de componenten van het systeem Isd (figuur 4) 21. Dit komt waarschijnlijk door de veranderingen in de structuur van hemoglobine die worden geïnduceerd door lyophylization. Bijzonder gevriesdroogde hemoglobine tetrameren bevat, dimeren en monomeren van hemoglobine, en heem in zijn vrije vorm 22. Zuivering van hemoglobine uit vers bloed en het behoud ervan in vloeibare stikstof zorgen voor de integriteit van het eiwit 22. Uitgebreid onderzoek op hemoglobine heeft de ontwikkeling van protocollen voor de zuivering van hoge kwaliteit hemoglobine uit vers bloed of recombinante vorm, die kan worden gebruikt in onze assay 23-25.

De keuze van ijzerchelator kunnen de groei assay. Bijvoorbeeld 2,2-dipyridyl, die vaak wordt gebruikt als een ijzerchelator, giftigbacteriële cellen 26. Deze twee effecten maken het moeilijk om te onderscheiden of de remming van bacteriële groei door 2,2-dipyridyl is te wijten aan de ijzerchelatie of toxiciteit. Bovendien, 2,2-dipyridyl waarschijnlijk membraan permeabel en dus dringt de bacteriële celwand en chelaten ijzer intracellulair 27. We hebben gevonden dat groeiremming door EDDHA wordt omgekeerd door aanvulling van een ijzerbron, waardoor EDDHA een ijzerchelator geschikt voor bacteriële groei assays. Echter, de concentratie van EDDHA die moet worden toegevoegd aan het groeimedium variëren. Dit is het gevolg van variatie van zowel vermogen en EDDHA groeimedium ijzergehalte van partij tot partij. De ijzerchelaterende activiteit kan worden genormaliseerd tussen partijen EDDHA door chemisch verwijderen van residueel ijzer 28. Vanwege variatie tussen partijen RPMI, vonden we dat de uiteindelijke concentratie EDDHA toch ook nog moeten worden aangepast om groei mogelijk te maken in aanwezigheid van een ijzerbron. We vonden ebij de hoogste concentratie van EDDHA die permissief zijn voor de groei van wildtype S. aureus in aanwezigheid van hemoglobine is optimaal voor dit experiment.

Wijzigingen kunnen worden aangebracht aan de huidige protocol meer lijken de omgeving waarmee bacteriën tijdens infectie. Bijvoorbeeld, in de gastheer, heem dat vrijkomt uit hemoglobine snel gebonden hemopexin. Hemopexin kan niet worden gebruikt als een ijzerbron door S. aureus derhalve de toevoeging wordt voorkomen verkrijging van heem vrijkomt uit hemoglobine bij incubatie met S. aureus 12.

We vinden dat deze assay kan worden gebruikt voor onderzoek naar metal overname door een verscheidenheid van bacteriële pathogenen. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om ijzer aankoop meten van niet-hemoglobine bronnen van ijzer die aanwezig zijn in de gastheer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

We hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd ondersteund door US Public Health Service subsidies AI69233 en AI073843 van het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten. EPS is een Burroughs Wellcome Fellow in de pathogenese van infectieziekten. KPH werd gefinancierd door de Cellulaire en Moleculaire Microbiologie Training subsidie ​​Programma 5 T32 A107611-10.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC anion exchange column Varian PL1551-3802
Drabkin's reagent Sigma D5941-6VL
Hemoglobin standard Pointe Scientific H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 sodium form Sigma C7901
EDDHA LGC Standards GmbH ANC 001
Hemoglobin a antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc SC-21005
Tryptic soy agar BD 236920

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
  2. Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
  3. Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
  4. Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
  5. Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
  6. Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
  7. Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
  8. Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
  9. Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
  10. Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
  11. Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
  12. Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
  13. Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
  14. Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
  15. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  16. Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
  17. Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
  18. Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
  19. Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
  20. Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. (2011).
  21. Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
  22. Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).
  23. Williams, R. C. Jr, Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
  24. Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
  25. Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
  26. Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
  27. Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
  28. Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).
<em>Staphylococcus aureus</em> Growth met humaan hemoglobine als een ijzerbron
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pishchany, G., Haley, K. P., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source. J. Vis. Exp. (72), e50072, doi:10.3791/50072 (2013).More

Pishchany, G., Haley, K. P., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source. J. Vis. Exp. (72), e50072, doi:10.3791/50072 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter