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Immunology and Infection

एंटीजन कॉम्पैक्ट hyperbranched Polyglycerols की ग्राफ्टिंग झिल्ली कार्यात्मक लाल रक्त कोशिकाओं की रक्षा

Published: January 2, 2013 doi: 10.3791/50075
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2,4, 1,2,3, 1,2,4
1Centre for Blood Research, University of British Columbia, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia, 3Canadian Blood Services, University of British Columbia, 4Department of Chemistry, Life Sciences Centre, University of British Columbia

Summary

लाल रक्त कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली (RBCs) संशोधन hyperbranched polyglycerol (HPG) के साथ प्रस्तुत किया है. संशोधित RBCs जलीय चरण दो विभाजन, आसमाटिक कमजोरी और पूरक मध्यस्थता lysis द्वारा विशेषता थे. छलावरण सतह प्रोटीन और प्रतिजनों के प्रवाह cytometry और माइक्रो टंकण प्रणाली (MTS) रक्त phenotyping कार्ड का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था.

Abstract

लाल रक्त कोशिका आधान (आरबीसी) थैलेसीमिया प्रमुख और सिकल सेल एनीमिया 1-3 के रूप में तीव्र और जीर्ण चिकित्सा समस्याओं का एक नंबर के उपचार के लिए महत्वपूर्ण है. आरबीसी (~ 308 4 में जाना जाता प्रतिजनों) सतह, क्रोनिक रक्त आधान चिकित्सा में रोगियों चढ़ाया RBCs 4, 5 पर मामूली प्रतिजनों के मिस मैच के कारण alloantibodies के विकास पर एंटीजन की भीड़ की उपस्थिति के कारण. Polyethylene (खूंटी) glycol और hyperbranched polyglycerol (HPG) के रूप में हाइड्रोफिलिक पॉलिमर की ग्राफ्टिंग आरबीसी झिल्ली पर एक अपवर्जन परत है कि ऑक्सीजन, ग्लूकोज, और 3 आयनों के रूप में इस तरह के छोटे अणुओं के पारित होने को प्रभावित किए बिना सतह प्रतिजनों के साथ एंटीबॉडी की बातचीत को रोकता है रूपों. वर्तमान में कोई विधि सार्वभौमिक लाल रक्त दाता कोशिकाओं के हिस्से में कठिन चुनौती आरबीसी सतह और घ पर प्रतिजनों की बड़ी संख्या (प्रोटीन और कार्बोहाइड्रेट आधारित) की उपस्थिति द्वारा प्रस्तुत की वजह से पीढ़ी के लिए उपलब्ध हैइस तरह के तरीकों के evelopment काफी आधान सुरक्षा में सुधार करने के लिए, और नाटकीय रूप से और लाल रक्त कोशिकाओं की उपलब्धता और उपयोग में सुधार. इस रिपोर्ट में प्रस्तुत कर रहे हैं, प्रयोगों कि HPG और उनके लक्षण वर्णन की ग्राफ्टिंग झिल्ली द्वारा प्रतिजन संरक्षित कार्यात्मक लाल रक्त कोशिकाओं को विकसित करने के लिए उपयोग किया जाता है. HPGs अत्यधिक कॉम्पैक्ट 6 पॉलिमर, 7 biocompatible रहे हैं, कर रहे हैं और सेल glycocalyx है कि लिपिड झिल्ली 8, 9 और मुखौटा आरबीसी सतह 10 प्रतिजनों, 11 के चारों ओर के भीतर स्थित होने की उम्मीद है.

Protocol

ए hyperbranched Polyglycerol संशोधन (एसएस HPG)

  1. एक दौर नीचे फ्लास्क में 60 केडीए (0.5 ग्राम, .0083 mmol) प्लेस HPG lyophilized और यह रात 90 में शून्य के अंतर्गत सूखा डिग्री सेल्सियस
  2. कमरे के तापमान पर फ्लास्क ठण्डा, और निर्जल pyridine (3 मिलीग्राम) में सूखे HPG भंग.
  3. Carboxyl समूहों के साथ HPG पर लगभग आठ हाइड्रॉक्सिल समूहों functionalize HPG समाधान के लिए (5 / पिरिडीन में मिलीलीटर समाधान मिलीग्राम की एक बूंद) dimethylaminopyridine उत्प्रेरक राशि जोड़ने. इस मिश्रण को, succinic एनहाइड्राइड जोड़ने के लिए, (0.0067 छ, 0.०६६४ mmol) 0.5 मिलीलीटर pyridine 10 मिनट से अधिक बुद्धिमान ड्रॉप में भंग. मिश्रण रातोंरात हिलाओ argon के तहत कमरे के तापमान पर.
  4. एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में ठंड एसीटोन (4 डिग्री सेल्सियस) के 40 मिलीलीटर में मिश्रण वेग, और 27,000 XG पर 15 मिनट के लिए एक Beckman J2-MC अपकेंद्रित्र का उपयोग अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला छानना, और argon कमरे के तापमान पर के साथ निस्तब्धता द्वारा अवशिष्ट एसीटोन हटाने.
  5. Carboxy को सक्रियsuccinimidyl succinate समूहों (एसएस) के साथ मैं समूह, निर्जल DMF के 3 मिलीग्राम में HPG carboxyl functionalized भंग. HPG समाधान के लिए (.0077 छ, ०.०६६४ mmol) N-hydroxysuccinimide और एन, n '- diisopropylcarbodiimide (छ .0084, ०.०६६४ mmol) जोड़ें और मिश्रण argon तहत कमरे के तापमान पर रातोंरात हलचल.
  6. ठंड एसीटोन में तेज़ी से एसएस HPG शुद्ध.
  7. Argon साथ निस्तब्धता द्वारा अवशिष्ट एसीटोन निकालें.
  8. एनएमआर विश्लेषण संशोधित HPG की पवित्रता और प्रोटॉन (एच 1) carboxyl और एसएस functionalization की डिग्री का निर्धारण करते हैं.

बी पूरे रक्त संग्रह और लाल रक्त कोशिकाओं के पृथक्करण (RBCs)

  1. एक साइट्रेट vacutainer ट्यूब में सहमति दे दी है स्वस्थ मानव दाताओं से पूरे रक्त (40% hematocrit, 3 मिलीग्राम) ले लीजिए.
  2. 4 मिनट के लिए 1000 XG पर साइट्रेट ट्यूब अपकेंद्रित्र.
  3. तैरनेवाला कि प्लाज्मा और प्लेटलेट्स शामिल निकालें, और मध्यवर्ती buffy कोट कि सफेद रक्त कोशिकाओं और plateleटीएस एक पाश्चर विंदुक का उपयोग.
  4. एक 12 मिलीलीटर फाल्कन अपकेंद्रित्र ट्यूब में पैक लाल रक्त कोशिकाओं (80% hematocrit, 1.2 मिलीलीटर) स्थानांतरण, और PBS बफर (8 मिलीग्राम, 8.0 पीएच =) जोड़ने के लिए लाल रक्त कोशिकाओं को धो लो.
  5. उलटा द्वारा RBCs मिक्स वर्दी सेल वितरण प्राप्त करने के लिए.
  6. 4 मिनट के लिए 1000 XG पर बाज़ ट्यूब अपकेंद्रित्र, और तैरनेवाला हटा दें.
  7. पीबीएस दो बार के साथ चरण 5 और 6 दोहरा द्वारा लाल रक्त कोशिकाओं को धो लें.
  8. 1.6 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में (100 μl) RBCs पैक, और PBS बफर (300 μl, पीएच 8.0 =) जोड़ने के लिए 20% hematocrit RBCs प्राप्त.

सी. HPG RBCs ग्राफ्टिंग

  1. तुरंत कदम A6 में एसीटोन में संशोधित HPG, जगह की तेज़ी के बाद एक गिलास (1 घूंट) शीशी, और यह PBS बफर (300 μl, पीएच 8.0 =) में भंग में एसएस HPG (150 मिलीग्राम).
  2. 20% hematocrit में जोड़ें एसएस HPG बहुलक समाधान RBCs धोया 400 μl और एसएस HPG एकाग्रता कि 0.5 मिमी से 3 मिमी पर्वतमाला की एक अंतिम मात्रा प्राप्त. उदाहरण के लिए 0.5 मिमी के साथ इलाज के लाल रक्त कोशिकाओं को तैयार करने के लिए एसएसHPG, धोया आरबीसी से पीबीएस के 36 μl हटाने और एसएस HPG बहुलक समाधान के 36 μl जगह.
  3. भंवर धीरे निलंबन और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक कक्षीय हिलनेवाला पर Eppendorf ट्यूब जगह.
  4. 4 मिनट के लिए 1000 XG पर Eppendorf ट्यूबों अपकेंद्रित्र, और बाहर तैरनेवाला विंदुक.
  5. पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें RBCs धोने, अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटाने.
  6. 1 मिलीग्राम खारा जोड़ें और 5 चरण में दो बार के रूप में लाल रक्त कोशिकाओं धो लो.
  7. पैक RBCs की 100 μl (80% hematocrit) 20% hematocrit की एक अंतिम एकाग्रता खारा के 300 μl जोड़ें.

डी. संशोधित RBCs HPG की विशेषता

मैं पूरक मध्यस्थता lysis

  1. BD vacutainer कांच सीरम ट्यूब में स्वस्थ मानव दाताओं से पूरे रक्त का लगभग 8 मिलीग्राम ले लीजिए, और थक्का करने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए रक्त की अनुमति.
  2. 10 मिनट के लिए 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब और सीरम के लगभग 3 मिलीलीटर इकट्ठा.
  3. SERU की एक मिली लीटरएक पानी के स्नान में 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए गर्मी निष्क्रिय सीरम तैयार रखा गया था.
  4. एक Eppendorf ट्यूब कि 20% hematocrit HPG संशोधित RBCs या असंशोधित लाल रक्त कोशिकाओं के 60 μl होते में ताजा सीरम या गर्मी निष्क्रिय सीरम के 60 μl जोड़ें.
  5. 37 में 1 घंटे के लिए लाल रक्त कोशिकाओं को सेते डिग्री सेल्सियस
  6. सेल निलंबन में हीमोग्लोबिन की मात्रा, 96 अच्छी तरह से थाली में तीन प्रतियों में संशोधित RBCs या असंशोधित कोशिकाओं HPG की 20% hematocrit की जगह 5.9 μl यों. है Drabkin अभिकर्मक (एक अभिकर्मक कि हीमोग्लोबिन की राशि spectrophotomerically मात्रा ठहराना करने के लिए प्रयोग किया जाता है) के 294 μl जोड़ें. में और बाहर pipetting द्वारा Drabkin अभिकर्मक के साथ कोशिकाओं मिक्स. 540 स्पेक्ट्रा MAX 190 प्लेट रीडर का उपयोग एनएम में हीमोग्लोबिन cyanoderivative की absorbance उपाय.
  7. तैरनेवाला में हीमोग्लोबिन की मात्रा के लिए, 1 मिनट के लिए 13,000 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. जगह एक 96 अच्छी तरह से थाली में तीन प्रतियों में सतह पर तैरनेवाला के 50 μl. Drabkin अभिकर्मक के 250 μl जोड़ें. Drabkin अभिकर्मक के साथ मिक्स कोशिकाओंमें और बाहर pipetting द्वारा. 540 स्पेक्ट्रा MAX 190 प्लेट रीडर का उपयोग एनएम में हीमोग्लोबिन cyanoderivative की absorbance उपाय.
  8. तैरनेवाला में हीमोग्लोबिन के अनुपात (7 कदम) और कुल हीमोग्लोबिन (6 कदम) 8, 11, 12 नमूने में से lysed कोशिकाओं की मात्रा.

द्वितीय. बड़ी और छोटी टन कार्ड का उपयोग प्रतिजनों के छलावरण

  1. जगह एक Eppendorf ट्यूब में HPG संशोधित (10% hematocrit) आरबीसी, 1 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र के 50 μl, और तैरनेवाला हटा दें.
  2. सेल गोली टन तनुकारक (वस्तु) के 110 μl जोड़ें और में और बाहर pipetting द्वारा सेल निलंबन homogenize.
  3. प्रत्येक मिनी जेल स्तंभ सेल निलंबन के 11 μl जोड़ें. इसके अलावा के दौरान जेल को छूने से बचें.
  4. टन एक अपकेंद्रित्र कार्ड धारक में कार्ड का पता लगाएँ, और 6 मिनट के लिए 156 XG पर अपकेंद्रित्र.
  5. सतह प्रतिजनों के संरक्षण मिनी जेल स्तंभ में आरबीसी के स्थान से निर्माण के आधार पर निर्धारित किया जाता है,विवरण आर.

III. जलीय चरण दो विभाजन माप

  1. Dextran 500/8 खूंटी केडीए दो चरण जुदाई प्रणाली (5% dextran 500k, 4% 8K खूंटी, 150 मिमी NaCl, 10 मिमी फॉस्फेट) 13 के अनुसार बना केडीए तैयार.
  2. एक दो चरण प्रणाली (नीचे में dextran) प्राप्त करने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 433 XG पर अपकेंद्रित्र.
  3. दो चरणों के ध्यान से अलग.
  4. अशेष भाजक एक लेबल ट्यूब (अवतल नीचे के साथ) में ऊपरी खूंटी चरण के 1.0 मिलीग्राम, 20% hematocrit HPG संशोधित आरबीसी की 20 μl, और मिश्रण कोशिकाओं धीरे जोड़ने flicking द्वारा.
  5. ऊपरी चरण है कि एक कम चरण के 0.5 मिलीलीटर सेल होते हैं, और प्रणाली flicking द्वारा धीरे मिश्रण के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें.
  6. बेंच पर ~ के लिए अलग, और तंत्र में कोशिकाओं के स्थान का निर्धारण करने के लिए इस प्रणाली के लिए 2 मिनट के लिए ट्यूब रखें. लाल रक्त कोशिकाओं का स्थानीयकरण (ऊपरी खूंटी चरण में, कम dextran चरण में या दोनों में) संशोधन और आणविक की डिग्री करने के लिए समारोह हैHPG का वजन.

चतुर्थ. आसमाटिक कमजोरी माप

  1. NaCl समाधान सांद्रता कि 0 से 0.9% (w / v) सीमा के साथ तैयार है.
  2. NaCl समाधान के 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में 0.4 प्लेस मिलीलीटर.
  3. NaCl समाधान में लाल रक्त कोशिकाओं (20% hematocrit) के 20 μl जोड़ें.
  4. उलटा और उन्हें एक पानी के स्नान में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर जगह द्वारा मिक्स ध्यान कोशिकाओं.
  5. कोशिकाओं सावधानी से स्थगित उलटा द्वारा. आरबीसी निलंबन की 50 μl लो और यह 1 मिलीग्राम Drabkin अभिकर्मक, एक क्युवेट में रखा जोड़ने. में और बाहर pipetting द्वारा Drabkin अभिकर्मक के साथ कोशिकाओं मिक्स. 540 एनएम का उपयोग कर Beckman कल्टर 730 यूवी / विज़ पाठक ड्यू के में हीमोग्लोबिन cyanoderivative की absorbance उपाय.
  6. तैरनेवाला में हीमोग्लोबिन की मात्रा के लिए, 1 मिनट के लिए 1000 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. क्युवेट में है Drabkin अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर तैरनेवाला के 200 μl जोड़ें. में और बाहर pipetting द्वारा Drabkin अभिकर्मक के साथ कोशिकाओं मिक्स. Hemogl की absorbance उपायBeckman कल्टर 730 यूवी / विज़ पाठक ड्यू का उपयोग कर 540 एनएम पर obin cyanoderivative.
  7. तैरनेवाला में राशि हीमोग्लोबिन का अनुपात (6 कदम) से अलग NaCl समाधान में कोशिका निलंबन (5 कदम) में हीमोग्लोबिन की कुल राशि lysed कोशिकाओं की राशि की गणना.

रीसस डी के संरक्षण (RhD) प्रतिजन - वी. प्रवाह cytometry माप

  1. नियंत्रण के 5 μl या HPG पीबीएस 0.5% 25 μl की कुल मात्रा BSA के साथ पूरक बफर को तीन प्रतियों में संशोधित लाल रक्त कोशिकाओं (20% hematocrit) जोड़ें.
  2. FITC मोनोक्लोनल विरोधी रीसस डी) (RhD भागफल Biodiagnostics (PA, संयुक्त राज्य अमरीका) से खरीदे गए 25 μl जोड़ें.
  3. एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं.
  4. 1.5 मिलीलीटर PBS बफर दो बार के साथ मिश्रण धो लें. 1 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र तैरनेवाला हटाने.
  5. 1 मिलीग्राम खारा में लाल रक्त कोशिकाओं को स्थगित, और 4 मिलीलीटर प्रवाह BD प्रवाह cytometry ट्यूब में निलंबन हस्तांतरण.
  6. विश्लेषण का उपयोग कर FACSCanto द्वितीय फ़्लो, w कोशिकामापी आरबीसी नियंत्रण गेट पर 5,000 घटनाओं को प्राप्त करने और विश्लेषण के लिए पूरे घटनाओं का उपयोग करें.

छठी. प्रवाह cytometry माप की अभिव्यक्ति CD47 -

  1. नियंत्रण के 1.54 μl या HPG पीबीएस 0.5% 44 μl की कुल मात्रा BSA के साथ पूरक बफर को तीन प्रतियों में संशोधित लाल रक्त कोशिकाओं (20% hematocrit) जोड़ें.
  2. Phycoerythrin (पीई) के 6 μl माउस विरोधी मानव बी.डी. बायोसाइंसेज (न्यू जर्सी, संयुक्त राज्य अमरीका) से खरीदा CD47 लेबल जोड़ें.
  3. एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं.
  4. दो बार के लिए 1.5 मिलीलीटर PBS बफर के साथ मिश्रण धो लें. 1 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र तैरनेवाला हटाने.
  5. 1 मिलीग्राम खारा में लाल रक्त कोशिकाओं को स्थगित और जी 26 5/8 सुई के माध्यम से पारित करने के लिए कम से कम सेल clumping.
  6. 4 मिलीलीटर प्रवाह BD प्रवाह cytometry ट्यूब में निलंबन स्थानांतरण.
  7. विश्लेषण का उपयोग कर FACSCanto द्वितीय प्रवाह cytometer, आरबीसी नियंत्रण गेट पर 10,000 घटनाओं प्राप्त.

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Representative Results

रीसस डी प्रतिजन और CD47 आरबीसी सतह प्रोटीन की छलावरण प्रवाह cytometry फ्लोरोसेंट लेबल मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया है, और एक प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1 में दी गई है. HPG grafted लाल रक्त कोशिकाओं के मामले में (ग्रे), संकेत की तीव्रता नियंत्रण लाल रक्त कोशिकाओं (लाल और हरे रंग का) कोशिका की सतह के लिए एंटीबॉडी के लिए बाध्य करने में कमी का संकेत है जो सतह प्रोटीन की मास्किंग का संकेत की तुलना में कमी हुई (छोड़ दिया करने के लिए स्थानांतरित कर दिया शिखर) .

चित्रा 1
चित्रा 1 सतह प्रतिजनों और प्रोटीन प्रवाह cytometry का उपयोग छलावरण का मूल्यांकन. एक रीसस डी) (RhD) सुरक्षा: काले छायांकित शिखर नकारात्मक नियंत्रण (गैर संशोधित RBCs IgG1 पीई लेबल के साथ इलाज किया) का प्रतिनिधित्व करता है, कठफोड़ा सकारात्मक सह का प्रतिनिधित्व करते हैंntrol (गैर संशोधित RBCs विरोधी RhD फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ इलाज किया), और ग्रे शिखर HPG संशोधित विरोधी RhD फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का एक ही राशि के साथ इलाज के लाल रक्त कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है. बी) CD47: काला छायांकित शिखर नकारात्मक नियंत्रण (गैर संशोधित RBCs IgG1 पीई लेबल के साथ इलाज) का प्रतिनिधित्व करता है, लाल चोटी सकारात्मक नियंत्रण (गैर संशोधित RBCs विरोधी CD47 फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ इलाज किया) का प्रतिनिधित्व करते हैं, और ग्रे शिखर का प्रतिनिधित्व करता है HPG संशोधित विरोधी CD47 फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का एक ही राशि के साथ इलाज RBCs. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

यूनिवर्सल दाता लाल रक्त कोशिकाओं को रक्त और रक्त आधान चिकित्सा के लिए उपलब्धता और सुरक्षा बढ़ाने में काफी संभावना है. लाल रक्त कोशिकाओं को भी दवा का वादा वितरण वाहनों उनके लंबे परिसंचरण और निहित biocompatibility 14, 15 के कारण माना जाता है. इस पत्र में प्रस्तुत प्रयोगों HPG संशोधित लाल रक्त कोशिकाओं की इन विट्रो विशेषताओं में मूल्यांकन. इन विट्रो गुणों में और HPG संशोधित RBCs की vivo संचलन में हमारे समूह में 11 8, हाल ही में किया गया है की जांच की. Dextran500K/PEG8K जलीय दो चरण प्रणाली, NaCl और सोडियम फास्फेट के साथ पूरक, में लाल रक्त कोशिकाओं के विभाजन एरिथ्रोसाइट सतह के प्रभारी और सतह glycoprotein 16 संरचना पर निर्भर करता है. HPGs साथ आरबीसी glycocalyx संशोधन की सीमा पर निर्भर करता है, संशोधित RBCs कम dextran से ऊपरी खूंटी चरण में विभाजन करने के लिए करते हैं. दो चरण आरबीसी सतह संशोधन की सीमा के एक सतही मूल्यांकन प्रणाली प्रदान करता है. Lysis ओच ऑटोलॉगस सीरम में लाल रक्त कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण जांच करने, है कि संशोधित RBCs HPG सक्रियण पूरक से चलाता है, कोशिकाओं के जैविक और सतहों के लिए नई सामग्री को शुरू करने के बाद से उन्हें विदेशी और प्रतिरक्षा प्रणाली मध्यस्थता lysis और निकासी 17 के अधीन renders परीक्षण है. आसमाटिक कमजोरी प्रयोग, दूसरे हाथ पर इंगित करता है, चाहे यांत्रिक गुणों और आरबीसी झिल्ली की विरूपता ग्राफ्टिंग HPG का एक परिणाम के रूप में समझौता किया गया है. लाल रक्त कोशिकाओं की विरूपता ओ 2 प्रसव के शारीरिक समारोह के लिए शरीर के विभिन्न भागों के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रयोग में संशोधित RBCs NaCl के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज, और lysed कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़ाता विरूपण तनाव को उजागर कर रहे हैं.

प्रवाह cytometry आरबीसी की सतह पर अपनी इसी फ्लोरोसेंट ला के साथ एक विशेष प्रतिजन प्रतिक्रिया सतह प्रतिजन और सतह प्रोटीन संरक्षण (1 चित्रा) की हद तक का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता हैएंटीबॉडी belled. हद रीसस डी प्रतिजन संरक्षण के प्रवाह cytometry का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाता है. प्रतिजनों की मास्किंग एंटीबॉडी में लाल रक्त कोशिकाओं के लिए बाध्य कमी से स्पष्ट है. रीसस डी प्रतिजन मास्किंग भी टन कार्ड द्वारा मूल्यांकन किया है. टन कार्ड व्यापक रूप से लाल रक्त कोशिकाओं की phenotyping के लिए अस्पतालों में रुधिर विज्ञान प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, जब एक समूह आरबीसी A-प्रकार टन कार्ड में स्थित है, कोशिकाओं इसी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया का एक परिणाम के रूप में चिपका हुआ. हालांकि, बी समूह के रक्त सरेस से जोड़ा और नहीं करता है मिनी जेल के नीचे के लिए यात्रा है. समूहन की अवधारणा कि ग्राफ्टिंग HPG लाल रक्त कोशिकाओं के लिए प्रदान करता है सुरक्षा के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. HPG grafted RBCs मिनी जेल स्तंभ प्रवेश, सतह प्रतिजन संरक्षण के स्तर पर निर्भर करता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस शोध कनाडा के रक्त सेवा (सीबीएस) और स्वास्थ्य विज्ञान (CIHR) अनुसंधान भागीदारी फंड की कनाडा के संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया था. लेखकों UBC केंद्र में रक्त अनुसंधान के लिए अपने अनुसंधान सुविधाओं के उपयोग के लिए LMB Macromolecule हब धन्यवाद. बुनियादी सुविधा नवाचार के लिए कनाडा फाउंडेशन (CFI) और स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए माइकल स्मिथ फाउंडेशन (MSFHR) द्वारा समर्थित है. आर Chapanian (CIHR / सीबीएस) रक्ताधान विज्ञान में postdoctoral फैलोशिप और MSFHR अनुसंधान प्रशिक्षु पोस्ट डॉक्टरेट फेलोशिप के एक प्राप्तकर्ता के एक प्राप्तकर्ता है. जे.एन. Kizhakkedathu MSFHR कैरियर अन्वेषक विद्वान पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycidol Sigma Aldrich (ON, Canada)
Trimethylolpropane Fluka (ON, Canada)
Potassium methylate Sigma Aldrich (ON, Canada)
Anhydrous pyridine Sigma Aldrich (ON, Canada)
4-Dimethylaminopyridine Sigma Aldrich (ON, Canada)
Succinic anhydride Sigma Aldrich (ON, Canada)
Acetone Fisher Scientific (ON, Canada)
Anhydrous dimethyl formamide Sigma Aldrich (ON, Canada)
N-Hydroxysuccinimide Sigma Aldrich (ON, Canada)
N,N'-Diisopropylcarbodiimide Sigma Aldrich (ON, Canada)
MTS cards Micro Typing System (MTS) cards (FL, USA)
Dextran 500 kDa Pharmacia Fine Chemicals (Sweden)
PEG 8 kDa Sigma Aldrich (ON, Canada)
FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD) Quotient Biodiagnostics (PA, USA)
PE monoclonal anti-CD47 BD Biosciences (NJ, USA)
Drabkin's reagent Sigma Aldrich (ON, Canada)
Table. Chemicals and reagents used for the grafting of HPG polymers to RBC membrane and their analysis.

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References

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Chapanian, R., Constantinescu, I.,… More

Chapanian, R., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols. J. Vis. Exp. (71), e50075, doi:10.3791/50075 (2013).

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