Summary
我々は、T細胞活性化プロセスの間にタンパク質のダイナミクスについての洞察を提供して生細胞撮像方法を説明する。私たちは、定量的な結果は、T細胞活性化の全体の複合体形成のシグナルに従う得T細胞拡散アッセイ、共焦点顕微鏡と画像解析を組み合わせた使用法を示す。
Abstract
感染症に対する防御を、免疫系1,2によって媒介される。 Tリンパ球は、3,4、複数の免疫細胞の活性化および応答を調節、免疫系のマスターコーディネーターである。 T細胞活性化は、抗原提示細胞（APC）によって表示される特定の抗原の認識に依存する。 T細胞抗原受容体（TCR）は、各T細胞クローンに固有のもので、抗原特異性5を決定します。抗原への結合は、TCR TCR複合体の成分のリン酸化を誘導する。 T細胞の活性化を促進するために、この信号は、TCRにシグナル伝達タンパク質の補充などの様々な重大な反応を開始する、膜から細胞質及び核に導入されなければならない。APCサイト（免疫シナプス）、それらの分子の活性化は、細胞骨格の再配列、細胞内カルシウム濃度の上昇、および遺伝子発現の変化6,7。で正しい活性化シグナルのitiationと終了は、適切なT細胞応答のために重要です。シグナル伝達タンパク質の活性は、タンパク質-タンパク質相互作用の形成および終端に依存する、例えば、タンパク質リン酸化、タンパク質複合体、タンパク質のユビキチン化および種々の細胞のサイト8へのタンパク質の動員の形成などの翻訳後修飾を書き込む。 T細胞活性化プロセスの内部の仕組みを理解することは免疫学研究と臨床応用の両方に重要です。
種々のアッセイは、タンパク質 - タンパク質相互作用を調査するために開発されてきたが、そのような広く使用されている免疫共沈降法などの生化学的アッセイは、タンパク質の位置を識別することができないように、従って、細胞の動態に貴重な洞察の観察を排除メカニズム。さらに、これらのアッセイは、通常、バルク、tのさまざまな段階であるかもしれない多くの異なる細胞からのタンパク質を結合する彼は、細胞のプロセスを検討した。これは、時間分解能に悪影響を及ぼすことができます。生細胞のリアルタイムイメージングの使用は、従って、プロセス9,10のダイナミクスに光を当て、タンパク質の空間時間的に追跡およびシグナル伝達事象を区別する能力の両方を可能にする。我々は、T細胞活性化の間のシグナル伝達複合体形成のリアルタイムイメージングの方法を提案する。一次T細胞又は例えばJurkat細胞などのT細胞ラインは、非生理的なオリゴマー11を予防、単量体蛍光タンパク質に融合された関心のあるタンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトされる。フォトT細胞は、抗原特異的活性化の必要性を克服しながら、T細胞活性化を誘導し、CD3/TCR複合体に結合し、T細胞活性化抗体8,9、カバースリップでプレコートされた上でドロップされる。活性化細胞は常に共焦点顕微鏡を用いて結像される。撮像データは、コルなどの定量結果を得るために分析されるシグナル伝達タンパク質のocalization係数。
Protocol
1。 T細胞トランスフェクション
- クレオソリューションにキットの "サプリメント"溶液を混合することによって活性化Amaxaヌクレオソリューションを準備します。活性化する溶液を4℃で3ヶ月までの℃で保存することができる。
- [10％ウシ胎児血清（FCS）、1％ペニシリン - ストレプトマイシン溶液、及びRPMI中の2mMのL-グルタミン]培地でジャーカットT細胞を成長させる。最適には、細胞を1〜2週間解凍後に使用されるべきである。対数増殖中の細胞培養物を使用すると、高いトランスフェクション効率および細胞の生存に重要である。あるいは、わずかな修正で、このプロトコルは、前述し8のように、一次T細胞を使用することができる。これは、全体の一次T細胞の活性化プロセスの持続時間が長くジャーカットT細胞（〜30分）に比べて、顕微鏡ステージは、培養システムが搭載されていることを強調すべきであるCO 2を維持するために使用しなければならない、湿度および温度アクティベーションプロセス。
- 5を収集15 mlチューブへのトランスフェクション当たり×10 6対数期T細胞。
- 400で7分×gで室温で細胞を遠心分離します。
- 遠心分離の間に、6ウェルプレートを準備します。 5ミリリットルの培地でそれぞれのトランスフェクションのために1つのウェルを記入し、37℃でプレインキュベート℃に
- 遠心機からチューブを収集し、上清を捨てる。 1ミリリットルRPMIで細胞ペレットを再懸濁します。
- 400で7分×gで室温で細胞を遠心分離します。
- 遠心分離中、トランスフェクション溶液を準備します。 96ウェルプレートの1つのウェルでは、蛍光標識タンパク質をコードする目的のプラスミド5μgのDNAを、ステップ1で調製した活性化し、100μlのAmaxaヌクレオソリューションを混ぜる。最適には、DNA濃度は、トランスフェクション溶液を希釈することを避けるために、1μgの/ mlのより大きくなければならない。
- 穏やかにピペッティングでよく混ぜる。
- 細胞を遠心分離した後、慎重にすべての上清を除去し、Dではないながら、ペレットをisturbing。
- 二回DNA /トランスフェクションソリューションをピペット。
- ペレットへのDNA /トランスフェクション溶液を加える。
- Amaxaキュベットに細胞を移します。
- Amaxaヌクレオデバイスにキュベットを挿入します。
- H-10 Amaxaトランスフェクション、エレクトロポレーションの設定（ジャー）またはT-23（一次T細胞）を使用します。
- インキュベーターから6ウェルプレートを取り外します。
- エレクトロポレーションに続いて、慎重にパスツールピペットを用いて6ウェルプレートに細胞懸濁液を上清を移す。細胞破片からなるペレットを形成してもよい。ペレットを転送することは避けてください。
- 37℃で24時間、細胞をインキュベート℃に
- 新しいウェルに各ウェルから細胞懸濁液2.5mlのを転送します。各ウェルに2.5ミリリットル暖かい培養培地（ステップ2で説明）を追加する。
- 72時間後、400で7分×gで室温で用滅菌チューブと遠心分離機に細胞を移す。上清を捨て、それのWi置き換える使用したプラスミドに適した哺乳類細胞の選択抗生物質（、我々はそれぞれ、1.3 mg / mlのおよび/または0.2 mg / mlの濃度でG418および/またはハイグロマイシンを用い使用される抗生物質に適した濃度の適用）を補充番目の培地。新鮮なだけでなく中の培養細胞懸濁液。あるいは、細胞を一過性にトランスフェクトし、トランスフェクション後48時間で撮像することができる。一過性にトランスフェクトした細胞を準備するには、ステップ20に正常に継続ステップ8、同時に2つのプラスミドを細胞にコトランスフェクションした後、ステップ23に直接進んでください。このシナリオの下で、細胞を直ちに使用する必要があることに注意し、一般的に蛍光強度が不均質と必ずしも高くない。
- 適切な選択抗生物質を補充した培地で細胞を成長させる。セルを分割し、必要に応じて抗生物質を補充培地でそれらを補う。
- 2週間後、FACS（インフルエンザの使用に成功したトランスフェクションを確認orescence活性化細胞選別）としては、次のとおりです。
- 10 6個のトランスフェクトされた細胞、10 6モックトランスフェクト細胞（ネガティブコントロール）、かつ安定して蛍光標識タンパク質を発現することが知られている10 6個の細胞を収集する。セルが複数の蛍光タンパク質（ステップ27を参照）でトランスフェクトされた場合、陽性対照として多数、単独でタグ付けされた細胞株を使用する。
- 400で7分×gで室温で細胞を遠心分離します。
- 上清を捨てる。 500μlのFACS緩衝液（PBSワット/ OのCa 2 +及びMg 2 +、5％FCS、0.05％アジ化ナトリウム）中で細胞を再懸濁し。
- 細胞の蛍光性を確認するための分析FACSを使用します。陰性と陽性対照のそれにトランスフェクションされた細胞の蛍光を比較してください。
- トランスフェクションされた細胞を使用して、追加、蛍光標識タンパク質は、手順3-26で細胞をトランスフェクトする。
- 蛍光の高いレベルを提示する細胞を使用すべきである。最適には少なくとも50％培養中の細胞は、高い蛍光でなければなりません。細胞蛍光を、FACSを介して細胞選別によって増加させることができる。
任意の追加タグタンパク質は、異なる蛍光体に融合しなければならず、異なる選択抗生物質をコードするプラスミドでエンコードさ。複数のプラスミドでトランスフェクトされた細胞の選択的な媒体は、全ての適切な抗生物質を添加する必要がある。
2。 T細胞拡散アッセイ準備
- ラボ·テックIIドイツのカバーガラスシステム4チャンバースライドを使用してください。準備または使用中に、ピペットチップで例えば 、誤ってチャンバーの内面に傷を付けないようにしてください。
- 50mlのスライド調製液を準備し、12 M（37％）のHCl 4.6ミリリットルを取る38.5ミリリットル100％エタノールを追加し、6.9ミリリットル二重蒸留水。
- 500μlのスライド調製液とスライドの各チャンバーを埋める。
- 10分間室温でインキュベートする。
- 室を吸引の、それらを完全に乾燥させる。
- °Cまで完全に乾燥した45℃で1時間のために覆われていないスライドをインキュベートする。
- 二重蒸留水に0.1％のポリ-L-リジン（Sigma-Aldrich社）を希釈することにより0.01％ポリ-L-リジン溶液を調製する。
- 各チャンバーに500μlのを適用します。
- 室温で15分間スライドをインキュベートする。
- それらを完全に乾燥させ、チャンバーを吸引。
- °Cまで完全に乾燥した45℃で3時間インキュベートする。
- コーティングされたスライドを室温で数ヶ月間、乾燥格納することができる。
- 活性化抗体溶液を準備します。室あたりHIT3a（BD Pharmingen社、＃555337）またはUCHT1（BD Pharmingen社、＃555330）、400μlのPBS中10μgの/ mlのいずれか：抗CD3抗体を使用してください。このソリューションは、まもなく、スライドの準備の前に準備する必要があります。
- 活性化抗体溶液400μlの、各チャンバーを埋める。
- 4℃で一晩、好ましくは37℃以上、で2時間のためにスライドをインキュベート℃に
- 活性化抗体ゾルを削除ution、直ちに300μlのPBSで2回チャンバーを洗う。この時点から、チャンバーは、バッファでいっぱい残っていることを確認します。
- 4℃でPBS-満ちスライドを保存する私たちは、1週間以内にプレパラート室を使用することをお勧め。
3。 T細胞活性化とイメージング
- [フェノールレッドなしで1.25ミリリットルのHEPES（1 M）、10ミリリットルFCS、38.75ミリリットルRPMI]イメージングバッファを準備します。撮像バッファは4℃で保存した後に濾過することができる。
- ツァイスLSM 510メタ顕微鏡をアクティブにします。 37顕微鏡加熱可能な取付フレームを温める℃に"エキスパートモード"を選択します。
- "取り込み"タブをクリックし、次のタブが開きますレーザーを、顕微鏡、コンフィギュレーション、スキャン、タイムシリーズ。
- 必要に応じてレーザーをアクティブにします。 mCFPとmYFPの励起のために、5分間の "スタンバイ"にし、 "on"にアルゴン/ 2レーザーを設定します。
- 同じ蛍光団を使って、前にこのライブセルイメージングアッセイを実行した場合、結果のLSMファイルを開いて、私は "再利用"をクリック詐欺、ステップ9から継続。そうでない場合は、手順6から継続。
- 使用される蛍光タンパク質の励起および発光のための適切なフィルタを使用してチャネルを定義します。
- "スキャンコントロール"ウィンドウで、Zスタックオプションを選択します。
- 0.5ミクロン;現在のスライス：3;：スライス数：インターバル5次のスキャンパラメータを入力します。
- 顕微鏡の近くで37 Accublock デジタルドライバース （Labnet）°Cを準備します。
- 37℃にイメージングバッファーを温める
- 暖かいイメージングバッファー600μlのに置き換える、PBSを吸引することで保存されてスライドを準備します。
- 37℃でスライドをインキュベート℃にステップ13まで、少なくとも15分間インキュベーターでスライドを保つ。
- 5×10 5トランスフェT細胞を収集します。
- 400×gで2分間、細胞を遠心分離します。
- 上清を捨てる。
- 1ミリリットル暖かいイメージングバッファーで細胞を再懸濁し、そして1.5 mlのエッペンドルフチューブに移す。
- Tを置きAccublockデジタルドライバースのESTチューブ。
- インキュベーターから温めスライドを取り、温め顕微鏡取付フレームにマウントします。
- "VIS"アイコンをクリックします。
- 細胞懸濁液を混合し、1〜2μLを削除します。
- スライドの下部上記イメージングバッファにピペットの先端を挿入します。スライドを傷つけない。
- 目的の絞りオーバーシードのセルを。
- 彼らが降りるようにすぐに視覚的に蛍光細胞の追跡を開始。両方のチャネルで高い蛍光を表示するセルを選択します。
- 細胞がスライドの表面に到達する前に、LSMモードを有効にします。
- つだけの励起レーザーを切り替えます。あなたはDICのチャンネルを持っているレーザーを選択します。
- 1にズームを設定します。 "高速XY"アイコンをクリックします。 "停止"アイコンをクリックします。切り抜きツールを使用して、細胞を中心としたROIを選択します。
- 3にズームを設定します。 "高速XY"のアイコンをクリックして、手動で最適なセルを表示するには、フォーカスを設定。 "停止" ICOをクリックN。
- 必要なすべての励起レーザーを切り替えます。
- "STARTT"アイコンをクリックして録音を開始します。画像拡散処理（一般5分）の全体のためのセルを。終了したら、 "停止"アイコンをクリックしてください。
- ファイルを保存します。
- 追加のセルを取得するために、 "VIS"のアイコンをクリックしてください。まだスライドの下部に接触していなかった細胞が存在する場合は、ステップ23から続けます。すでに拡散プロセスを始めているイメージング細胞を避ける。そうでない場合は32に進みます。
- 観測されたスライド領域が、細胞の大部分を欠いている場合は、細胞（ステップ20から継続）の別のアリコートを追加します。そうでない場合は33に進みます。
- 追加のセルを取得するために、客観的なの開口上の領域は、細胞を欠いているように、スライドを移動します。
- 細胞の別のアリコート（およびステップ20から継続）を追加します。
- すべての所望の撮影を行った後、保存されたLSMファイルを開きます。
- "ギャラリー"、 "時間+ Z"と "サブセット"をクリックします。
- relevanを選択してください時刻t範囲とZスタック。
- 新しいファイルを保存します。
- すべての画像ファイルのためのステップ35-38を実行します。
4。イメージングデータ解析
- Imarisソフトウェア（ビットプレンAG、チューリッヒスイス）を使用して、LSMのファイルを開きます。
- "サーパス"をクリックします。 "画像処理"メニューをクリックして、 "時間とZを入れ替え"を選択します。これは、画像の正しいトリミングに役立ちます。
- "編集"ツールバーをクリックし、ドロップメニューの "クロップ3D"オプションを選択します。細胞を取り巻く領域のみを含むように画像をトリミング。我々は、細胞を中心とした300×300ピクセルの正方形にトリミングを示唆している。セルの形状と位置が時間の経過とともに変化することに注意してください。 T軸を観察すると、細胞はすべての時点でトリミング領域内にあることを確認してください。
- "画像処理"メニューをクリックして、画像の元の時間的分離を復元するために、 "時間とZを入れ替え"を選択します。
- メインツールバーの "Coloc"ボタンを押してください。 "デタイムのビルド]をクリックしますP。 Coloc "。Imarisは自動的に各時点で各チャネルの強度のしきい値を計算します。
- "チャネル統計"を選択することにより、共局在解析の結果を表示します。 "エクスポート"をクリックしてデータをエクスポートします。
- それぞれの画像化されたセルに、手順1〜6を繰り返します。私たちは、少なくとも50細胞は、このように分析することをお勧めします。
- 平均ピアソンの局在係数とその標準誤差または偏差を計算します。
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Representative Results
我々は、ライブT細胞イメージングと解析例を提示する。撮像実験に先立ち、SLP76欠損T細胞（J14）は、蛍光タンパク質（ 図1）の発現を決定するために、FACSを用いて分析した。タグ付けされたシグナル伝達タンパク質mCFP-NckのSLP76と、mYFPでトランスフェクトしたT細胞を活性化するスライド上に堆積され、T細胞拡散（ 図2）の間に画像化した。収集された画像は、活性化します（ 図3）拡散を通してタンパク質の局在のダイナミクスを示す。コンピュータ化された画像処理、人間のバイアスを最小限に抑えながら、可視化細胞から新たな洞察や定量的な情報を提供します。細胞活性化プロセスを通じて2つのタンパク質の局在を調べるために、我々はImarisソフトウェア（ビットプレンAG、チューリッヒスイス）の局在ツールを利用した。撮像されたセル間の異なる時点間の共局在係数を比較することによって、我々はなかった NckのとSLP76の共局在は、T細胞活性化（P> 0.3）（ 図4）全体に大きく変化しないことを確かめることができる。
図1。 FACSは、二重蛍光標識タンパク質をトランスフェクトした細胞の解析データは、（A）mCFP用の蛍光強度ヒストグラムとして示されている;（B）mYFPと、（C）ドットプロットである。 mCFP-NckのとSLP76-mYFPでトランスフェクションJ14細胞の蛍光強度は、それぞれ、シアン、黄色で表されます。非トランスフェクトJ14陰性対照細胞は、黒線で示されている。
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図2。ライブT細胞拡散アッセイの略図 T細胞活性化のスライドの（A）の準備;（B）アッセイと分析を拡散T細胞を生きて、（C）顕微鏡のセットアップがより大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。 mCFP-NckのとSLP76-mYFPを発現するT細胞活性化プロセス中にNckのSLP76との分布。細胞を、抗CD3抗体で刺激予め被覆カバースリップ上に滴下し、常に7分間の期間にわたって撮像した。 SLP76-mYFPが黄色で表示されている間mCFP-Nckのは、シアンで表されます。
図4。タンパク質の共局在の定量分析。細胞の画像処理をImarisソフトウェア（ビットプレンAG、チューリッヒ、スイス）を用いて行った。共局在はmCFPチャネルの強度を画素ごとにmYFPチャネルとの間のピアソンの相関係数として算出される。異なる時点から計算ピアソンの局在係数を比較する。 30秒アクティベーションプロセスに、mCFP-NckのとSLP76-mYFPの局在係数が有意（p <0.05）有意に増加した。これらの結果は> 50の独立した細胞を解析することにより算出した。平均値±標準誤差が示されている。
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Discussion
複数の細胞プロセスの制御と機能は、タンパク質 - タンパク質相互作用の形成および終了に依存する。顕微鏡イメージングは、生きている細胞内の蛍光標識タンパク質のリアルタイム追跡を可能にします。タグ融合タンパク質の共局在は、タンパク質間の直接的または間接的な相互作用を示唆することができ、例えば、免疫沈降などの生化学的方法によって得られた知見を補強するために使用することができる。生化学的方法とは異なり、生細胞イメージングでは、これらのタンパク質間相互作用が発生したときに、生理学的プロセスの監視を容易にし、タンパク質の細胞分布を検出し、空間的かつ時間をかけて観察することができる。共局在の定量分析のための様々なツールが開発されている。ピアソンの相関係数は、2つのタンパク質が12〜共局在の程度の定量化のための非常に魅力的であり、広く利用可能な方法のままである。一方、蛍光共鳴電子NERGY移動（FRET）実験近接（10nm以下）ことを特徴とするタンパク質間相互作用の検出を可能にする、この方法は、特殊な設定（使用される蛍光タギングの機器との互換性）と複雑なデータ処理を必要とする。ほとんどの用途、局在解析のために、生化学的方法との結合では、使いやすいように構成しており、時間をかけてタンパク質 - タンパク質相互作用を観察するための簡単な方法。
いずれかのチャネルのための強度閾値を下回る画素を無視して、分析する画素について蛍光強度閾値を確立し、正確かつ高感度共局在化分析のために非常に重要である。これらのしきい値の客観的かつ自動的に決定するために一般的に使用されるアルゴリズムは、13。コステらによって開発され、ImarisとVolocityなどの画像処理プログラムによって実現される。
ここでは、ライブのT細胞イメージのままの使用を実証SLP76の動態を解析するためのる方法は、主要なT細胞における足場、およびNckの、アダプタータンパク質が、いずれもT細胞活性化14,15に必須である。活性化中に収集されたT細胞の画像は、2つのタンパク質が細胞の活性化処理（ 図3）を通じて共局在していることを示唆している。これは、定量的に活性化過程を通じて収集された画像についてピアソンの共局在試験を行うことによって確証される。 -1のスコアが反相関関係を意味する-1から1のピアソンの局在係数の範囲は、1のスコアが完璧な共局在を示し、0は二つの画像チャネルの間には相関関係がないことを意味します。異なる時点のために、さまざまな細胞のための計算されたピアソンの共局在化係数の比較は、そのNckのとSLP76の共局在が大幅に細胞活性化中に変更されないことを示しますが、一定のまま（P> 0.3、 図4）。一方、全体の共局在の共同これらのタンパク質の効率的なアクティベーションプロセスを通じて変更されることはありません、それは協会とこれらの蛋白質18の間に生じた解離の動的なプロセスの可能性を排除しない。
我々が提示プロトコルは、必要に応じて細胞成長条件を調整し、問題の細胞株のトランスフェクションに適した設定を選択し、該当する場合は、細胞活性化プロセスを変更することにより、他の造血細胞株に適合させることができる。我々は適切な調整や設定の使用と、LSM 510メタ共焦点顕微鏡を使用しながら、他の共焦点顕微鏡システムが正常にも同様に使用することができることに注意してください。
ライブT細胞イメージングの使用は、生化学的および分子的方法を用いて利用できない時間的および空間分解能で検討されるようにシグナル伝達事象を可能にし、規制および活性化プロセスを直接監視することができる。我々は簡単なメタを提示、生きたT細胞拡散アッセイを行うリアルタイムで関連する蛋白質を監視し、定量的な結果を得るためにデータを分析するための外径。得られた顕微鏡検査デ ータは、例えば、セル形状指標分析のような他のダウンストリーム·アプリケーション、16のために使用され、特定の実験や研究目的に応じて、分析17,18の FRETすることができる。
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Disclosures
私たちは、開示する利害の衝突を持っていません。
Acknowledgments
著者は、技術支援のためにソフィアフライドに感謝します。助成no.1659/08、971/08、1503年から1508年と10分の491、無助成金健康科学の各省庁のためにイスラエル科学財団：MBSは、研究支援のために、次の機関に感謝します。 3から4114まで及び3から6540まで、後期アレクサンダーSmidodaの不動産を通じてイスラエル癌学会、およびバイオ医学の優秀付与Taubenblattファミリー財団。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygomycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R87589 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame - Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 | |
References
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