Summary
Här beskriver vi en tillväxt-analys för
Abstract
S. aureus är en patogen bakterie som kräver järn för att utföra viktiga metaboliska funktioner och orsaka sjukdom. Den vanligast förekommande reservoar av järn i den mänskliga värden är heme, som är kofaktorn av hemoglobin. Att förvärva järn från hemoglobin, S. aureus använder ett avancerat system som kallas järn-reglerade yta determinanten (ISD) systemet 1. Komponenter av investeringstjänstedirektivet systemet först binder värd hemoglobin, sedan extrahera och importera hem, och slutligen frigöra järn från hem i den bakteriella cytoplasman 2,3. Denna väg har dissekerats genom många in vitro-studier 4-9. Vidare har bidrag Isd systemet för infektion upprepade gånger visats i musmodeller 8,10-14. Inrättande av bidrag Isd systemet till hemoglobin-härledda järn förvärv och tillväxt har visat sig vara mer utmanande. Tillväxt-analyser med hjälp av hemoglobin som enda järn källa är komplicerade By instabilitet kommersiellt tillgängliga hemoglobin, kontaminerande fritt järn i tillväxtmediet, och toxicitet associerad med järnkelatorer. Här presenterar vi en metod som övervinner dessa begränsningar. Hög kvalitet hemoglobin framställes från färskt blod och lagras i flytande kväve. Renat hemoglobin kompletteras i järn-bryter medel härma järn-dålig miljö möter patogener inuti vertebratvärden. Genom att svälta S. aureus av fritt järn och komplettera med ett minimalt manipulerad form av hemoglobin som vi framkalla tillväxt på ett sätt som är helt beroende av förmågan att binda hemoglobin, extrahera hem, passera hem genom den bakteriella cellen kuvertet och försämra hem i cytoplasman. Denna analys kommer att vara användbart för forskare som vill klarlägga de hemoglobin-/heme-derived järn förvärv i S. aureus och eventuellt andra bakteriella patogener.
Protocol
1. Rening av hemoglobin från färskt blod
- Förvärva färskt humant blod kompletterat med en antikoagulant. Hålla blodet på is eller vid 4 ° C under hela reningen.
- Centrifugera blod under 20 min vid 1.500 x g.. De röda blodkropparna (RBC) kommer att vara vid botten av röret. Försiktigt aspirera supernatanten och försiktigt återsuspendera pelleten i iskall 0,9% (vikt / volym) NaCl-lösning. Upprepa centrifugering och tvätta 3 gånger.
- Återsuspendera pelleten i 1 volym iskall 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Detta kommer att inducera lys av RBC på grund av osmotiskt tryck. Lägg toluen till ~ 20% slutlig volym.
- Inkubera vid 4 ° C på en spett natten.
- Centrifugera lysatet vid 20.000 x g under 1 timme. Samla i mitten hemolysatet fraktionen lämnar toluen (flytande ovanpå) och pellets orörd. Använd en lång hals pipett för att samla den mellersta fraktionen.
- Passera genom 0,44 um sprutfilter. Om lösningen innehåller partiklarmateria och kan inte passera genom filtret, upprepa steg 1,5.
- Rena hemoglobin (Hb) med en högpresterande vätskekromatografi (HPLC) anjonbytarkolonn (Varian, PL-SAX 1.000 per 8 pm, 150 mm x 4,6 mm). Den mobila fasen A är 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) och mobil fas B är 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. En 0% -100% gradient av lösningsmedel B körs under 2 min vid 2,0 ml / min flödeshastighet. Elueringen övervakas baserat på absorption (λ: 410 nm och 280 nm). Samla bara fraktionen kännetecknas av en klarröd färg och en framträdande absorptionstopp (figur 1).
- Dialysera elueringen mot fosfatbuffrad saltlösning (PBS) över natten och därefter i några timmar igen. Sterilisera genom passage genom en 0,22 fim sprutfilter.
- För att mäta Hb koncentration, förbereda standard Hb lösningar av kända koncentrationer i PBS. Bestämma koncentrationen av Hb i provet genom att blanda standardlösningar (se tabellen med reagenser ossed) eller provlösningen med 2x Drabkin reagens (framställd ur pulver) vid ett 1:1-förhållande. Till exempel, blanda 100 ^ Hb-lösning med 100 | il 2x Drabkin reagens i 96-brunnsplattor. Inkubera under 15 min och mät absorbansen vid 540 nm. Rita en standardkurva och bestämma Hb-koncentrationen i provet. Fem till femton mg / ml avkastningen är typisk.
- Kör 15-20 pg renat hemoglobin på en 15% SDS-PAGE i två exemplar. Stain en av gelerna, överföra proteinerna från en annan gel till ett nitrocellulosamembran och immunoblot för hemoglobin (figur 2).
- Frys och lagra 1 ml alikvoter av hemoglobin i flytande kväve.
2. Beredning av järn-bryter odlingsmedier
- Förbered Roswell Park Memorial Institute (RPMI) buljongen genom upplösning av RPMI-pulvret i vatten, tillsätt natriumbikarbonat som rekommenderas av tillverkaren och 1% cassamino syror (CA) (vikt / volym). Sterilisera genom passage genom en 0,2 um filter och lagra refrigrerad.
- Framställ metall-utarmade RPMI (NRPMI) genom tillsats 7% (vikt / volym) Chelex 100 och blandning över natten på en omrörarplatta. Avlägsna Chelex 100 genom att passera genom ett 0,2 pm filter och förvara i kylskåp. Komplettera media med essentiella icke-järnmetaller: 25 M ZnCl2, 25 M MnCl2, 100 mM CaCl 2 och 1 mM MgCl2 färdigställts i förväg som en steril 1.000 x-lösning. Använd disponibel plastbehållare för detta steg för att undvika järn kontamination från återanvändbara leveranser.
3. Staphylococcus aureus Tillväxt med hemoglobin som enda järnkälla
- Streak S. aureus för isolering på tryptisk soja-agar (TSA) från en frusen lager. Inkubera vid 37 ° C under 20-24 timmar.
- Återsuspendera etylendiamin-N, N'-bis (2-hydroxifenylättiksyra) (EDDHA) i vattenfri etanol till 100 mM. EDDHA går inte i lösning utan steriliseras genom etanol.
- Lägg EDDHA till RPMI till en slutlig koncentration av 0,5 mM. TillåtEDDHA att lösa minst 30 minuter innan du fortsätter till nästa steg. På grund av sats till sats variation kan slutlig EDDHA koncentration måste sänkas till 0,25 mm för att bakterietillväxt.
- Inokulera enstaka kolonier av S. aureus i 5 ml RPMI innehållande EDDHA i 15 ml med skruvkork koniska rör. Inkubera vid 37 ° C med skakning vid 180 varv per minut (rpm) under 16-20 timmar.
- Centrifugera natten kulturer i 5 min vid 7.500 xg och suspendera pelleten i NRPMI innehållande 0,5 mM EDDHA. Normalisera OD 600 till ~ 3.
- Förbered NRPMI innehållande 2,5 pg per ml Hb och 0,1-1,0 mM EDDHA. På grund av variationer mellan partier kan det EDDHA koncentration som krävs för att kelatera fritt järn i NRPMI variera.
- Subkultur 10 il bakteriesuspension från steg 3,5 i 1 ml NRPMI + EDDHA + Hb i en 15 ml skruvlock koniskt rör.
- Inkubera kulturerna vid 37 ° C under upp till 48 timmar med skakning vid 180 varv per minut eller på en rullande trumma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har renat humant hemoglobin från hemolysat med HPLC (protokoll steg 1,7). Figur 1 visar inspelade absorbans av eluatet vid 280 och 410 nm våglängd. Fraktion 5 uppsamlades och andra fraktioner kastades. Utbyten av 5-15 milligram hemoglobin per milliliter eluat typiskt förvärvas. Renat hemoglobin analyserades genom SDS-PAGE i duplikat och gelerna färgades antingen för proteiner eller överfördes till nitrocellulosa och immunoblottades (protokoll steg 1,10, figur 2).
Vi har bedömt förmågan hos renat humant hemoglobin för att stödja tillväxten av vildtyp S. aureus och S. aureus som saknar ISDB komponenten i Isd systemet (Δ ISDB). ISDB är en hemoglobin-receptor som krävs för hemoglobin-härledd järn förvärv 12. Vildtyp och Δ ISDB odlades i järn-utarmat medium kompletterat med mänsklig hemog lobin (NRPMI + EDDHA + Hb) som beskrivs i avsnitt 3 i protokollet. Vid odling i NRPMI + EDDHA + Hb, vildtyp men inte Δ ISDB kan proliferera såsom indikeras av en ökning i optisk densitet av kulturerna över tiden (figur 3A). I motsats, är förmågan att utnyttja kompletterat fritt järn (+ FeCls 3) identisk i vildtyp och Δ ISDB (figur 3B). Varken vildtyp eller Δ ISDB prolifererar i avsaknad av en järnkälla (figur 3B).
Vi har jämfört tillväxten av S. aureus i NRPMI + EDDHA kompletterat med hemoglobin renats från färskt blod eller lyofiliserade hemoglobin. Figur 4 illustrerar att medan hemoglobin renats från blod kräver ISDB för tillväxt, möjliggör lyofiliserade hemoglobin proliferation av Δ ISDB.
s/ftp_upload/50072/50072fig1.jpg "/>
Figur 1. Absorption av elueringsfraktionerna under hemoglobin rening. Absorption vid 410 nm (specifikt för heme-bindande proteiner) och 280 nm (karaktäristisk för alla proteiner) övervakades under hela elueringen. Fraktion nummer fem innehöll hemoglobin och samlades.
Figur 2. Renat humant hemoglobin Tjugo mikrogram renat hemoglobin separerades med användning denaturerande 15% SDS-PAGE. A. Gel färgades för proteiner med Bio-Rad proteinanalys färgreagens. B. Nitrocellulosamembran immunblottades för hemoglobin. Den intensiva undre bandet är ett hemoglobinvärde monomer, medan de mer svaga övre band är hemoglobin dimerer och tertramers, som inte får fullständigt denaturerad.
/ Ftp_upload/50072/50072fig3.jpg "/>
Figur 3. Användning av humant hemoglobin som ett järn källa av S. aureus A. Tillväxt av vildtyp (wt) eller isogena hemoglobin-receptor ISDB mutanten (Δ ISDB) i NRPMI kompletterat med järnkelator EDDHA och humant hemoglobin är statistiskt olika som bestämdes genom Students två-svansade t-test, p <0,05. B. Tillväxten i NRPMI kompletterat med 10 M järnklorid (+ FeCl 3) eller EDDHA (-FeCls 3) är inte annorlunda mellan vikt och Δ ISDB. Grafer visar data från ett representativt experiment, som omfattade tre biologiska replikat. Felstaplar anger standardavvikelse optisk densitet avläsningar vid angivna tidpunkter mellan replikat.
Figur 4. Tillväxt av vildtyp (WT) eller isogena hemoglobin-receptor mutant (Δ ISDB) i medium kompletterat med hemoglobin renat från färskt blod eller lyofiliserade hemoglobin. Diagrammet visar data från ett representativt experiment, som omfattade tre biologiska replikat. Felet staplarna representerar standardavvikelse optisk densitet avläsningar vid angivna tidpunkter mellan replikat. Asterisker betecknar värden som är statistiskt olika som bestämdes genom Students två-svansade t-test, p <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Järn är ett viktigt näringsämne som krävs av organismer från alla riken i livet 15. I ryggradsdjur, är järn sekvestreras att undvika toxicitet orsakad av detta element. Denna bindning döljer också järn från invaderande mikrober i en process som kallas näringsmässiga immunitet 16. Som svar har patogener utvecklats strategier som kringgår näringsmässiga immunitet. En sådan mekanism förlitar sig på hemoglobin, vilket är det mest förekommande källan för järn i värden 17. Hemoglobin inuti röda blodkroppar. Hemoglobin frigörs från skadade röda blodkroppar binds av värd haptoglobin, som signalerar snabbt avlägsnande av haptoglobin-hemoglobin-komplex med makrofager 18. För att få tillgång till hemoglobin, S. aureus uttrycker hemolysiner som lyserar röda blodkroppar 19. Haptoglobin-hemoglobin inducerad avlägsnande motverkas genom högaffinitetsbindning av hemoglobin genom cellytreceptorer som uttrycks av
Ett flertal studier har visat bidrag Isd systemet infektion 8,10-14. Vidare har biokemiska studier tilldelas funktioner dess enskilda komponenter i hemoglobin härrör-järn förvärv 4-9. Här beskriver vi en analys som övervakar tillväxten av S. aureus med hemoglobin som den enda källan av tillgängligt järn. I detta avseende måste vi påpeka vissa villkor som är avgörande för framgången av experimentet.
Kvaliteten och typ av reagens som används i hemoglobin-derived growth järn förvärv analyser kan dramatiskt påverka resultatet obtainieras i dessa analyser. I motsats till hemoglobin som erhållits från färskt blod, hemoglobin, som lagras i lyofiliserad form tillåter bakterietillväxt oberoende av komponenterna i Isd (figur 4) 21. Detta är sannolikt på grund av förändringar i strukturen av hemoglobin som induceras genom lyofilisering. Specifikt innehåller lyofiliserade hemoglobin tetramerer, dimerer och monomerer av hemoglobin, liksom heme i sin fria form 22. Rening av hemoglobin från färskt blod och dess bevarande i flytande kväve säkerställa integriteten av proteinet 22. Omfattande forskning på hemoglobin har underlättat utvecklingen av protokoll för rening av hög kvalitet hemoglobin från färskt blod eller i rekombinant form, som kan användas i vår analys 23-25.
Valet av järnkelator kan påverka tillväxten analysen. Exempelvis är 2,2-dipyridyl, som ofta används som en järnkelator, giftigtill bakterieceller 26. Dessa två effekter gör det svårt att urskilja om hämningen av bakterietillväxt genom 2,2-dipyridyl beror på järnkelatbildningen eller toxicitet. Dessutom är 2,2-dipyridyl sannolikt membran permeabelt, och därmed tränger in i bakteriecellen och kelat järn intracellulärt 27. Vi har funnit att tillväxtinhibering av EDDHA omkastas genom komplettering av en järnkälla, gör EDDHA en mer lämplig järnkelator för bakteriella tillväxtanalyser. Emellertid kan koncentrationen av EDDHA som måste tillsättas till tillväxtmediet variera. Detta beror på variation av både EDDHA styrka och tillväxtmedium järnhalt från sats till sats. Järnet kelatbildande aktiviteten kan normaliseras mellan partier av EDDHA genom att kemiskt avlägsna kvarvarande järn 28. Men på grund av skillnader mellan partier av RPMI, fann vi att den slutliga EDDHA koncentrationen fortfarande kan behöva justeras för att möjliggöra tillväxt i närvaro av en järn källa. Vi hittade thvid den högsta koncentrationen av EDDHA som är tillåtande för tillväxt av vildtyp S. aureus i närvaro av hemoglobin är optimalt för detta experiment.
Ändringar kan göras till den aktuella protokollet till mer liknar miljön möter av bakterier under infektion. Till exempel inom värden, är hem som frigörs från hemoglobin snabbt bundna av hemopexin. Hemopexin kan inte användas som en järnkälla av S. aureus, därför dess tillsats skulle förhindra förvärv av heme frigörs från hemoglobin under inkubation med S. aureus 12.
Vi anser att denna analys kan användas för forskning kring metall förvärv av en mängd bakteriella patogener. Vidare kan denna metod användas för att mäta järn förvärv från icke-hemoglobin källor till järn som är närvarande i värden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av US Public bidrag Health Service AI69233 och AI073843 från National Institute of Allergy och infektionssjukdomar. EPS är en Burroughs Wellcome Fellow i patogenesen av infektionssjukdomar. KPH finansierades av de cellulära och molekylära mikrobiologi Training bidragsprogram 5 T32 A107611-10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC anion exchange column | Varian | PL1551-3802 | |
| Drabkin's reagent | Sigma | D5941-6VL | |
| Hemoglobin standard | Pointe Scientific | H7506-STD | |
| RPMI | HyClone | SH30011.02 | |
| Chelex 100 sodium form | Sigma | C7901 | |
| EDDHA | LGC Standards GmbH | ANC 001 | |
| Hemoglobin a antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc | SC-21005 | |
| Tryptic soy agar | BD | 236920 |
References
- Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
- Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
- Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
- Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
- Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
- Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
- Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
- Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
- Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
- Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
- Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
- Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
- Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
- Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
- Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
- Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
- Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
- Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
- Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. , (2011).
- Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
- Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).
- Williams, R. C. Jr, Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
- Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
- Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
- Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
- Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
- Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).
