Summary
Модификация клеточных мембран красных кровяных телец (эритроцитов) с сверхразветвленных полиглицерина (HPG) представлены. Измененные эритроциты были характерны водной двухфазной разделов, осмотическая хрупкость и дополнения опосредованный лизис. Камуфляж поверхностных белков и антигенов оценивали с помощью проточной цитометрии и Micro System Typing (МТС) карты крови фенотипа.
Abstract
Красные клетки крови (эритроциты) переливание имеет жизненно важное значение для лечения ряда острых и хронических медицинских проблем, таких как талассемия и серповидно-клеточная анемия 1-3. В связи с наличием множества антигенов на поверхности эритроцитов (~ 308 известными антигенами 4), пациентов в хронической терапии переливания крови развиваются аллоантител в связи с матчем мисс незначительных антигенов на переливание эритроцитов 4, 5. Прививка гидрофильные полимеры, такие как полиэтилен гликоля (PEG) и сверхразветвленных полиглицерина (HPG) образует исключения слой на мембране эритроцитов, что препятствует взаимодействию антител с поверхностными антигенами, не влияя на прохождение малых молекул, таких как кислород, глюкоза и ионы 3. В настоящее время ни один метод не доступен для генерации универсальных красных клеток крови донора отчасти из-за сложной проблемы, связанной с наличием большого количества антигенов (белков и углеводов основе) на поверхности эритроцитов и DРАЗВИТИЯ таких методов позволит существенно повысить безопасность переливания, а также значительно улучшить доступность и использование БС. В этом докладе, эксперименты, которые используются для разработки антигена эритроцитов охраняемой функциональной мембраной прививки HPG и их характеристика представлены. HPGs высоко биосовместимые полимеры компактная 6, 7, и ожидается, что находится внутри клетки гликокаликса, которая окружает липидную мембрану 8, 9 и маски РБК поверхностных антигенов 10, 11.
Protocol
А. сверхразветвленных Модификация полиглицеридов (SS-HPG)
- Место лиофилизированный HPG 60 кДа (0,5 г, 0,0083 ммоль) в колбу с круглым дном и просушить в течение ночи под вакуумом при 90 ° C.
- Охладите колбу до комнатной температуры, и распустить сушеные HPG в безводном пиридине (3 мл).
- Для функционализации примерно восемь гидроксильных групп на HPG с карбоксильными группами, добавить каталитическое количество диметиламинопиридина (одна капля 5 мг / мл раствора в пиридине) к HPG решение. К этой смеси добавляют янтарный ангидрид, (0,0067 г, 0,0664 ммоль) растворяли в 0,5 мл пиридина по каплям в течение 10 мин. Смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона.
- Осадок смеси в 40 мл холодного ацетона (4 ° C) в 50 мл центрифужные пробирки и центрифугируют использованием Beckman J2-MC центрифуге при 27000 х г в течение 15 мин. Слейте супернатант, и удалить остатки ацетона путем промывки аргона при комнатной температуре.
- Для активации карбоксильнойл групп с сукцинимидил сукцинат (SS) групп, растворяться карбоксильных функциональных групп HPG в 3 мл безводного DMF. Добавить N-гидроксисукцинимид (0,0077 г, 0,0664 ммоль) и N, N-диизопропилкарбодиимид (0,0084 г, 0,0664 ммоль), HPG решения и размешать смесь на ночь при комнатной температуре в атмосфере аргона.
- Очищают SS-HPG путем осаждения в холодном ацетоне.
- Удалите остатки ацетона путем промывки аргона.
- Определить чистоту изменение HPG и степень карбоксильных и SS функционализации протона (1 H) - ЯМР-анализа.
B. Всего для сбора крови и разъединении красных кровяных телец (эритроцитов)
- Сбор цельной крови (40% Гематокрит, 3 мл) с согласия здоровых человеческих доноров в трубку Vacutainer цитрата.
- Центрифуга цитрат трубы в 1000 х г в течение 4 мин.
- Удалить супернатант, который содержит плазму и тромбоциты, и пальто промежуточных Баффи, которая содержит лейкоциты и plateleTS помощью пипетки Пастера.
- Передача эритроцитарной массы (80% гематокрита, 1,2 мл) в 12 мл центрифужные пробирки Falcon, и добавить PBS буфера (8 мл, рН = 8,0), чтобы вымыть эритроцитов.
- Смешать эритроцитов обращением для получения равномерного распределения клеток.
- Центрифуга трубки сокола в 1000 мкг в течение 4 минут и удалить супернатант.
- Вымойте эритроцитов с PBS еще два раза, повторив шаги 5 и 6.
- Место упакован-БС (100 мкл) в 1,6 мл трубки Эппендорф, и добавить буфера PBS (300 мкл, рН = 8,0) для получения 20% Гематокрит эритроцитов.
C. HPG Прививка в эритроцитах
- Сразу же после осаждения изменение HPG в ацетоне в шаге A6, место SS-HPG (150 мг) в стеклянном флаконе (1 драм) и растворить его в буфере PBS (300 мкл, рН = 8,0).
- Добавить SS-HPG раствор полимера в 20% Гематокрит промывают БС для получения конечного объема 400 мкл и SS-HPG концентрации, которая колеблется от 0,5 мм до 3 мм. Например, чтобы подготовить эритроциты обрабатывают 0,5 мМ SS-HPG, удалить 36 мкл PBS из промытого РБК и поместите 36 мкл СС-HPG раствора полимера.
- Vortex подвеска мягко и поместить Эппендорфа на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Центрифуга Eppendorf трубы при 1000 мкг в течение 4 мин, и пипетки из супернатанта.
- Добавить 1 мл PBS, чтобы вымыть эритроцитов, центрифуги и удалите супернатант.
- Добавить 1 мл физиологического раствора и промыть эритроциты два раза в шаге 5.
- Добавить 300 мкл физиологического раствора до 100 мкл эритроцитарной массы (80% Гематокрит) до конечной концентрации 20% гематокрита.
D. Характеристика HPG изменения эритроцитов
I. Дополнение опосредованный лизис
- Сбор около 8 мл цельной крови здоровых доноров человека в BD Vacutainer стеклянной трубки сыворотки, и позволяет крови свертываться при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Центрифуги трубы при 2000 мкг в течение 10 мин и собирают около 3 мл сыворотки.
- Один миллилитр Серум была помещена в водяную баню при температуре 60 ° С в течение 30 мин для подготовки тепла инактивированной сыворотки.
- Добавить 60 мкл свежей сыворотки или тепла инактивированной сыворотки в трубку Eppendorf, содержащие 60 мкл 20% Гематокрит HPG измененные эритроциты или немодифицированных эритроцитов.
- Инкубируйте эритроцитов в течение 1 часа при 37 ° C.
- Для определения количества гемоглобина в клеточной суспензии, место 5,9 мкл 20% гематокрита HPG изменения эритроцитов или немодифицированных клеток в трех экземплярах в 96-луночный планшет. Добавить 294 мкл реагента Драбкин (в реагент, который используется для определения количества гемоглобина spectrophotomerically). Смешать клеток с реагентом Драбкин в пипетированием и выходит. Измеряют поглощение гемоглобином cyanoderivative при 540 нм с использованием SPECTRA MAX 190 ридер.
- Для определения количества гемоглобина в супернатант, центрифугируют клетки при 13000 х г в течение 1 мин. Место 50 мкл супернатанта в трех экземплярах в 96-луночный планшет. Добавить 250 мкл реагента в Драбкин. Mix клеток с реагентом Драбкин вс помощью пипетки и выходит. Измеряют поглощение гемоглобином cyanoderivative при 540 нм с использованием SPECTRA MAX 190 ридер.
- Определить количество лизированных клеток по отношению гемоглобина в надосадочной жидкости (шаг 7) и общего гемоглобина в образце (шаг 6) 8, 11, 12.
II. Камуфляж крупных и мелких антигенов с помощью карт МТС
- Место 50 мкл HPG изменение РБК (10% гематокрита) в трубку Eppendorf, центрифуги при 1000 х г в течение 1 мин, и удалите супернатант.
- Добавить 110 мкл разбавителя МТС в осадок клеток и однородной суспензии клеток с помощью пипетки и выходит.
- Добавить 11 мкл суспензии клеток в каждой мини-колонки гель. Старайтесь не прикасаться к геля в процессе добавления.
- Найдите МТС карты в держатель карты центрифуги и центрифугируют при 156 х г в течение 6 мин.
- Охрана поверхностных антигенов определяется из расположения РБК в мини-колонки гель, основанный на производствеГ описания.
III. Водные два измерения фазы раздела
- Подготовка Декстран 500 кДа / PEG 8 кДа двухфазного разделения системы, состоящей из (5% декстран 500k, 4% ПЭГ-8К, 150 мМ NaCl, 10 мМ фосфат) в соответствии с 13.
- Центрифуга при 433 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы получить два системных этапа (декстран в нижней).
- Отделить два этапа тщательно.
- Алиготе 1,0 мл верхней фазы ПЭГ в меченых трубку (с вогнутым дном), добавить 20 мкл 20% гематокрита HPG изменения эритроцитов, клеток и перемешать осторожно стряхивая.
- Добавить 0,5 мл верхней фазы, которые содержат клетки до 0,5 мл нижней фазы, и смешивать системе осторожно стряхивая.
- Положите трубку на скамейке запасных ~ 2 мин для системы отделить и определить расположение клеток в системе. Локализация эритроцитов (в верхней фазе PEG, в нижней фазе декстран или в обоих) есть функция от степени модификации и молекулярныхвес HPG.
IV. Осмотическое измерения хрупкости
- Подготовка NaCl решений с концентрацией в диапазоне от 0 до 0,9 (в / о)%.
- Место 0,4 мл NaCl решений в 1,5 мл пробирок Эппендорф.
- Добавить 20 мкл эритроцитов (20% гематокрита) в растворы NaCl.
- Mix клетки тщательно инверсии и разместить их на водяной бане при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
- Приостановить клетки тщательно инверсии. Принимать по 50 мкл суспензии эритроцитов и добавить его в 1 мл реагента Драбкин, в помещают в кювету. Смешать клеток с реагентом Драбкин в пипетированием и выходит. Измеряют поглощение гемоглобином cyanoderivative при 540 нм с использованием BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS читателя.
- Для определения количества гемоглобина в супернатант, центрифугируют клетки при 1000 х г в течение 1 мин. Добавить 200 мкл супернатанта в 1 мл реагента Драбкин в кювет. Смешать клеток с реагентом Драбкин в пипетированием и выходит. Измеряют поглощение hemoglОБИН cyanoderivative при 540 нм с использованием BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS читателя.
- Подсчитайте количество клеток лизируется в различных раствором хлорида натрия с отношением количества гемоглобина в надосадочной (шаг 6) на общую сумму гемоглобина в клеточной суспензии (шаг 5).
В. проточной цитометрии измерения - защита резус-D (РЖС) антигена
- Добавьте 5 мкл управления или HPG измененные эритроциты (20% гематокрита) в трех экземплярах в PBS буфере с добавлением 0,5% BSA в общем объеме 25 мкл.
- Добавить 25 мкл FITC моноклональными анти-резус-D (РЖС) приобретены у Quotient Biodiagnostics (штат Пенсильвания, США).
- Выдержите смесь в течение 30 мин при 37 ° С на водяной бане.
- Вымойте смеси с 1,5 мл PBS буфера в два раза. Центрифуга при 1000 мкг в течение 1 мин, чтобы удалить супернатант.
- Приостановить эритроцитов в 1 мл физиологического раствора, и передать суспензии в 4 мл потока BD трубки проточной цитометрии.
- Анализ использования FACSCanto II FloW цитометр, приобретая 5000 событий на ворота РБК контроля, а также использовать весь событий для анализа.
VI. Проточной цитометрии измерений - Экспрессия CD47
- Добавить 1,54 мкл управления или HPG измененные эритроциты (20% гематокрита) в трех экземплярах в PBS буфере с добавлением 0,5% BSA в общем объеме 44 мкл.
- Добавить 6 мкл фикоэритрин (PE), меченного мышиного анти-CD47 человека приобрести BD Biosciences (Нью-Джерси, США).
- Выдержите смесь в течение 30 мин при 37 ° С на водяной бане.
- Вымойте смеси с 1,5 мл PBS буфера два раза. Центрифуга при 1000 мкг в течение 1 мин, чтобы удалить супернатант.
- Приостановить эритроцитов в 1 мл солевого, и пройти через 26 G 5/8 иглу, чтобы минимизировать клетки слипания.
- Передача суспензии в 4 мл потока BD трубки проточной цитометрии.
- Анализ использования FACSCanto II проточной цитометрии, приобретая 10000 событий на ворота РБК управления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Камуфляж резус-D антигена CD47 и РБК поверхности белка количественно с помощью проточной цитометрии с использованием флуоресцентных меченых моноклональных антител, а также представитель результат приведен на рисунке 1. В случае HPG-привитые эритроцитов (серый), интенсивность сигнала уменьшилась (пик смещается налево) по сравнению с контрольной эритроциты (красные и зеленые) указывает на снижение в связывании антител к клеточной поверхности, которые свидетельствуют о маскировке поверхностных белков .
Рисунок 1. Оценка камуфляж поверхностных антигенов и белков с помощью проточной цитометрии. A) резус-D (РЖС) Защита: Black затененных пик представляет собой отрицательный контроль (немодифицированных эритроциты обрабатывают PE-меченными IgG1), зеленый пика представляют собой позитивное сотрудничествоNTROL (немодифицированных эритроциты обрабатывают анти-резус флуоресцентные антитела), и серый пик представляет HPG измененные эритроциты относились с таким же количеством анти-резус флуоресцентных антител. B) CD47: Black затененных пик представляет собой отрицательный контроль (немодифицированных эритроциты обрабатывают PE-меченными IgG1), красный пик представляют собой положительный контроль (немодифицированных эритроциты обрабатывают анти-CD47 флуоресцентных антител), а пик серые представляет HPG измененные эритроциты относились с таким же количеством анти-CD47 флуоресцентных антител. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Универсальный эритроциты донора имеют большой потенциал в повышении доступности и безопасности крови для переливания крови терапии. Эритроциты также считают перспективным для доставки лекарств транспортных средств в связи с их долгого обращения и присущие биосовместимость 14, 15. Эксперименты, представленные в настоящем документе оценки в пробирке характеристики HPG изменения эритроцитов. В свойствах пробирке и в естественных обращения HPG измененные эритроциты были исследованы в нашей группе недавно 8, 11. Раздел эритроцитов в Dextran500K/PEG8K водной двухфазной системе, дополненные NaCl и фосфат натрия, зависит от поверхностного заряда эритроцитов и на поверхности гликопротеин состава 16. В зависимости от степени РБК гликокаликса модификация с HPGs, модифицированных эритроцитов, как правило, раздел с нижней декстрана в верхней фазе PEG. Двухфазной системы обеспечивает легкий оценки степени модификации поверхности РБК. Лизис оF эритроцитов в аутологичной сыворотки значительное испытание для расследования, независимо от того HPG изменения эритроцитов вызывает активацию комплемента, поскольку внедрение новых материалов для клеток и биологических поверхностей делает их иностранные и с учетом иммунного лизиса, опосредованного системой и оформление 17. Осмотическая хрупкость эксперимента, с другой стороны, указывает, является ли механические свойства и деформируемости мембран эритроцитов были скомпрометированы в результате HPG прививки. Деформируемости эритроцитов имеет важное значение для физиологической функции O 2 доставкой в разные части тела. В этом эксперименте изменение эритроциты подвергаются деформации стресса, лечения при различных концентрациях NaCl, и количественной процентов лизированных клеток.
Проточной цитометрии используется для оценки степени поверхностный антиген и защиты поверхности белка (рис. 1) путем взаимодействия определенного антигена на поверхности эритроцитов с соответствующим флуоресцентным-ларасширенный антител. Степень резус-антиген D защиту оценивали с помощью проточной цитометрии. Маскировка антигенов видно из снижением связывания антител к эритроцитам. Резус-антиген D маскировки также оценивается по картам МТС. МТС карты широко используются в лабораториях гематологии в больницах для фенотипа эритроцитов. Например, когда группа RBC находится в тип карты МТС, клетки агглютинировать в результате реакции с использованием соответствующих моноклональных антител. Тем не менее, B-группы крови не агглютинируют и едет в нижней части мини-гель. Понятие агглютинации был использован для оценки уровня защиты, который HPG прививка обеспечивает эритроцитов. HPG-привитые эритроциты проникает в мини-колонке с силикагелем, в зависимости от уровня защиты поверхности антиген.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было профинансировано канадский Услуги крови (КОС) и канадского Института Здоровья наук (CIHR) Фонда Партнерство исследований. Авторы благодарят LMB макромолекулы концентратор на UBC Центр исследований крови для использования их научно-исследовательских учреждений. Инфраструктуры при поддержке Канады основа для инноваций (CFI) и Майкл Смит Фонд исследований в области здравоохранения (MSFHR). Р. Chapanian является получателем (CIHR / CBS) докторской стипендии в переливании науки и получателем MSFHR исследований стажером сообщение докторских стипендий. JN Kizhakkedathu является получателем MSFHR Карьера премии Академии следователь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycidol | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Trimethylolpropane | Fluka | (ON, Canada) | |
| Potassium methylate | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Anhydrous pyridine | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| 4-Dimethylaminopyridine | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Succinic anhydride | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Acetone | Fisher Scientific | (ON, Canada) | |
| Anhydrous dimethyl formamide | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| N,N'-Diisopropylcarbodiimide | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| MTS cards | Micro Typing System (MTS) cards (FL, USA) | ||
| Dextran 500 kDa | Pharmacia Fine Chemicals | (Sweden) | |
| PEG 8 kDa | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD) | Quotient Biodiagnostics | (PA, USA) | |
| PE monoclonal anti-CD47 | BD Biosciences | (NJ, USA) | |
| Drabkin's reagent | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Table. Chemicals and reagents used for the grafting of HPG polymers to RBC membrane and their analysis. | |||
References
- Bradley, A. J., Murad, K. L., Regan, K. L., Scott, M. D. Biophysical consequences of linker chemistry and polymer size on stealth erythrocytes: size does matter. Biochim. Biophys. Acta. 1561 (2), 147-158 (2002).
- Murad, K. T., Mahany, K. L., Brugnara, C., Kuypers, F. A., Eaton, J. W., Scott, M. D. Structural and functional consequences of antigenic modulation of red blood cells with methoxypoly(ethylene glycol. Blood. 93 (6), 2121-2127 (1999).
- Scott, M. D., Murad, K. L., Koumpouras, F., Talbot, M., Eaton, J. W. Chemical camouflage of antigenic determinants: Stealth erythrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (14), 7566-7571 (1997).
- Daniels, G., Reid, M. E. Blood groups: the past 50 years. Transfusion. 50 (2), 281-289 (2010).
- Murad, K. L., Gosselin, E. J., Eaton, J. W., Scott, M. D. Stealth cells: Prevention of major histocompatibility complex class II-mediated T-cell activation by cell surface modification. Blood. 94 (6), 2135-2141 (1999).
- Kainthan, R. K., Hester, S. R., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. In vitro biological evaluation of high molecular weight hyperbranched polyglycerols. Biomaterials. 28 (31), 4581-4590 (2007).
- Kainthan, R. K., Janzen, J., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. Biocompatibility testing of branched and linear polyglycidol. Biomacromolecules. 7 (3), 703-709 (2006).
- Chapanian, R., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. In vivo circulation, clearance, and biodistribution of polyglycerol grafted functional red blood cells. Biomaterials. 33 (10), 3047-3057 (2012).
- Chapanian, R., Constantinescu, I., Rossi, N. A. A., Medvedev, N., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. Influence of polymer architecture on antigens Camouflage, CD47 protection and complement mediated lysis of surface grafted red blood cells. Biomaterials. 33 (31), 7871-7883 (2012).
- Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. Enhanced cell surface polymer grafting in concentrated and nonreactive aqueous polymer solutions. J. Am. Chem. Soc. 132 (10), 3423-3430 (2010).
- Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Kainthan, R. K., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. Red blood cell membrane grafting of multi-functional hyperbranched polyglycerols. Biomaterials. 31 (14), 4167-4178 (2010).
- Muzykantov, V. R., Smirnov, M. D., Domogatsky, S. P. Hemolytic complement activity assay in microtitration plates. J. App. Biochem. 7 (3), 223-227 (1985).
- Walter, H., Brooks, D. E., Fisher, D. Partitioning in aqueous two-phase systems: theory, methods, uses, and applications to biotechnology. , Academic Press Inc. London. (1985).
- Rossi, L., Serafini, S., Pierige, F., Antonelli, A., Cerasi, A., Franternale, A., et al. Erythrocyte-based drug delivery. Expert Opin. Drug Deliv. 2 (2), 311-322 (2005).
- Walter, H., Krob, E. J., Brooks, D. E. Membrane surface properties other than charge involved in cell separation by partition in polymer, aqueous 2-phase systems. Biochemistry. 15 (14), 2959-2964 (1976).
- Muzykantov, V. R., Murciano, J. C., Taylor, R. P., Atochina, E. N., Herraez, A. Regulation of the complement-mediated elimination of red blood cells modified with biotin and streptavidin. Anal Biochem. 241 (1), 109-119 (1996).
