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Immunology and Infection

Staphylococcus aureus Wachstum mit menschlichen Hämoglobins als Eisenquelle

Published: February 7, 2013 doi: 10.3791/50072
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, Vanderbilt University Medical School

Summary

Hier beschreiben wir ein Wachstum Assay für

Abstract

S. aureus ist ein Bakterium, das Eisen durchzuführen lebenswichtige Stoffwechselfunktionen und Krankheiten verursachen erfordert. Das häufigste Reservoir von Eisen im menschlichen Wirt Häm, das der Cofaktor von Hämoglobin ist. Eisen aus Hämoglobin erwerben, S. aureus nutzt ein ausgeklügeltes System, wie der Eisen-regulierten Oberfläche Determinante (Isd) System 1 bekannt. Komponenten des Isd System zuerst bind Host Hämoglobin, dann extrahieren und importieren Häm, und schließlich befreien Eisen aus Häm in dem bakteriellen Zytoplasma 2,3. Dieser Weg ist durch zahlreiche in-vitro-Studien 4-9 wurden seziert. Ferner hat der Beitrag des Isd-System auf eine Infektion immer wieder in Mausmodellen 8,10-14 demonstriert. Gründung der Beitrag des Isd System Hämoglobin-abgeleiteten Eisenaufnahme und das Wachstum hat sich als größere Herausforderung. Growth Assays mit Hämoglobin als einziger Eisenquelle kompliziert by die Instabilität von handelsüblichen Hämoglobin, kontaminierenden freiem Eisen im Nährmedium und Toxizität mit Eisenchelatoren verbunden. Hier präsentieren wir eine Methode, die diese Beschränkungen überwindet. Hochqualitative Hämoglobin wird aus frischem Blut hergestellt und in flüssigem Stickstoff gelagert. Gereinigtes Hämoglobin in ergänzt Eisen-Abbau Mediums imitiert die Eisen-armen Umgebung von Krankheitserregern in der Wirbeltier-Wirt gestoßen. Von hungernden S. aureus von freiem Eisen und Ergänzung mit einer minimal manipulierte Form von Hämoglobin zu induzieren wir Wachstum in einer Weise, die völlig abhängig von der Fähigkeit, Hämoglobin binden, zu extrahieren Häm, Häm passieren durch die bakterielle Zellwand und degradieren Häm im Zytoplasma ist. Dieser Test wird für Forscher, die die Mechanismen der hemoglobin-/heme-derived Eisenaufnahme in S. aufzuklären nützlich aureus und möglicherweise auch andere bakterielle Erreger.

Protocol

Ein. Reinigung von Hämoglobin aus frischem Blut

  1. Erwerben frisches menschliches Blut mit einem Antikoagulans ergänzt. Halten Sie Blut auf Eis oder bei 4 ° C während der Reinigung.
  2. Zentrifuge Blut für 20 min bei 1.500 x g beträgt. Die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) wird am Boden der Röhre liegen. Vorsichtig den Überstand aspirieren und sanft das Pellet in eiskaltem 0,9% (w / v) NaCl-Lösung. Wiederholen Sie die Zentrifugation und 3 x waschen.
  3. Das Pellet in 1 Volumen eiskaltem 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Dies induziert die Lyse der Erythrozyten durch osmotischen Druck. Fügen Toluol zu ~ 20% Endvolumen.
  4. Inkubation bei 4 ° C auf einem Drehspieß Nacht.
  5. Zentrifuge das Lysat bei 20.000 xg für 1 Stunde. Sammeln Sie die Mitte Hämolysat Bruchteil Verlassen des Toluol (floating on top) und Pellet unberührt. Verwenden Sie einen Langhals-Pipette auf die mittlere Fraktion zu sammeln.
  6. Fahren Sie durch 0,44 um Spritzenfilter. Enthält die Lösung teilchenförmigenMaterie und nicht durch das Filter geleitet werden, Schritt 1.5.
  7. Läutern Hämoglobin (Hb) mit einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) Anionenaustauschersäule (Varian, PL-SAX 1.000 Å 8 um, 150 mm × 4,6 mm). Die mobile Phase A ist 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und die mobile Phase B ist 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. A 0% -100% Gradienten von Lösungsmittel B ist über 2 min bei 2,0 ml / min Flussrate laufen. Die Elution wird basierend auf Absorption überwacht (λ: 410 nm und 280 nm). Sammeln nur den Bruch durch eine leuchtend rote Farbe und ein prominenter Absorptionspeak (Abbildung 1).
  8. Dialysieren die Elution gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) über Nacht und dann für einige Stunden wieder. Sterilisieren, indem sie durch eine 0,22 um Spritzenfilter.
  9. Um Hb-Konzentration zu messen, bereiten Standard-Hb-Lösungen bekannter Konzentrationen in PBS. Bestimmung der Konzentration von Hb in der Probe durch Mischen der Standard-Lösungen (siehe Tabelle mit den Reagenzien unsed) oder die Probenlösung mit 2x Drabkin-Reagenz (hergestellt aus Pulver) im Verhältnis 1:1. Beispielsweise mischen 100 ul Hb-Lösung mit 2x 100 ul Drabkin-Reagenz in 96-Well-Platten. Inkubieren für 15 min und Messung der Extinktion bei 540 nm. Plotten einer Standardkurve und bestimmen die Hb-Konzentration in der Probe. Fünf bis fünfzehn mg / ml Erträge sind typisch.
  10. Führen 15-20 ug gereinigtes Hämoglobin auf einem 15% SDS-PAGE in zweifacher Ausfertigung. Flecken eines der Gele; übertragen die Proteine ​​aus einem anderen Gel auf eine Nitrocellulosemembran und Immunoblot für Hämoglobin (Abbildung 2).
  11. Einfrieren und lagern 1 ml Aliquots von Hämoglobin in flüssigem Stickstoff.

2. Herstellung von Eisen-Abbau Growth Media

  1. Planen Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Brühe durch Auflösen des Pulvers in RPMI Wasser, fügt Natriumhydrogencarbonat, wie vom Hersteller und 1% cassamino Säuren (CA) (w / v) empfohlen. Sterilisieren, indem sie durch einen 0,2 um Filter und Speicher refrigerated.
  2. Planen Metall abgereicherten RPMI (NRPMI) durch Zugabe von 7% (w / v) Chelex 100 und Mischen über Nacht auf einer Rührplatte. Entfernen Chelex 100, indem sie durch einen 0,2 um Filter und gekühlt. Zuschlag Medien mit wesentlichen Nicht-Eisen-Metalle: 25 uM ZnCl 2, 25 uM MnCl 2, 100 mM CaCl 2 und 1 mM MgCl 2 im Voraus als sterile 1.000 x Lösung hergestellt. Verwenden Sie Einweg-Kunststoff-Behältern für diesen Schritt, um Eisen Kontamination von wieder verwendbaren Lieferengpässe zu vermeiden.

3. Staphylococcus aureus Wachstum mit Hämoglobin als einziger Eisenquelle

  1. Streak S. aureus zur Isolierung von tryptischen Soja-Agar (TSA) aus einem gefrorenen Lager. Bei 37 ° C für 20-24 Stunden.
  2. Resuspendieren Ethylendiamin-N, N'-Bis (2-hydroxyphenylessigsäure) (EDDHA) in wasserfreiem Ethanol zu 100 mM. EDDHA nicht in Lösung gehen, aber durch Ethanol sterilisiert.
  3. Hinzufügen EDDHA zu RPMI bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM. ErlaubenEDDHA für mindestens 30 min, bevor zum nächsten Schritt aufzulösen. Aufgrund von Charge zu Charge Variation kann endgültigen EDDHA Konzentration müssen bis 0,25 mM abgesenkt werden, um das Bakterienwachstum zu ermöglichen.
  4. Beimpfen einzelne Kolonien von S. aureus in 5 ml RPMI mit EDDHA in 15 ml mit Schraubverschluss konische Röhrchen. Bei 37 ° C unter Schütteln mit 180 Umdrehungen pro Minute (rpm) für 16-20 Stunden.
  5. Zentrifugieren Sie die Übernacht-Kulturen für 5 min bei 7.500 xg und das Pellet in NRPMI mit 0,5 mM EDDHA. Normalisieren OD 600 bis ~ 3.
  6. Bereiten NRPMI mit 2,5 ug pro ml Hb und 0,1-1,0 mM EDDHA. Durch Variation zwischen den Losen kann die EDDHA Konzentration erforderlich, um freies Eisen in NRPMI Chelat variieren.
  7. Subculture 10 ul der Bakteriensuspension von Schritt 3,5 in 1 ml NRPMI + EDDHA + Hb in einem 15 ml mit Schraubverschluss konischen Rohr.
  8. Inkubieren der Kulturen bei 37 ° C für bis zu 48 Stunden unter Schütteln bei 180 UpM oder einer Rolltrommel.
    9. 600 Lesungen, indem 50 ul der Kultur und Mischen mit 150 ul PBS in 96-Well-Platten.

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Representative Results

Wir haben gereinigtes humanes Hämoglobin aus Hämolysat mit HPLC (Protocol Schritt 1,7). Abbildung 1 zeigt aufgezeichnete Absorption des Eluats bei 280 und 410 nm Wellenlänge. Fraktion 5 wurde gesammelt und anderen Fraktionen wurden verworfen. Ausbeuten von fünf bis fünfzehn Milligramm Hämoglobin pro Milliliter des Eluats werden typischerweise erworben. Gereinigtes Hämoglobin wurde durch SDS-PAGE analysiert und in doppelter Ausführung wurden die Gele entweder für Proteine ​​gefärbt oder auf Nitrocellulose transferiert und Immunoblotting (Protokoll Schritt 1.10, Abbildung 2).

Wir haben die Fähigkeit von gereinigtem menschlichem Hämoglobin, das Wachstum von Wildtyp unterstützt beurteilt S. aureus und S. aureus, die ISDB Bestandteil des Isd System (Δ ISDB) fehlt. ISDB ist ein Hämoglobin-Rezeptor, der für Hämoglobin-derived Eisenaufnahme 12 erforderlich ist. Wildtyp und Δ ISDB wurden in Eisen-abgereicherte Medium mit menschlichen hemog ergänzt gewachsen Lobin (NRPMI + EDDHA + Hb) wie in Abschnitt 3 des Protokolls beschrieben. Wenn in NRPMI + + Hb EDDHA, Wildtyp, aber nicht gewachsen Δ ISDB kann proliferieren, wie durch einen Anstieg der optischen Dichte der Kulturen mit der Zeit (Abbildung 3A). Im Gegensatz dazu ist die Fähigkeit, ergänzt freiem Eisen (+ FeCl 3) nutzen identisch in Wildtyp und Δ ISDB (Abbildung 3B). Weder Wildtyp noch Δ ISDB vermehren sich in Ermangelung einer Eisenquelle (3B).

Wir haben das Wachstum von S. im Vergleich aureus in NRPMI + EDDHA mit Hämoglobin aus dem frischen Blut oder lyophilisierte Hämoglobin gereinigt ergänzt. Abbildung 4 zeigt, dass während Hämoglobin aus Blut gereinigt erfordert ISDB für Wachstum, lyophilisierte Hämoglobin Verbreitung von Δ ISDB ermöglicht.

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Abbildung 1. Absorption der Elutionsfraktionen bei Reinigung Hämoglobin. Absorption bei 410 nm (spezifisch für Häm-bindende Proteine) und 280 nm (Merkmal für alle Proteine) wurde während der Elution verfolgt. Fraction Nummer fünf enthalten Hämoglobin und gesammelt wurde.

Abbildung 2
Abbildung 2. Gereinigtes menschliches Hämoglobin Zwanzig Mikrogramm gereinigtes Hämoglobin wurde unter Verwendung denaturierenden 15% SDS-PAGE. A. Gel für Proteine ​​mit Bio-Rad Protein Assay Farbstoffreagens gefärbt. B. Nitrocellulose Membran immunogeblottet für Hämoglobin. Die intensive untere Band ist ein Hämoglobin-Monomer, während die eher schwachen oberen Bänder Hämoglobin-Dimere und tertramers, die nicht bekommen vollständig denaturiert sind.

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Abbildung 3. Verwendung von menschlichem Hämoglobin als Eisenquelle von S. aureus A. Wachstum von Wildtyp (wt) oder isogenen Hämoglobin-Rezeptors ISDB-Mutante (Δ ISDB) in NRPMI mit Eisenchelatbildner EDDHA und menschliches Hämoglobin ergänzt ist statistisch anders als durch den Student-two-tailed t-Test, p <0,05 festgelegt. B. Wachstum in NRPMI mit 10 pM Eisenchlorid (FeCl 3 +) oder EDDHA ergänzt (-FeCl 3) unterscheidet sich nicht zwischen wt und Δ ISDB. Graphen zeigen Daten aus einem repräsentativen Experiment, das drei biologische repliziert enthalten. Fehlerbalken bezeichnen Standardabweichung der optischen Dichte Lesungen zum angegebenen Zeitpunkten zwischen dem repliziert.

Abbildung 4
Abbildung 4. Wachstum von Wildtyp (wt) oder isogenen Hämoglobin-Rezeptors mutant (Δ ISDB) in Medien mit Hämoglobin aus frischem Blut oder lyophilisiertes gereinigtes Hämoglobin ergänzt. Das Diagramm zeigt Daten aus einem repräsentativen Experiment, das drei biologische repliziert enthalten. Die Fehlerbalken repräsentieren Standardabweichungen Extinktionsmessungen zum angegebenen Zeitpunkten zwischen dem repliziert. Sternchen bezeichnen Werte, die statistisch anders als durch den Student-two-tailed t-Test, p <0,05 festgelegt sind.

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Discussion

Eisen ist ein wichtiger Nährstoff, die durch Organismen aus allen Reichen des Lebens 15 erforderlich. Bei Wirbeltieren wird Eisen sequestriert, um die Toxizität von diesem Element zu vermeiden. Diese Sequestrierung birgt auch Eisen aus eindringende Mikroben in einem Prozess als Nahrungsergänzungsmittel Immunität 16 bekannt. In Reaktion darauf haben die Erreger Strategien, Ernährung Immunität zu umgehen entwickelt. Ein solcher Mechanismus beruht auf Hämoglobin, das ist der häufigste Quelle von Eisen innerhalb der Host 17. Hämoglobin in den roten Blutkörperchen enthalten. Hämoglobin von beschädigten roten Blutkörperchen freigesetzt wird vom Host Haptoglobin, die schnelle Beseitigung von Haptoglobin-Hämoglobin-Komplexe von Makrophagen 18 signalisiert gebunden. Um den Zugang zu Hämoglobin zu erhalten, S. aureus drückt Hämolysine, die roten Blutkörperchen zu lysieren 19. Haptoglobin-induzierten Hämoglobin Entfernung durch hochaffine Bindung von Hämoglobin durch die Zelloberflächen-Rezeptoren exprimiert durch entgegengewirkt 20.

Zahlreiche Studien haben den Beitrag des Isd-System auf eine Infektion 8,10-14 demonstriert. Ferner haben biochemische Untersuchungen die Funktionen der einzelnen Komponenten in Hämoglobin-abgeleiteten Eisenaufnahme 4-9 zugeordnet. Hier beschreiben wir einen Assay, der das Wachstum von S. überwacht aureus mit Hämoglobin als einzige Quelle von verfügbarem Eisen. In diesem Zusammenhang müssen wir darauf hinweisen, bestimmte Bedingungen, die von zentraler Bedeutung für den Erfolg des Experiments sind.

Die Qualität und Art der Reagenzien in Hämoglobin-derived Eisenaufnahme Wachstums-Assays verwendet werden können dramatisch beeinflussen die Ergebnisse obtained in diesen Assays. Im Gegensatz zu Hämoglobin aus frischem Blut, Hämoglobin, die in lyophilisierter Form ermöglicht Bakterienwachstum unabhängig von den Komponenten des Isd System (Abb. 4) 21 gespeichert ist, erhalten wird. Dies ist wahrscheinlich auf die Veränderungen in der Struktur des Hämoglobins, die durch Lyophilisierung induziert werden. Insbesondere enthält lyophilisierten Hämoglobintetrameren, Dimere und Monomere von Hämoglobin sowie Häm in seiner freien Form 22. Aufreinigung von Hämoglobin aus frischem Blut und seine Konservierung in flüssigem Stickstoff zu gewährleisten Integrität des Proteins 22. Umfangreiche Forschungen auf Hämoglobin hat die Entwicklung von Protokollen für die Reinigung von hochwertigen Hämoglobin aus frischem Blut oder in rekombinanter Form, die in unserem Assay 23-25 ​​verwendet werden kann erleichtert.

Die Wahl des Eisenchelatbildner beeinträchtigen das Wachstum Assay. Beispielsweise ist 2,2-Dipyridyl, die häufig als ein Eisenchelatbildner verwendet wird, toxischebakterielle Zellen 26. Diese beiden Effekte machen es schwer zu erkennen, ob die Hemmung der bakteriellen Wachstum von 2,2-Dipyridyl ist aufgrund Eisenchelation oder Toxizität. Außerdem ist 2,2-Dipyridyl wahrscheinlich Membran durchlässig zu sein, und somit dringt in die Bakterienzelle und Chelate Eisen intrazellulär 27. Wir haben gefunden, dass Wachstumshemmung durch EDDHA durch Supplementierung einer Eisenquelle umgekehrt wird, so dass ein geeigneteres EDDHA Eisenchelatbildner für Bakterienwachstum Assays. Jedoch kann die Konzentration von EDDHA, die dem Wachstumsmedium hinzugefügt werden muss variieren. Dies ist aufgrund der Variation von sowohl EDDHA Potenz und Wachstumsmedium Eisengehalt von Charge zu Charge. Die Eisenchelatbildner Aktivität kann zwischen verschiedenen Chargen von EDDHA durch chemisch Entfernen Resteisen 28 normiert werden. Jedoch aufgrund einer Variation zwischen Chargen von RPMI, fanden wir, dass die endgültige Konzentration kann EDDHA müssen noch eingestellt werden, um das Wachstum in Anwesenheit eines Eisen-Quelle zu ermöglichen. Wir fanden thbei der höchsten Konzentration von EDDHA die permissive für das Wachstum von Wildtyp S. aureus in Gegenwart von Hämoglobin ist optimal für dieses Experiment.

Änderungen können mit dem derzeitigen Protokoll vorgenommen werden, um stärker die Umwelt durch Bakterien während der Infektion auftreten ähneln. Beispielsweise innerhalb des Wirts wird Häm, das aus Hämoglobin freigesetzt wird schnell durch Hämopexin gebunden. Hemopexin kann nicht als eine Eisenquelle durch S. verwendet werden aureus, daher der Zusatz würde verhindern, Erwerb von Häm aus Hämoglobin während der Inkubation mit S. veröffentlicht aureus 12.

Wir glauben, dass dieser Assay für die Erforschung Metall Übernahme kann durch eine Vielzahl von bakteriellen Pathogenen verwendet werden. Ferner kann dieses Verfahren verwendet werden, um Eisen Akquisition von Nicht-Hämoglobin Eisenquellen, die vorhanden sind in dem Wirt zu messen.

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Disclosures

Wir haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der US Public Health Service Zuschüsse AI69233 und AI073843 aus dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases unterstützt. EPS ist ein Burroughs Wellcome Fellow in der Pathogenese von Infektionskrankheiten. KPH wurde von der Cellular and Molecular Microbiology Training Grant Program 5 T32 A107611-10 finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC anion exchange column Varian PL1551-3802
Drabkin's reagent Sigma D5941-6VL
Hemoglobin standard Pointe Scientific H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 sodium form Sigma C7901
EDDHA LGC Standards GmbH ANC 001
Hemoglobin a antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc SC-21005
Tryptic soy agar BD 236920

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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