Gli antigeni Protetto funzionali globuli rossi dalla membrana innesto di Compact Poligliceroli Hyperbranched

Summary

La modifica membrana cellulare dei globuli rossi (RBC) con poliglicerolo hyperbranched (HPG) è presentato. RBC modificati sono stati caratterizzati da due partizionamento fase acquosa, la fragilità osmotica e lisi complemento mediata. Il camuffamento di proteine ​​di superficie e degli antigeni è stata valutata utilizzando la citometria a flusso e sistema Micro Typing (MTS) carte fenotipizzazione sangue.

Abstract

Globuli rossi (RBC) trasfusione è vitale per il trattamento di una serie di problemi medici acuti e cronici come talassemia e anemia falciforme ^1-3. A causa della presenza di numerosi antigeni sulla superficie RBC (~ 308 antigeni noti ^4), pazienti in terapia cronica trasfusione sviluppano alloanticorpi causa della partita miss di antigeni minori di eritrociti trasfusi ^{4, 5.} Innesto di polimeri idrofili come polietilene glicole (PEG) e poliglicerolo hyperbranched (HPG) forma uno strato di esclusione sulla membrana RBC che previene l'interazione di anticorpi con antigeni di superficie senza influenzare il passaggio di piccole molecole come l'ossigeno, glucosio, e ioni ^3. Attualmente è disponibile alcun metodo per la generazione di globuli rossi donatori universali in parte a causa della difficile sfida presentata dalla presenza di un gran numero di antigeni (proteine ​​e carboidrati base) sulla superficie RBC e la dviluppo di tali metodi migliorerà in modo significativo la sicurezza delle trasfusioni, e drammaticamente migliorare la disponibilità e l'uso di globuli rossi. In questa relazione, gli esperimenti che vengono utilizzati per sviluppare antigene RBC funzionali protetti dalla membrana innesto di HPG e loro caratterizzazione vengono presentati. HPGs sono altamente biocompatibili polimeri compatte ^{6, 7,} e dovrebbero essere situata all'interno della cella glicocalice che circonda la membrana lipidica ^{8, 9} e maschera RBC antigeni di superficie ^{10, 11.}

Protocol

A. Modifica poliglicerolo Hyperbranched (SS-HPG)

1. Posto liofilizzato HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) in un pallone a fondo tondo e asciugare una notte sotto vuoto a 90 ° C.
2. Refrigerare il matraccio a temperatura ambiente, e sciogliere il HPG essiccato in piridina anidra (3 ml).
3. Per funzionalizzare circa otto gruppi ossidrilici su HPG con gruppi carbossilici, aggiungere quantità catalitica di dimetilamminopiridina (una goccia di 5 mg / ml di soluzione in piridina) alla soluzione HPG. A questa miscela, aggiungere anidride succinica, (0,0067 g, 0,0664 mmol) sciolto in 0,5 ml di piridina saggio goccia in 10 minuti. Agitare la miscela per una notte a temperatura ambiente sotto argon.
4. Precipitare il composto in 40 ml di acetone freddo (4 ° C) in un tubo da centrifuga da 50 ml e centrifugare utilizzando un Beckman J2-MC centrifugare a 27.000 xg per 15 min. Decantare il supernatante, e rimuovere acetone residuo mediante flussaggio con argon a temperatura ambiente.
5. Per attivare il carbossil con gruppi succinimidil succinato (SS) gruppi, sciogliere il carbossile-funzionalizzato HPG in 3 ml di DMF anidra. Aggiungere N-idrossisuccinimmide (0,0077 g, 0,0664 mmoli) e N, N'-diisopropilcarbodiimmide (0,0084 g, 0,0664 mmoli) alla soluzione HPG e agitare la miscela per una notte a temperatura ambiente sotto argon.
6. Purificare il SS-HPG per precipitazione in acetone freddo.
7. Rimuovere residui di acetone mediante flussaggio con argon.
8. Determinare la purezza HPG modificato e il grado di funzionalizzazione carbossile e SS dal protone ⁽¹ H) - analisi NMR.

B. raccolta di sangue intero e la separazione dei globuli rossi (RBC)

1. Raccogliere il sangue intero (40% Ematocrito, 3 ml) da acconsentito donatori umani sani in una provetta vacutainer citrato.
2. Centrifugare la provetta citrato a 1.000 xg per 4 min.
3. Rimuovere il surnatante contenente plasma e piastrine, e la mano intermedia buffy che contiene i globuli bianchi e platelets usando una pipetta Pasteur.
4. Trasferire i globuli rossi imballati (80 Ematocrito%, 1,2 ml) in una centrifuga tubo da 12 ml Falcon, e aggiungere tampone PBS (8 ml, pH = 8.0) per lavare i globuli rossi.
5. Mescolare globuli rossi per inversione di ottenere una distribuzione uniforme delle cellule.
6. Centrifugare la provetta Falcon a 1.000 xg per 4 minuti e rimuovere il surnatante.
7. Lavare i globuli rossi con PBS due volte ripetendo i passaggi 5 e 6.
8. Luogo imballato-GR (100 pl) in 1.6 ml di tubo Eppendorf, e aggiungere tampone PBS (300 ml, pH = 8.0) per ottenere 20% di globuli rossi ematocrito.

C. HPG innesto di globuli rossi

1. Subito dopo precipitazione di HPG modificato in acetone in A6 passo, posto SS-HPG (150 mg) in una fiala di vetro (1 DRAM), e farla sciogliere in tampone PBS (300 pl, pH = 8,0).
2. Aggiungere SS-HPG soluzione di polimero in 20% Ematocrito globuli rossi lavati per ottenere un volume finale di 400 microlitri e SS-HPG concentrazione che va da 0,5 mm a 3 mm. Ad esempio, per preparare i globuli rossi trattati con 0.5 mM SS-HPG, rimuovere 36 microlitri di PBS dal lavato RBC e mettere 36 ml di SS-HPG soluzione polimerica.
3. Vortex la sospensione delicatamente e posizionare i tubi Eppendorf in un agitatore orbitale a temperatura ambiente per 1 ora.
4. Centrifugare le provette Eppendorf a 1.000 xg per 4 min, e pipettare il supernatante.
5. Aggiungere 1 ml di PBS per lavare eritrociti, centrifugare e rimuovere il surnatante.
6. Aggiungere 1 ml di soluzione salina e lavare due volte globuli rossi come al punto 5.
7. Aggiungere 300 ml di soluzione salina per 100 pl di RBC confezionati (80 Ematocrito%) ad una concentrazione finale del 20% di ematocrito.

Caratterizzazione D. HPG Modificata globuli rossi

I. Complemento lisi mediata

1. Raccogliere circa 8 ml di sangue intero da donatori umani sani in provetta BD Vacutainer vetro siero, e permettere al sangue di coagulare a temperatura ambiente per 30 min.
2. Centrifugare la provetta a 2000 xg per 10 minuti e raccogliere circa 3 ml di siero.
3. Un millilitro di serum è stato posto in un bagno di acqua a 60 ° C per 30 minuti per preparare siero inattivato al calore.
4. Aggiungere 60 ml di siero fresco o di calore siero inattivato in una provetta Eppendorf che contiene 60 ml di 20% di ematocrito RBC HPG modificati o di globuli rossi non modificati.
5. Incubare RBC per 1 ora a 37 ° C.
6. Per quantificare la quantità di emoglobina nella sospensione cellulare, posto 5,9 ml di 20% di ematocrito HPG RBC modificati o non modificati cellule in triplicato a 96 pozzetti. Aggiungere 294 pl di reagente Drabkin (un reagente che viene utilizzato per quantificare la quantità di emoglobina spectrophotomerically). Mescolare celle con reagente Drabkin di pipettando dentro e fuori. Misurare l'assorbanza della cyanoderivative emoglobina a 540 nm usando SPECTRA max 190 lettore di piastre.
7. Per quantificare la quantità di emoglobina nel sovranatante, centrifugare le cellule a 13.000 xg per 1 min. Posto 50 pl di surnatante in triplicato in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 250 microlitri di reagente di Drabkin. Cellule Mix tra il reagente di Drabkinpipettando dentro e fuori. Misurare l'assorbanza della cyanoderivative emoglobina a 540 nm usando SPECTRA max 190 lettore di piastre.
8. Quantificare la quantità di cellule lisate dal rapporto di emoglobina nel surnatante (passo 7) e dell'emoglobina totale nel campione (passo 6) ^{8, 11, 12.}

II. Il camuffamento di antigeni maggiori e minori che utilizzano carte di MTS

1. Posto 50 pl di HPG modified RBC (10% di ematocrito) in una provetta Eppendorf, centrifugare a 1000 xg per 1 minuto, e rimuovere il surnatante.
2. Aggiungere 110 pl di MTS diluente al pellet e omogeneizzare la sospensione cellulare da pipettando.
3. Aggiungere 11 ml di sospensione cellulare a ogni colonna di gel mini. Evitare di toccare il gel durante l'aggiunta.
4. Individuare le carte MTS in un titolare della carta centrifuga e centrifugare a 156 xg per 6 min.
5. Protezione degli antigeni di superficie è determinata dalla posizione della RBC nella colonna di gel mini, basato sulla fabbricazioner descrizione.

III. Acquose, due di fase partizioni misurazioni

1. Preparare Destrano 500 kDa / PEG 8 kDa due sistemi di separazione di fase composto (5% destrano 500k, 4% PEG 8K, 150 mM NaCl, 10 mM di fosfato) secondo ^13.
2. Centrifugare a 433 xg per 10 min a temperatura ambiente per ottenere un sistema a due fasi (destrano in basso).
3. Separare le due fasi con attenzione.
4. Aliquota 1,0 ml della fase di PEG superiore in una provetta (con fondo concavo), aggiungere 20 ml di 20% di ematocrito HPG modificato RBC, e le cellule Mescolare delicatamente sfogliando.
5. Aggiungere 0,5 ml della fase superiore che contengono celle a 0,5 ml di una fase inferiore, il sistema e mescolare delicatamente sfogliando.
6. Posizionare il tubo sul banco per ~ 2 min per il sistema di separare, e determinare la posizione delle celle nel sistema. Localizzazione di globuli rossi (in fase di PEG superiore, nella fase inferiore destrano o in entrambi) è funzione del grado di modifica e molecolarepeso di HPG.

IV. Misure di fragilità osmotica

1. Preparare soluzioni di NaCl con concentrazioni che vanno da 0 a 0,9 (w / v)%.
2. Luogo 0,4 ml di soluzioni di NaCl in 1,5 ml provette Eppendorf.
3. Aggiungere 20 ml di globuli rossi (ematocrito 20%) nelle soluzioni di NaCl.
4. Cellule Mescolare con cura per inversione e metterli in un bagno d'acqua a 37 ° C per 30 min.
5. Sospendere le cellule con attenzione per inversione. Prendere 50 pl di sospensione di RBC e aggiungerlo a un reagente 1 ml Drabkin, posta in una cuvetta. Mescolare celle con reagente Drabkin di pipettando dentro e fuori. Misurare l'assorbanza della cyanoderivative emoglobina a 540 nm usando BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS lettore.
6. Per quantificare la quantità di emoglobina nel sovranatante, centrifugare le cellule a 1.000 xg per 1 min. Aggiungere 200 pl di surnatante a 1 ml di reagente Drabkin in una cuvetta. Mescolare celle con reagente Drabkin di pipettando dentro e fuori. Misurare l'assorbanza della hemoglObin cyanoderivative a 540 nm usando BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS lettore.
7. Calcolare la quantità di cellule lisate in soluzione di NaCl diverso dal rapporto tra la quantità di emoglobina nel surnatante (passo 6) per la quantità totale di emoglobina nella sospensione cellulare (fase 5).

V. misure di flusso di citometria - Protezione dei Rh-D (Rh) antigene

1. Aggiungere 5 l di controllo o HPG RBC modificati (20% di ematocrito) in triplicato per tampone PBS supplementato con 0,5% BSA ad un volume totale di 25 microlitri.
2. Aggiungere 25 ml di FITC monoclonale anti-Rhesus D (Rh) acquistato da Quoziente Biodiagnostics (PA, USA).
3. Incubare la miscela per 30 min a 37 ° C in un bagno d'acqua.
4. Lavare la miscela con 1,5 ml di tampone PBS due volte. Centrifugare a 1000 xg per 1 minuto per eliminare il sopranatante.
5. Sospendere i globuli rossi in 1 ml di soluzione salina, e trasferire la sospensione in tubo da 4 ml di citometria a flusso BD flusso.
6. Analizzare con FACSCanto II flow citometro, l'acquisizione di 5.000 eventi sul cancello RBC di controllo e utilizzare interi eventi per l'analisi.

VI. Citometria di flusso misure - espressione di CD47

1. Aggiungere 1,54 ml di controllo o HPG RBC modificati (20% di ematocrito) in triplicato per tampone PBS supplementato con 0,5% BSA ad un volume totale di 44 microlitri.
2. Aggiungere 6 ml di ficoeritrina (PE) marcato topo anti-CD47 umani acquistati da BD Biosciences (NJ, USA).
3. Incubare la miscela per 30 min a 37 ° C in un bagno d'acqua.
4. Lavare la miscela con 1,5 ml di tampone PBS per due volte. Centrifugare a 1000 xg per 1 minuto per eliminare il sopranatante.
5. Sospendere i globuli rossi in 1 ml di soluzione salina, e passare al 26 G 5/8 aghi per ridurre al minimo aggregazione cellulare.
6. Trasferire la sospensione in tubo da 4 ml di citometria a flusso BD flusso.
7. Analizzare con FACSCanto citofluorimetro II, l'acquisizione di 10.000 eventi sul cancello RBC controllo.

Representative Results

Mascherano di antigene Rhesus D e CD47 proteina di superficie RBC sono stati quantificati mediante citometria a flusso utilizzando fluorescenti anticorpi monoclonali marcati, e un risultato rappresentativo è riportato in figura 1. In caso di HPG-innestati GR (grigio), l'intensità del segnale è diminuito (picco spostato a sinistra) rispetto al controllo RBC (rosso e verde) indica una riduzione nel legarsi agli anticorpi di superficie cellulare che indicano il mascheramento delle proteine ​​di superficie .

Figura 1. Valutazione del camuffamento di antigeni di superficie e proteine ​​in citometria a flusso. A) Rhesus D (Rh) Protezione: Nero picco ombreggiata rappresenta il controllo negativo (non modificati globuli rossi trattati con PE-marcato IgG1), il picco verde rappresentano la co positivontrol (non modificati emazie trattate con anti-Rh anticorpo fluorescente), e il picco di grigi rappresenta HPG RBC modificati trattati con la stessa quantità di anticorpo anti-Rh fluorescente. B) CD47: Nero picco ombreggiata rappresenta il controllo negativo (non modificati RBC trattato con PE-marcato IgG1), il picco rosso rappresentare il controllo positivo (non modificati emazie trattate con anti-CD47 anticorpo fluorescente), e il picco di grigi rappresenta HPG GR modificati trattati con la stessa quantità di anti-CD47 anticorpo fluorescente. Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussion

RBC donatori universali hanno un grande potenziale disponibilità del sangue ed il di sicurezza per la terapia trasfusionale. Globuli rossi sono considerati promettenti veicoli di somministrazione di farmaci per la loro circolazione lungo e biocompatibilità intrinseca ^{14, 15.} Esperimenti presentati in questo documento valutare la caratteristiche in vitro di HPG RBC modificati. La proprietà in vitro e in vivo di circolazione HPG globuli rossi modificati sono stati studiati nel nostro gruppo ha recentemente ^{8, 11.} La partizione di RBC nel sistema acquoso fase Dextran500K/PEG8K due, integrato con NaCl e sodio fosfato, dipende dalla carica superficiale eritrociti e sulla composizione della superficie glicoproteina ^16. A seconda della portata di RBC glicocalice modifica con HPGs, RBC modificati tendono a partizione dalla parte inferiore destrano alla fase PEG superiore. Il sistema a due fasi fornisce una facile valutazione dell'entità della modifica superficiale RBC. Lisi of globuli rossi nel siero autologo è prova significativa di indagare, se i globuli rossi HPG modificati provoca l'attivazione del complemento, dal momento che l'introduzione di nuovi materiali per le cellule e superfici biologiche li rende estera e soggetti a lisi mediata sistema immunitario e di liquidazione ^17. L'esperimento fragilità osmotica, invece, indica se le proprietà meccaniche e la deformabilità della membrana RBC è stata compromessa a seguito di HPG innesto. La deformabilità dei globuli rossi è importante per la funzione fisiologica di O ₂ in diverse parti del corpo. In questo esperimento i globuli rossi modificati sono esposti a sollecitazioni di deformazione per trattamento con diverse concentrazioni di NaCl, e quantificazione percentuale di cellule lisate.

Citometria di flusso viene utilizzato per valutare il grado di proteina dell'antigene di superficie e protezione superficiale (Figura 1) per reazione di un particolare antigene sulla superficie di RBC con il suo corrispondente fluorescente-labelled anticorpo. Il grado di protezione antigene Rhesus D viene valutata in citometria a flusso. Il mascheramento degli antigeni è evidente dalla diminuzione legame dell'anticorpo alle RBC. Mascheramento antigene Rhesus D viene valutata anche da schede MTS. MTS carte sono ampiamente utilizzati nei laboratori ematologici negli ospedali per fenotipizzazione dei globuli rossi. Ad esempio, quando un gruppo-RBC si trova in una scheda tipo MTS, agglutinare cellule come risultato della reazione con l'anticorpo monoclonale corrispondente. Tuttavia, B-gruppo sanguigno non agglutina e viaggia al fondo del gel mini. Il concetto di agglutinazione è stato utilizzato per valutare il livello di protezione che fornisce HPG innesto a RBC. RBC HPG-innestate penetra colonna mini gel, a seconda del livello di protezione antigene di superficie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycidol	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Trimethylolpropane	Fluka		(ON, Canada)
Potassium methylate	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Anhydrous pyridine	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
4-Dimethylaminopyridine	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Succinic anhydride	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Acetone	Fisher Scientific		(ON, Canada)
Anhydrous dimethyl formamide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N-Hydroxysuccinimide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N,N'-Diisopropylcarbodiimide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
MTS cards			Micro Typing System (MTS) cards (FL, USA)
Dextran 500 kDa	Pharmacia Fine Chemicals		(Sweden)
PEG 8 kDa	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD)	Quotient Biodiagnostics		(PA, USA)
PE monoclonal anti-CD47	BD Biosciences		(NJ, USA)
Drabkin's reagent	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Table. Chemicals and reagents used for the grafting of HPG polymers to RBC membrane and their analysis.