Summary
La modification la membrane cellulaire des globules rouges (hématies) avec le polyglycérol hyperbranché (HPG) est présenté. Globules rouges modifiés ont été caractérisées par séparation de phase aqueuse à deux, fragilité osmotique et la lyse médiée par le complément. Le camouflage des protéines de surface et des antigènes a été évaluée en utilisant la cytométrie en flux et Micro Typing System (MTS) cartes de phénotypage de sang.
Abstract
De globules rouges (RBC) la transfusion est indispensable pour le traitement d'un certain nombre de problèmes graves et chroniques médicales telles que la thalassémie majeure et une anémie drépanocytaire 1-3. En raison de la présence de la multitude des antigènes à la surface du globule (~ 308 antigènes connus 4), les patients du traitement par transfusion sanguine chronique développer des allo-anticorps en raison de la Miss Match des antigènes mineurs sur les globules rouges transfusés 4, 5. Greffage de polymères hydrophiles comme le polyéthylène glycol (PEG) et de polyglycérol hyperbranché (HPG) forme une couche d'exclusion de membrane des globules rouges qui empêche l'interaction d'anticorps avec des antigènes de surface, sans affecter le passage de petites molécules telles que l'oxygène, le glucose, et des ions 3. À l'heure actuelle aucune méthode n'est disponible pour la production de cellules rouges universels de donneurs de sang en partie à cause de l'énorme défi présenté par la présence d'un grand nombre d'antigènes (protéines et des glucides en fonction) sur la surface du globule et le développement de ces méthodes permettra d'améliorer sensiblement la sécurité transfusionnelle, et d'améliorer considérablement la disponibilité et l'utilisation de globules rouges. Dans le présent rapport, les expériences qui sont utilisés pour développer des antigènes protégées globules rouges fonctionnels par la membrane greffage de HPG et leur caractérisation sont présentés. HPGs sont hautement biocompatible polymères compacts 6, 7, et on s'attend à être situé dans le glycocalyx cellulaire qui entoure la membrane lipidique 8, 9 et antigènes de surface masque RBC 10, 11.
Protocol
Modification A. polyglycérol hyperbranché (SS-HPG)
- Lieu lyophilisé HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) dans un ballon à fond rond et le sécher toute une nuit sous vide à 90 ° C.
- Réfrigérer le ballon à la température ambiante, et on dissout le HPG séchée dans de la pyridine anhydre (3 ml).
- À fonctionnaliser environ huit groupes hydroxyle sur HPG avec des groupes carboxyle, ajouter une quantité catalytique de diméthylaminopyridine (une goutte de 5 mg / ml de solution dans la pyridine) à la solution de HPG. A ce mélange, ajouter l'anhydride succinique, (0,0067 g, 0,0664 mmol) dissous dans 0,5 ml de pyridine goutte à goutte en 10 min. Remuer le mélange pendant une nuit à température ambiante sous argon.
- Précipiter le mélange dans 40 ml d'acétone froid (4 ° C) dans un tube à centrifuger de 50 ml et centrifuger à l'aide d'un Beckman J2-MC centrifugeuse à 27.000 xg pendant 15 min. Décanter le surnageant, et éliminer l'acétone résiduelle par balayage d'argon à température ambiante.
- Pour activer le carboxyl avec des groupes succinate de succinimidyle (SS), des groupes carboxyle dissoudre le HPG-fonctionnalisé dans 3 ml de DMF anhydre. Ajouter du N-hydroxysuccinimide (0,0077 g, 0,0664 mmol) et de N, N'-diisopropylcarbodiimide (0,0084 g, 0,0664 mmol) à la solution HPG et agiter le mélange pendant une nuit à température ambiante sous argon.
- Purifier le SS-HPG par précipitation dans l'acétone froide.
- Éliminer l'acétone résiduelle en rinçant avec de l'argon.
- Déterminer la pureté de HPG modifiée et le degré de fonctionnalisation carboxyle et SS par proton (1 H) - L'analyse par RMN.
B. Collecte de sang total et de séparation des globules rouges (hématies)
- Prélever le sang entier (hématocrite de 40%, 3 ml) à partir de donneurs humains sains consenti dans un tube Vacutainer citrate.
- Centrifuger le tube citrate à 1000 xg pendant 4 min.
- Éliminer le liquide surnageant contenant le plasma et les plaquettes, et le buffy coat intermédiaire qui contient des globules blancs et platelets à l'aide d'une pipette Pasteur.
- Transfert culot d'hématies (80% d'hématocrite, 1,2 ml) dans un tube de centrifugeuse Falcon 12 ml et ajouter du tampon PBS (8 ml, pH = 8,0) pour laver les globules rouges.
- Mélanger par inversion globules rouges pour obtenir une répartition uniforme de la cellule.
- Centrifuger le tube Falcon à 1000 xg pendant 4 min et éliminer le surnageant.
- Laver les globules rouges avec PBS deux fois plus en répétant les étapes 5 et 6.
- Lieu-emballés globules rouges (100 pi) dans 1,6 ml Eppendorf tube, et ajouter un tampon PBS (300 pl, pH = 8,0) pour obtenir 20% d'hématocrite globules rouges.
C. HPG greffage de globules rouges
- Immédiatement après la précipitation du HPG modifiés dans l'acétone dans l'étape A6, lieu SS-HPG (150 mg) dans un flacon en verre (1 dram), et le dissoudre dans du tampon PBS (300 pl, pH = 8,0).
- Ajouter SS-HPG solution de polymère dans hématocrite de 20% pour les globules rouges lavés obtenir un volume final de 400 pl et SS-HPG concentration qui varie de 0,5 mm à 3 mm. Par exemple, pour préparer les globules rouges traités avec 0,5 mM SS-HPG, retirez 36 pi de PBS lavé de la RBC et de placer 36 ul de SS-HPG solution de polymère.
- Vortex doucement la suspension et placer les tubes Eppendorf sur un agitateur orbital à température ambiante pendant 1 heure.
- Centrifuger les tubes Eppendorf à 1000 xg pendant 4 min, et introduire à la pipette sur le surnageant.
- Ajouter 1 ml de PBS pour laver les globules rouges, centrifuger et éliminer le surnageant.
- Ajouter 1 ml de solution saline et laver deux fois plus de globules rouges à l'étape 5.
- Ajouter 300 ul de solution saline à 100 pi du culot d'hématies (80% d'hématocrite) à une concentration finale de l'hématocrite à 20%.
Caractérisation D. HPG jour globules rouges
Lyse médiée par le complément I.
- Recueillir environ 8 ml de sang total de donneurs sains en BD Vacutainer tube de verre sérum, et permettre au sang de coaguler à température ambiante pendant 30 min.
- Centrifuger le tube à 2000 xg pendant 10 minutes et recueillir environ 3 ml de sérum.
- Un millilitre de la serum a été placé dans un bain d'eau à 60 ° C pendant 30 minutes pour préparer un sérum inactivé par la chaleur.
- Ajouter 60 ul de sérum frais ou la chaleur sérum inactivé dans un tube Eppendorf contenant 60 ul de 20% d'hématocrite HPG globules rouges modifiés ou non modifiés globules rouges.
- Incuber les globules rouges pendant 1 heure à 37 ° C.
- Pour quantifier la quantité d'hémoglobine dans la suspension cellulaire, lieu de 5,9 ul hématocrite de 20% des globules rouges HPG modifiés ou non modifiés cellules en trois exemplaires en plaque de 96 puits. Ajouter 294 ul de réactif de Drabkin (un réactif qui est utilisé pour quantifier la quantité d'hémoglobine spectrophotomerically). Mélanger les cellules avec le réactif de Drabkin par pipetage et arrière. Mesurer l'absorption de l'hémoglobine cyanoderivative à 540 nm en utilisant des spectres MAX lecteur de plaque 190.
- Pour quantifier la quantité d'hémoglobine dans le surnageant, centrifuger les cellules à 13.000 xg pendant 1 min. Placer 50 ul de surnageant en triple exemplaire dans une plaque 96 puits. Ajouter 250 ul de réactif de Drabkin. Cellules mélanger avec le réactif de Drabkinpar pipetage et arrière. Mesurer l'absorption de l'hémoglobine cyanoderivative à 540 nm en utilisant des spectres MAX lecteur de plaque 190.
- Quantifier la quantité de cellules lysées à partir du rapport de l'hémoglobine dans le surnageant (étape 7) et l'hémoglobine totale dans l'échantillon (étape 6) 8, 11, 12.
II. Le camouflage des antigènes majeurs et mineurs utilisant des cartes de MTS
- Placer 50 ul de HPG modifié RBC (10% hématocrite) dans un tube Eppendorf, centrifuger à 1000 xg pendant 1 min et éliminer le surnageant.
- Ajouter 110 ul de diluant MTS au culot cellulaire et d'homogénéiser la suspension de cellules par pipetage et arrière.
- Ajouter 11 ul de la suspension cellulaire dans chaque colonne de gel mini. Évitez de toucher le gel pendant l'addition.
- Localisez cartes MTS dans un porte-carte centrifugeuse et centrifuger à 156 xg pendant 6 min.
- Protection des antigènes de surface est déterminé à partir de l'emplacement de RBC dans la mini-colonne de gel, sur la base de la fabricationr description.
III. Aqueuses deux mesures de phase de séparation
- Préparer Dextran 500 kDa / PEG 8 kDa système à deux phases constitué de séparation (5% de dextran 500k, 4% de PEG 8K, 150 mM NaCl, 10 mM de phosphate) selon 13.
- Centrifuger à 433 xg pendant 10 min à température ambiante pour obtenir un système à deux phases (dextrane dans le fond).
- Séparer les deux phases avec soin.
- Aliquote de 1,0 ml de la phase PEG supérieure dans un tube étiqueté (avec fond concave), ajouter 20 ul de 20% d'hématocrite HPG RBC modifié, et les cellules mélanger doucement en tapotant.
- Ajouter 0,5 ml de la phase supérieure qui contiennent des cellules à 0,5 ml d'une phase inférieure, et mélanger délicatement le système en tapotant.
- Placer le tube sur le banc de ~ 2 min pour le système de séparation, et déterminer l'emplacement des cellules dans le système. Localisation des globules rouges (dans la phase PEG supérieure, dans la phase inférieure de dextrane ou dans les deux) est fonction du degré de modification et moléculairepoids de HPG.
IV. Mesures fragilité osmotique
- Préparer des solutions de NaCl à des concentrations allant de 0 à 0,9 (p / v)%.
- Lieu 0,4 ml de solutions de NaCl en tubes Eppendorf de 1,5 ml.
- Ajouter 20 ul de globules rouges (hématocrite 20%) dans les solutions de NaCl.
- Cellules Mélanger soigneusement par retournement et les placer dans un bain-marie à 37 ° C pendant 30 min.
- Suspendre les cellules soigneusement par retournement. Prenez 50 uL de suspension RBC et l'ajouter à un réactif de Drabkin 1 ml, placé dans une cuvette. Mélanger les cellules avec le réactif de Drabkin par pipetage et arrière. Mesurer l'absorption de l'hémoglobine cyanoderivative à 540 nm en utilisant BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS lecteur.
- Pour quantifier la quantité d'hémoglobine dans le surnageant, centrifuger les cellules à 1000 xg pendant 1 min. Ajouter 200 ul de surnageant à 1 ml de réactif de Drabkin dans une cuvette. Mélanger les cellules avec le réactif de Drabkin par pipetage et arrière. Mesurer l'absorbance de la hemoglobin cyanoderivative à 540 nm en utilisant BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS lecteur.
- Calculer la quantité de cellules lysées dans une solution de NaCl différent du rapport de la quantité d'hémoglobine dans le surnageant (étape 6) de la quantité totale d'hémoglobine dans la suspension de cellules (étape 5).
V. mesures par cytométrie en flux - Protection de Rhésus D (RhD) antigène
- Ajouter 5 ul de contrôle ou de globules rouges modifiés HPG (20% d'hématocrite), en trois exemplaires au tampon PBS additionné de 0,5% de BSA pour un volume total de 25 ul.
- Ajouter 25 ul de FITC anticorps monoclonal anti-Rhésus D (RhD) a acheté du quotient biodiagnostic (PA, USA).
- Incuber le mélange pendant 30 min à 37 ° C dans un bain d'eau.
- Laver le mélange avec 1,5 ml de tampon PBS deux fois. Centrifuger à 1000 xg pendant 1 min pour éliminer le surnageant.
- Suspendre les globules rouges dans 1 ml de solution saline, et transférer la suspension dans 4 ml de débit du tube BD cytométrie en flux.
- Analyser l'aide FACSCanto II flow cytomètre, l'acquisition de 5.000 événements sur le portail RBC contrôle et l'utilisation des événements entiers pour l'analyse.
VI. Mesures de cytométrie en flux - Expression de CD47
- Ajouter 1,54 ul de contrôle ou de globules rouges modifiés HPG (20% d'hématocrite), en trois exemplaires au tampon PBS additionné de 0,5% de BSA pour un volume total de 44 ul.
- Ajouter 6 pl de la phycoérythrine (PE) marqué souris anti-humain CD47 acheté de BD Biosciences (NJ, USA).
- Incuber le mélange pendant 30 min à 37 ° C dans un bain d'eau.
- Laver le mélange avec 1,5 ml de tampon PBS pendant deux fois. Centrifuger à 1000 xg pendant 1 min pour éliminer le surnageant.
- Suspendre les globules rouges dans 1 ml de solution saline, et passer à 26 G 5/8 aiguille afin de minimiser agglutination cellulaire.
- Transférer la suspension dans 4 ml de débit du tube BD cytométrie en flux.
- Analyser aide d'un cytomètre de flux FACSCanto II, l'acquisition de 10.000 manifestations sur le portail RBC commande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Camouflage de l'antigène Rhésus D et la protéine de surface CD47 RBC ont été quantifiés par cytométrie en flux en utilisant des anticorps marqués fluorescents monoclonaux, et un résultat représentatif est donné dans la figure 1. En cas de HPG-greffés globules rouges (gris), l'intensité du signal diminue (pic décalé vers la gauche) par rapport à la commande de globules rouges (rouge et vert) indiquant une réduction de la liaison à des anticorps à la surface cellulaire qui indiquent le masquage des protéines de surface .
Figure 1. Évaluation du camouflage des antigènes de surface et des protéines en utilisant la cytométrie en flux. A) Rhésus D (RhD) Protection: Noir pic ombrée représente le contrôle négatif (non modifiés globules rouges traités avec PE marqué IgG1), le pic vert représentent la coopération positiventrol (non modifiés globules rouges traités par anti-RhD anticorps fluorescents), et le pic gris représente HPG globules rouges modifiés traités avec la même quantité d'anti-RhD anticorps fluorescents. B) CD47: Noir pic ombrée représente le contrôle négatif (non modifiés globules rouges traités avec PE marqué IgG1), le pic rouge représentent le contrôle positif (non modifiés globules rouges traités par anti-CD47 anticorps fluorescents), et le pic gris représente HPG globules rouges modifiés traités avec la même quantité d'anti-CD47 anticorps fluorescents. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GR donateurs universelles ont un grand potentiel dans la disponibilité du sang et de sécurité pour améliorer la thérapie de transfusion sanguine. Les globules rouges sont également considérés comme vecteurs de médicaments prometteurs en raison de leur longue circulation et la biocompatibilité inhérente 14, 15. Les expériences présentées dans cet article d'évaluer la caractéristiques in vitro de globules rouges modifiés HPG. L'propriétés in vitro et in vivo en circulation des globules rouges modifiés HPG ont été étudiés dans notre groupe a récemment 8, 11. La séparation des globules rouges dans une solution aqueuse Dextran500K/PEG8K système à deux phases, additionné de NaCl et le phosphate de sodium, dépend de la charge de surface des érythrocytes et de la composition de glycoprotéine de surface 16. Selon l'ampleur de RBC glycocalyx modification avec HPGs, globules rouges modifiés tendance à se répartir de la baisse du dextrane à la phase PEG supérieure. Le système à deux phases permet une évaluation facile de l'étendue de la modification de surface RBC. Lyse oglobules rouges dans le sérum autologue f est un test important pour enquêter, si HPG globules rouges modifiés déclenche l'activation du complément, depuis l'introduction de nouveaux matériaux pour les cellules et les surfaces biologiques rend étrangère et sous réserve de la lyse du système immunitaire à médiation et le dédouanement 17. L'expérience fragilité osmotique, d'autre part, indique si les propriétés mécaniques et de déformabilité de la membrane RBC a été compromise à la suite de HPG greffe. La déformabilité des globules rouges est important pour la fonction physiologique de O 2 dans les différentes parties du corps. Dans cette expérience, les globules rouges modifiées sont exposées à un stress déformation par traitement avec différentes concentrations de NaCl, et la quantification des cellules lysées pour cent.
La cytométrie en flux est utilisée pour évaluer l'importance de l'antigène de surface et la protection des protéines de surface (figure 1) en faisant réagir un antigène particulier sur la surface de RBC avec son correspondant fluorescent-labelled anticorps. L'étendue de la protection antigène Rhésus D est évaluée par cytométrie en flux. Le masquage des antigènes est évident à partir de la diminution de la liaison de l'anticorps aux globules rouges. Masquage antigène Rhésus D est également évalué par cartes de MTS. Cartes de MTS sont largement utilisés dans les laboratoires d'hématologie à l'hôpital pour le phénotypage des globules rouges. Par exemple, lorsque le groupe A-RBC est situé dans une carte de type MTS, agglutiner des cellules à la suite d'une réaction avec l'anticorps monoclonal correspondant. Toutefois, B-groupe sanguin ne s'agglutinent et se déplace vers le bas de la mini-gel. Le concept d'agglutination a été utilisé pour évaluer le niveau de protection que HPG greffe fournit aux globules rouges. GR-HPG greffés pénètre dans la mini-colonne de gel, en fonction du niveau de l'antigène de surface de protection.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par les Société canadienne du sang (SCS) et les Instituts canadiens de sciences de la santé du Canada (IRSC) Fonds de partenariat pour la recherche. Les auteurs remercient le Hub LMB macromolécule au Centre de l'UBC pour la recherche de sang pour l'utilisation de leurs installations de recherche. L'installation de l'infrastructure est soutenu par la Fondation canadienne pour l'innovation (FCI) et la Fondation Michael Smith pour la recherche en santé (MSFHR). R. Chapanian est récipiendaire de (IRSC / CBS) bourses postdoctorales en transfusion sanguine et d'un destinataire de recherche MSFHR poste stagiaire boursier de doctorat. JN Kizhakkedathu est récipiendaire de carrière MSFHR chercheur Scholar Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycidol | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Trimethylolpropane | Fluka | (ON, Canada) | |
| Potassium methylate | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Anhydrous pyridine | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| 4-Dimethylaminopyridine | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Succinic anhydride | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Acetone | Fisher Scientific | (ON, Canada) | |
| Anhydrous dimethyl formamide | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| N,N'-Diisopropylcarbodiimide | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| MTS cards | Micro Typing System (MTS) cards (FL, USA) | ||
| Dextran 500 kDa | Pharmacia Fine Chemicals | (Sweden) | |
| PEG 8 kDa | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD) | Quotient Biodiagnostics | (PA, USA) | |
| PE monoclonal anti-CD47 | BD Biosciences | (NJ, USA) | |
| Drabkin's reagent | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Table. Chemicals and reagents used for the grafting of HPG polymers to RBC membrane and their analysis. | |||
References
- Bradley, A. J., Murad, K. L., Regan, K. L., Scott, M. D. Biophysical consequences of linker chemistry and polymer size on stealth erythrocytes: size does matter. Biochim. Biophys. Acta. 1561 (2), 147-158 (2002).
- Murad, K. T., Mahany, K. L., Brugnara, C., Kuypers, F. A., Eaton, J. W., Scott, M. D. Structural and functional consequences of antigenic modulation of red blood cells with methoxypoly(ethylene glycol. Blood. 93 (6), 2121-2127 (1999).
- Scott, M. D., Murad, K. L., Koumpouras, F., Talbot, M., Eaton, J. W. Chemical camouflage of antigenic determinants: Stealth erythrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (14), 7566-7571 (1997).
- Daniels, G., Reid, M. E. Blood groups: the past 50 years. Transfusion. 50 (2), 281-289 (2010).
- Murad, K. L., Gosselin, E. J., Eaton, J. W., Scott, M. D. Stealth cells: Prevention of major histocompatibility complex class II-mediated T-cell activation by cell surface modification. Blood. 94 (6), 2135-2141 (1999).
- Kainthan, R. K., Hester, S. R., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. In vitro biological evaluation of high molecular weight hyperbranched polyglycerols. Biomaterials. 28 (31), 4581-4590 (2007).
- Kainthan, R. K., Janzen, J., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. Biocompatibility testing of branched and linear polyglycidol. Biomacromolecules. 7 (3), 703-709 (2006).
- Chapanian, R., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. In vivo circulation, clearance, and biodistribution of polyglycerol grafted functional red blood cells. Biomaterials. 33 (10), 3047-3057 (2012).
- Chapanian, R., Constantinescu, I., Rossi, N. A. A., Medvedev, N., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. Influence of polymer architecture on antigens Camouflage, CD47 protection and complement mediated lysis of surface grafted red blood cells. Biomaterials. 33 (31), 7871-7883 (2012).
- Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. Enhanced cell surface polymer grafting in concentrated and nonreactive aqueous polymer solutions. J. Am. Chem. Soc. 132 (10), 3423-3430 (2010).
- Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Kainthan, R. K., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. Red blood cell membrane grafting of multi-functional hyperbranched polyglycerols. Biomaterials. 31 (14), 4167-4178 (2010).
- Muzykantov, V. R., Smirnov, M. D., Domogatsky, S. P. Hemolytic complement activity assay in microtitration plates. J. App. Biochem. 7 (3), 223-227 (1985).
- Walter, H., Brooks, D. E., Fisher, D. Partitioning in aqueous two-phase systems: theory, methods, uses, and applications to biotechnology. , Academic Press Inc. London. (1985).
- Rossi, L., Serafini, S., Pierige, F., Antonelli, A., Cerasi, A., Franternale, A., et al. Erythrocyte-based drug delivery. Expert Opin. Drug Deliv. 2 (2), 311-322 (2005).
- Walter, H., Krob, E. J., Brooks, D. E. Membrane surface properties other than charge involved in cell separation by partition in polymer, aqueous 2-phase systems. Biochemistry. 15 (14), 2959-2964 (1976).
- Muzykantov, V. R., Murciano, J. C., Taylor, R. P., Atochina, E. N., Herraez, A. Regulation of the complement-mediated elimination of red blood cells modified with biotin and streptavidin. Anal Biochem. 241 (1), 109-119 (1996).
