Summary
Descrevemos aqui um ensaio de crescimento de
Abstract
S. aureus é uma bactéria patogênica que requer ferro para realizar funções vitais metabólicas e causam doenças. O reservatório mais abundante de ferro no interior do hospedeiro humano é heme, que é o cofactor da hemoglobina. Para adquirir ferro da hemoglobina, S. aureus utiliza um elaborado sistema conhecido como o determinante superfície de ferro-regulado (DSI) do sistema 1. Componentes da hemoglobina Isd sistema host primeiro ligar, em seguida, extrair e importar heme, e, finalmente, libertar ferro de heme no citoplasma bacteriano 2,3. Este caminho tem sido dissecado através de numerosos estudos in vitro 4-9. Além disso, a contribuição do sistema Isd a infecção tem sido repetidamente demonstrado em modelos de ratos 8,10-14. Que institui a contribuição do sistema Isd à hemoglobina derivada de aquisição de ferro e de crescimento tem se mostrado mais desafiador. Ensaios de crescimento utilizando hemoglobina como fonte única de ferro é complicada by a instabilidade da hemoglobina disponível comercialmente, contaminando ferro livre no meio de crescimento, e a toxicidade associada com quelantes de ferro. Aqui apresentamos um método que supera estas limitações. Hemoglobina de alta qualidade é preparado a partir de sangue fresco e armazenado em azoto líquido. Hemoglobina purificada é complementada em ferro-esgotar meio imitando o ambiente pobre em ferro encontrado por agentes patogénicos no interior do hospedeiro vertebrado. Pela fome S. aureus de ferro livre e completando com uma forma minimamente manipuladas de hemoglobina que induzem o crescimento de uma maneira que é totalmente dependente da capacidade de se ligar a hemoglobina, extrair heme, heme passar através do envelope celular bacteriana e degradar heme no citoplasma. Este ensaio será útil para pesquisadores que procuram elucidar os mecanismos de aquisição de ferro em S. hemoglobin-/heme-derived aureus e, eventualmente, outros agentes patogénicos bacterianos.
Protocol
1. Purificação da hemoglobina a partir de sangue fresco
- Adquirir sangue humano fresco suplementado com um anticoagulante. Manter o sangue em gelo ou a 4 ° C durante a purificação.
- Centrifugar o sangue durante 20 minutos a 1500 x g. As células vermelhas do sangue (RBC) irá ficar na parte inferior do tubo. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet cuidadosamente em solução gelada de NaCl a 0,9% (w / v). Voltar a centrifugar e lavar 3 vezes.
- Ressuspender o sedimento em 1 volume de mM arrefecido com gelo 10 Tris-HCl (pH 8,0). Isto irá induzir a lise dos glóbulos vermelhos devido à pressão osmótica. Adicionar tolueno a ~ 20% do volume final.
- Incubar a 4 ° C durante a noite em um espeto.
- Centrifuga-se o lisado a 20.000 xg durante 1 hora. Recolher a fracção hemolisado meio deixam os tolueno (flutuante no topo) e pellet. Usar uma pipeta de gargalo longo de recolher a fracção do meio.
- Passar através de filtro de seringa de 0,44 | im. Se a solução contiver partículasmatéria e não pode ser passada através do filtro, repetir o passo 1.5.
- Purificar a hemoglobina (Hb) com uma cromatografia líquida de alta performance (HPLC) em coluna de permuta aniónica (Varian, PL-SAX 1000 por 8 um, 150 mm x 4,6 mm). A fase móvel A é 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) e a fase móvel B é 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M de NaCl. Um gradiente de 0% -100% de solvente B é administrado ao longo de 2 min a taxa de fluxo de 2,0 ml / min. A eluição é controlada com base na absorção (λ: 410 nm e 280 nm). Recolher apenas a fracção caracterizada por uma cor vermelho brilhante e um pico de absorção proeminente (Figura 1).
- Dialisar a eluição contra salino tamponado com fosfato (PBS) durante a noite e, em seguida, por algumas horas, de novo. Esterilizar por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 um.
- Para medir a concentração de Hb, preparar soluções-padrão de concentrações conhecidas de hemoglobina em PBS. Determinar a concentração de Hb no exemplo por mistura das soluções-padrão (ver a tabela com reagentes nosed) ou da solução de amostra com o reagente de Drabkin 2x (preparada a partir de pó), a uma proporção de 1:1. Por exemplo, misturar 100 ul de solução de Hb com o reagente de Drabkin 100 ul de 2x, em placas de 96 poços. Incubar durante 15 min e a absorvância medida a 540 nm. Desenhar uma curva padrão e determinar a concentração de Hb na amostra. Cinco a 15 mg / ml rendimentos são típicos.
- Executar 15-20 ug purificado hemoglobina em 15% SDS-PAGE em duplicado. Stain um dos géis; transferir as proteínas a partir de um outro gel para uma membrana de nitrocelulose e imunotransf erência para a hemoglobina (Figura 2).
- Congelar e armazenar alíquotas de 1 ml de hemoglobina em azoto líquido.
2. Preparação de Ferro-empobrecem meios de crescimento
- Prepare Roswell Park Memorial Institute (RPMI) caldo por dissolução do pó de RPMI em água, adicionar bicarbonato de sódio, tal como recomendado pelo fabricante, e 1% de ácidos cassamino (CA) (w / v). Esterilizar por passagem através de um filtro de 0,2 um e refrig lojarado.
- Prepare-metal empobrecido RPMI (NRPMI) pela adição de 7% (w / v) Chelex 100 e misturando durante a noite numa placa de agitação. Remover Chelex 100, passando através de um filtro de 0,2 um e armazenamento refrigerado. Suplemento meios essenciais com metais não-ferrosos: 25 fiM de ZnCl2, 25 mM de MnCl2, 100 mM de CaCl2 e 1 mM de MgCl2 preparado antecipadamente como uma solução estéril x 1000. Use recipientes de plástico descartáveis para esta etapa para evitar a contaminação de ferro a partir de re-utilizáveis suprimentos.
3. Crescimento Staphylococcus aureus utilizando hemoglobina como uma fonte de ferro Sole
- Streak S. aureus para isolamento em agar de soja tríptica (TSA) a partir de um estoque congelado. Incubar a 37 ° C durante 20-24 hr.
- Ressuspender o ácido etilenodiamino-N, N'-bis (ácido 2-hidroxifenilacético) (EDDHA) em etanol anidro a 100 mM. EDDHA não entra em solução, mas é esterilizada por etanol.
- Adicionar EDDHA de RPMI a uma concentração final de 0,5 mM. PermitirEDDHA para dissolver, pelo menos, 30 minutos antes de prosseguir para o passo seguinte. Devido ao lote-a-lote de variação, a concentração final de EDDHA pode precisar de ser reduzidos para 0,25 mM para permitir o crescimento bacteriano.
- Inocular colónias isoladas de S. aureus em 5 ml de meio RPMI contendo EDDHA em 15 ml com tampa de rosca tubos cónicos. Incubar a 37 ° C com agitação a 180 rotações por minuto (rpm) durante 16-20 horas.
- Centrifugar as culturas durante a noite para 5 min a 7500 xg e ressuspender o sedimento em NRPMI contendo 0,5 mM de EDDHA. Normalizar a OD 600 ~ 3.
- Prepare NRPMI contendo 2,5 ug por ml de Hb e 0,1-1,0 mM EDDHA. Devido a variação entre os lotes, a concentração necessária EDDHA de quelação de ferro livre no NRPMI pode variar.
- Ul subcultura 10 de suspensão bacteriana a partir do passo 3,5 em 1 ml NRPMI + + EDDHA Hb num tubo de 15 ml com tampa de rosca cónica.
- Incubar as culturas a 37 ° C durante até 48 horas com agitação a 180 rpm ou num tambor giratório.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temos hemoglobina humana purificada a partir de hemolisado com HPLC (Protocolo passo 1.7). Figura 1 mostra registada a absorvância do eluato a 280 e 410 nm, comprimentos de onda. Fracção 5 foi recolhido e outras fracções foram descartados. Os rendimentos de 5-15 miligramas de hemoglobina por mililitro de fluido são normalmente adquiridas. Hemoglobina purificada foi analisada por SDS-PAGE em duplicado e os géis foram corados quer para as proteínas ou transferidas para nitrocelulose e imunotrans (Protocolo de passo de 1,10, Figura 2).
Avaliou-se a capacidade de hemoglobina humana purificada para suportar o crescimento de tipo selvagem de S. aureus e S. aureus que não possui o componente do sistema ISDB Isd (Δ ISDB). ISDB é um receptor de hemoglobina que é necessária para a hemoglobina derivada de aquisição de ferro 12. Tipo selvagem e Δ ISDB foram cultivadas em meio destituído de ferro enriquecido com hemog humano Lobin (NRPMI + + EDDHA Hb), como descrito na seção 3 do protocolo. Quando cultivado em NRPMI + + EDDHA Hb, de tipo selvagem, mas não Δ ISDB é capaz de proliferar como indicado por um aumento na densidade óptica das culturas ao longo do tempo (Figura 3A). Em contraste, a capacidade de utilizar o ferro livre suplementado (+ FeCl 3) é idêntica no tipo selvagem e ISDB Δ (Figura 3B). Nem o tipo selvagem nem Δ ISDB proliferar na ausência de uma fonte de ferro (Figura 3B).
Nós comparamos o crescimento de S. aureus em NRPMI + EDDHA suplementado com hemoglobina purificada a partir do sangue fresco ou hemoglobina liofilizada. Figura 4 ilustra que enquanto a hemoglobina purificada a partir de sangue requer ISDB para o crescimento, a hemoglobina liofilizada permite a proliferação de Δ ISDB.
s/ftp_upload/50072/50072fig1.jpg "/>
Figura 1. Absorção das fracções de eluição durante a purificação da hemoglobina. Absorção a 410 nm (específico para proteínas de ligação a heme) e 280 nm (característica de todas as proteínas) foi monitorizada ao longo da eluição. Número fracionário cinco continha hemoglobina e foi recolhida.
Figura 2. Hemoglobina humana purificada Vinte microgramas de hemoglobina purificada foi separada através de desnaturação de 15% SDS-PAGE. A. Gel corado para proteínas Bio-Rad com o reagente corante da proteína de ensaio. B. membrana de nitrocelulose imunotrans para hemoglobina. A banda intensa inferior é um monómero de hemoglobina, enquanto que as bandas mais fracas superiores são dímeros de hemoglobina e tertramers, que não fica completamente desnaturada.
/ Ftp_upload/50072/50072fig3.jpg "/>
Figura 3. Utilização de hemoglobina humana como uma fonte de ferro por S. A. aureus Crescimento de tipo selvagem (wt) ou isogénica hemoglobina mutante receptor ISDB (Δ ISDB) em NRPMI suplementado com ferro quelante EDDHA e hemoglobina humana é estatisticamente diferente, tal como determinado pelo teste t de Student bicaudal, p <0,05. B. Crescimento em NRPMI suplementado com 10 ^ M de cloreto de ferro (FeCl 3 +) ou EDDHA (-FeCl 3) não é diferente entre o peso e ISDB Δ. Graphs representar os dados de um experimento representativo, que incluíram três repetições biológica. As barras de erro indicam o desvio padrão das leituras da densidade óptica em pontos de tempo indicados entre as réplicas.
Figura 4. Crescimento de tipo selvagem (wt) ou m receptor isogénica hemoglobinautant (Δ ISDB) em meio suplementado com hemoglobina purificada a partir de sangue fresco ou hemoglobina liofilizada. O gráfico mostra os dados de uma experiência representativa, que inclui três repetições biológica. As barras de erro representam o desvio padrão das leituras da densidade óptica em pontos de tempo indicados entre as réplicas. Os asteriscos indicam que os valores são estatisticamente diferentes, tal como determinado pelo teste t de Student bicaudal, p <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O ferro é um nutriente essencial necessário por organismos de todos os reinos da vida 15. Em vertebrados, o ferro é sequestrado para evitar a toxicidade causada por este elemento. Este seqüestro também esconde ferro de micróbios invasores em um processo conhecido como imunidade nutricional 16. Em resposta, os patógenos evoluíram estratégias que burlam a imunidade nutricional. Um tal mecanismo depende de hemoglobina, que é o mais abundante fonte de ferro no interior do hospedeiro 17. Hemoglobina está contida no interior das células vermelhas do sangue. Hemoglobina liberada danificadas células vermelhas do sangue está vinculado por haptoglobina anfitrião, o que sinaliza a remoção rápida de haptoglobina-hemoglobina complexos por macrófagos 18. A fim de obter acesso a hemoglobina, S. aureus expressa hemolisinas que lisam as células vermelhas do sangue 19. Haptoglobina induzida por remoção da hemoglobina é contrariado por ligação de alta afinidade da hemoglobina pelos receptores da superfície celular expressas pelas
Numerosos estudos demonstraram a contribuição do sistema Isd a infecção 8,10-14. Além disso, estudos bioquímicos têm atribuído as funções de cada um dos componentes da hemoglobina derivada de aquisição de ferro 4-9. Descrevemos aqui um ensaio que monitora o crescimento de S. aureus com hemoglobina como a única fonte de ferro disponível. A este respeito, é necessário salientar certas condições que são cruciais para o sucesso da experiência.
A qualidade e do tipo de reagentes utilizados na hemoglobina derivados de ensaios de crescimento de ferro de aquisição pode influenciar drasticamente o obti resultadosned nestes ensaios. Em contraste com a hemoglobina obtida a partir de sangue fresco de hemoglobina, que é armazenado na forma liofilizada permite o crescimento bacteriano independente dos componentes do sistema de Isd (Figura 4) 21. Isto é provavelmente devido a alterações na estrutura da hemoglobina que são induzidos por liofilização. Especificamente, hemoglobina liofilizada contém tetrâmeros, dímeros e monómeros de hemoglobina, bem como heme na sua 22 forma livre. Purificação da hemoglobina a partir de sangue fresco e sua preservação em azoto líquido assegurar a integridade da proteína 22. Extensa pesquisa sobre a hemoglobina tem facilitado o desenvolvimento de protocolos para a purificação de alta qualidade de hemoglobina a partir de sangue fresco ou de forma recombinante, o qual pode ser utilizado no nosso ensaio 23-25.
A escolha do quelante de ferro pode afectar o ensaio de crescimento. Por exemplo, 2,2-dipiridilo, o que é frequentemente utilizado como um quelante de ferro, é tóxicopara células bacterianas 26. Estes dois efeitos tornam difícil discernir se a inibição do crescimento bacteriano por 2,2-dipiridilo é devido à quelação de ferro ou toxicidade. Além disso, 2,2-dipiridilo é susceptível de ser permeável e, assim, penetra na célula bacteriana e quelatos de ferro intracelular 27. Descobrimos que a inibição do crescimento por EDDHA é revertida por suplementação de uma fonte de ferro, tornando-EDDHA um quelante de ferro mais adequado para ensaios de crescimento de bactérias. No entanto, a concentração de EDDHA que tem de ser adicionado ao meio de crescimento pode variar. Isto é devido à variação de potência tanto EDDHA e conteúdo de ferro de crescimento médio de lote para lote. O ferro actividade quelante pode ser normalizado entre lotes de EDDHA por quimicamente remoção de ferro residual 28. No entanto, devido à variação entre lotes de meio RPMI, descobrimos que a concentração final de EDDHA pode ainda ter de ser ajustada para permitir que o crescimento na presença de uma fonte de ferro. Encontramos ªna maior concentração de EDDHA que é permissivo para o crescimento de tipo selvagem de S. aureus na presença de hemoglobina é o ideal para esta experiência.
Podem ser feitas modificações ao protocolo actual para ser mais semelhante a encontrada por meio de bactérias durante a infecção. Por exemplo, dentro do hospedeiro, heme que é libertada a partir de hemoglobina é rapidamente ligado por hemopexina. Hemopexina não pode ser usado como uma fonte de ferro por S. aureus, portanto, a sua adição iria impedir a aquisição de heme da hemoglobina libertada durante a incubação com S. aureus 12.
Pensamos que este ensaio pode ser utilizado para a pesquisa de aquisição do metal por uma variedade de agentes patogénicos bacterianos. Além disso, este método pode ser usado para medir a aquisição de ferro a partir de fontes não-hemoglobina do ferro que se encontram presentes no interior do hospedeiro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não temos nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi suportada por concessões de Saúde Pública dos Estados Unidos Serviço AI69233 e AI073843 do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas. EPS é um Burroughs Wellcome Fellow na patogênese de doenças infecciosas. KPH foi financiado pelo Celular e Molecular Microbiology concessão de Treinamento Programa 5 T32 A107611-10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC anion exchange column | Varian | PL1551-3802 | |
| Drabkin's reagent | Sigma | D5941-6VL | |
| Hemoglobin standard | Pointe Scientific | H7506-STD | |
| RPMI | HyClone | SH30011.02 | |
| Chelex 100 sodium form | Sigma | C7901 | |
| EDDHA | LGC Standards GmbH | ANC 001 | |
| Hemoglobin a antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc | SC-21005 | |
| Tryptic soy agar | BD | 236920 |
References
- Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
- Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
- Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
- Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
- Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
- Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
- Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
- Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
- Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
- Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
- Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
- Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
- Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
- Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
- Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
- Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
- Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
- Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
- Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. , (2011).
- Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
- Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).
- Williams, R. C. Jr, Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
- Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
- Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
- Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
- Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
- Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).
