Summary
Biz T-hücre aktivasyonu işlemi sırasında protein dinamiği içgörü sağlayan bir canlı hücre görüntüleme yöntem açıklanmaktadır. Bu kantitatif sonuçlar T-hücresi aktivasyonu boyunca kompleks oluşumu sinyalizasyon takip vermek üzere T-hücresi yayılmasını tahlilinde, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi, kombine kullanımını göstermektedir.
Abstract
Bulaşıcı hastalıklara karşı koruma bağışıklık sistemi 1,2 aracılık eder. T lenfositleri birden fazla bağışıklık hücrelerinin 3,4 aktivasyonu ve yanıtları düzenleyen, bağışıklık sisteminin ana koordinatör vardır. T-hücresi aktivasyonu antijen sunan hücreler (APC) tarafından gösterilen spesifik antijen tanınması bağlıdır. T-hücresi antijen reseptörü (TCR), her T-hücresi klonu özgüdür ve antijen özgüllüğü 5 belirler. Antijene TCR bağlayıcı TCR kompleksinin bileşenlerinin fosforilasyonu neden olur. T-hücresi aktivasyonunu teşvik etmek için, bu sinyali gibi TCR proteinlerin sinyal alımı gibi çeşitli önemli tepkiler başlatarak, zardan sitoplazma ve çekirdeğe transduse olmalıdır, APC Alanı (bağışıklık sinaps), molekül aktivasyonu, sitoskeletal düzenlenmesi, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun yükselmesi ve gen ekspresyonu 6,7 değişiklikler. Doğruaktive sinyallerin itiation ve sonlandırılması uygun T hücre yanıtları için çok önemlidir. Sinyal proteinlerinin aktivitesi protein-protein etkileşimleri oluşumu ve sonlandırma bağlıdır, bu tür protein fosforilasyonu, protein kompleksleri, ve protein ubiquitylation çeşitli hücresel sitelerinin 8 proteinlerin işe oluşumu gibi translasyon sonrası modifikasyonlar. T-hücre aktivasyonu sürecinin iç işleyişini anlamak immünolojik araştırma ve klinik uygulamaları için çok önemlidir.
Çeşitli testler protein-protein etkileşimleri araştırmak için geliştirilmiştir, ancak bu yaygın olarak kullanılan ortak immunoprecipitation yöntemi olarak biyokimyasal testleri, böylece hücresel dinamikleri içine değerli bilgiler gözlem engelleyen, protein konumu ayırt izin yok mekanizmaları. Ayrıca, bu toplu testlerin genellikle t farklı aşamalarında olabilir birçok farklı hücrelerden protein birleştirmeko hücresel süreci incelenmiştir. Bu zamansal çözünürlüğe üzerinde zararlı etkisi olabilir. Canlı hücrelerin gerçek zamanlı görüntülemenin kullanımı dolayısıyla sürecin 9,10 dinamikleri üzerinde ışık tutan, proteinlerin mekansal izleme ve geçici olarak sinyal olayları birbirinden ayırt etmek yeteneği hem de sağlar. Biz T-hücre aktivasyonu sırasında sinyal-kompleks oluşumunun gerçek zamanlı görüntüleme bir yöntem mevcut. Primer T-hücreleri veya bu gibi Jurkat T-hücre, fizyolojik olmayan bir oligomerizasyon 11 önlenmesi, monomer cinsi floresan proteinleri ile kaynaşmış ilgi proteinleri için kodlayan plazmid ile transfekte edilir. • Canlı hücreler, spesifik antijen için aktive ihtiyacının üstesinden gelinir ise T-hücresi aktivasyonunu uyaran, CD3/TCR kompleksine bağlanan T-hücresi aktive edici antikor 8,9, bir lamel ile önceden kaplanmış üzerinde bırakılır. Aktif hücreleri sürekli konfokal mikroskopi kullanımı ile görüntülü. Görüntüleme veriler, col gibi kantitatif sonuçlar, verim için analiz edilirsinyal proteinlerinin ocalization katsayısı.
Protocol
1. T hücre transfeksiyonu
- Nucleofector Çözüm için sette en "Ek" çözüm karıştırılarak aktive Amaxa Nucleofector çözüm hazırlayın. Etkinleştirilmiş çözelti üç ay boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
- Kültür ortamı içinde, Jurkat T hücrelerinin çoğalmasını [% 10 fetal dana serumu (FCS),% 1 penisilin-Streptomisin çözeltisi ve 2 RPMI mM L-glutamin]. Optimal olarak, hücreler 1-2 hafta sonra çözülme kullanılmalıdır. Logaritmik büyüme hücre kültürleri kullanılarak yüksek transfeksiyon verimi ve hücre canlılığı açısından önemlidir. Alternatif olarak, küçük değişiklikler yapılarak, bu protokol, birincil T-hücreleri ile birlikte kullanılabilir, daha önce tarif edildiği 8. Bu, birincil T-hücreleri aktivasyonu sürecinin süresi daha uzun Jurkat T hücreleri (~ 30 dakika), bu daha olduğunu vurgulamak gerekir, bir mikroskop aşamasında inkübasyon sistemi, CO2, boyunca nem ve sıcaklığı muhafaza etmek için kullanılması gereken monte etkinleştirme işlemi.
- 5 toplayın15 ml tüp içine transfeksiyon başına × 10 6 günlük fazlı T hücreleri.
- 400 7 dak × g oda sıcaklığında için hücreler santrifüj.
- Santrifüj sırasında, 6 oyuklu plaka hazırlanması. 37 5 ml kültür ortamı ve önceden inkübe ile her bir transfeksiyon için iyi bir doldurmak ° C
- Santrifüj tüpleri toplamak ve supernatant atın. 1 ml RPMI hücre pelletini.
- 400 7 dak × g oda sıcaklığında için hücreler santrifüj.
- Santrifüj sırasında transfeksiyon solüsyon hazırlanır. 96 oyuklu bir plaka iyi birinde, bir floresan etiketli proteini kodlayan ilgi 5 ug plazmid DNA'sı ile adım 1 'de hazırlanan aktive 100 ul Amaxa Nucleofector çözeltisi karıştırın. Optimal olarak, DNA konsantrasyonu transfeksiyon solüsyonu seyreltilmesi önlemek için 1 mg / ml 'den daha büyük olmalıdır.
- Nazik pipetleme ile iyice karıştırın.
- Hücrelerin santrifüje edilmesinden sonra, dikkatli bir şekilde tüm süpernatant kaldırmak d değil ikenpelet isturbing.
- DNA / transfeksiyon çözüm iki kez pipetle.
- Pelet DNA / transfeksiyon solüsyonu eklenir.
- Amaxa küvete hücre transfer edin.
- Amaxa Nucleofector cihazın içine küvet yerleştirin.
- Elektroporasyon için H-10 Amaxa transfeksiyon ayarı (Jurkat için) ya da T-23 (primer T-hücreleri için).
- Inkübatör 6 plaka çıkarın.
- Elektroporasyon ardından dikkatli bir Pasteur pipeti kullanılarak 6-plaka hücre süspansiyonu ile süpernatantı aktarın. Hücre artıkları oluşan pelet oluşturabilmektedir. Pelet transfer kaçının.
- 37, 24 saat boyunca inkübe hücreleri ° C
- Yeni bir kuyuya her bir hücre süspansiyonu 2.5 ml aktarın. Her kuyuya 2.5 ml sıcak bir kültür ortamı (adım 2'de açıklandığı) ekleyin.
- 72 saat sonra, 400 x g 7 dakika, oda sıcaklığında bir steril tüp ve santrifüj hücreleri aktarmak. Süpernatantı atın ve wi yerineKullanılan plazmit için uygun olan memeli hücre seçimi antibiyotik (, biz, sırasıyla, 1.3 mg / ml, ve / ya da 0.2 mg / ml 'lik konsantrasyonlarda, G418 ve / veya Higromisin kullanılan kullanılan antibiyotiklere için uygun bir konsantrasyonda uygulanır) ile desteklenmiş inci kültür ortamı. Yeni bir kuyuda Kültür hücre süspansiyonu. Alternatif olarak hücreler, geçici olarak transfekte edilmiş ve transfeksiyondan 48 saat sonra görüntülenebilir. Geçici olarak transfekte edilmiş hücreleri hazırlamak için, adım 20 ile devam normal adım 8, eş zamanlı olarak her iki plazmid ile ko-transfekte hücreler, ve daha sonra 23 doğrudan adım geçin. Bu senaryoya göre, hücreler hemen kullanılması gerektiğini not edin ve genel olarak floresans yoğunluğunu ve heterojen bir düzeyde olmayabilir.
- Uygun seçimi antibiyotik ile desteklenmiş kültür ortamı ile hücreleri büyütün. Hücreleri Split ve gerektiği gibi antibiyotik-takviye kültür ortamı ile ek.
- 2 hafta sonra, FACS kullanımı (grip ile başarılı transfeksiyon doğrulamakolarak orescence ile aktive olan hücre sıralama) aşağıdaki gibidir:
- 10 6 transfekte edilmiş hücreler, 10 6 sahte transfekte edilmiş hücreler (negatif kontrol) ve stabil bir şekilde floresan etiketli protein ifade etmek için bilinen 10 6 hücre toplayın. Hücrelerinin birden fazla flüoresan protein (adım 27) ile transfekte edilir ise, pozitif kontroller olarak birden fazla tek başına, etiketli hücre hatları kullanın.
- 400 7 dak × g oda sıcaklığında için hücreler santrifüj.
- Süpernatantı atın. 500 ul FACS tampon maddesi (PBS w / o Ca 2 + ve Mg2 +,% 5 FCS,% 0.05 sodyum azid) içinde süspanse hücreleri.
- Hücresel floresan doğrulamak için analitik bir FACS kullanın. Negatif ve pozitif kontroller arasında bu için transfekte edilmiş hücrelerin floresans karşılaştır.
- Transfekte hücreler kullanarak ilave olarak, flüoresan etiketli protein, tekrar adımları 3-26 ile hücreleri transfekte etmek için.
- Floresans yüksek seviyeli Hücreler kullanılmalıdır. Arasında Optimal olarak, en azından% 50kültür hücreleri yüksek floresan olmalıdır. Hücre floresan FACS ile hücre sıralama artırılabilir.
Her türlü ilave etiketli proteinlerin farklı fluorophores için sigortalı olmalıdır ve farklı bir seçim antibiyotikler için kodlama plazmid üzerinde kodlanmış. Birden fazla plazmid ile transfekte edilmiş hücreler için seçim ortamı tüm uygun antibiyotikler ile takviye edilmelidir.
2. T hücre Yayılma Testi Hazırlık
- Lab-Tek II Alman coverglass sistemi 4 oda slaytlar kullanın. Yanlışlıkla hazırlanması veya kullanım sırasında bir pipet ile örneğin odaları iç yüzeyi, sıfırdan değil emin olun.
- 50-ml slayt hazırlama çözeltisi hazırlayın: 12 M (37%) HCl 4.6 ml alın, 38.5 ml% 100 etanol ve 6.9 ml iki kat distile su ekleyin.
- 500 ul slayt hazırlık çözüm ile slayt her odası doldurun.
- 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- Odası aspires, tamamen kurutulması.
- ° C kadar tamamen kuru 45 1 saat için ortaya çıkarılan slaytlar inkübe edin.
- Iki kez damıtılmış su içinde% 0.1 poli-L-lisin (Sigma-Aldrich) seyreltilerek% 0.01 poli-L-lizin çözeltisi hazırlayın.
- Her iki mecliste de 500 ul uygulayın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika için slayt inkübe edin.
- Tamamen kurutma, odaları aspire.
- ° C kadar tamamen kuru 45 az 3 saat inkübe edin.
- Kaplı slaytlar, oda sıcaklığında birkaç ay boyunca kuru saklanabilir.
- Bir aktive edici antikor çözüm hazırlayın. HIT3a (BD Pharmingen # 555337) veya UCHT1 (BD Pharmingen # 555330), oda başına 400 ul PBS içinde 10 ug / ml ya da: bir anti-CD3 antikoru kullanın. Bu çözüm kısa bir süre slayt hazırlama önce hazırlanmalıdır.
- Aktive edici antikor çözeltisi 400 ul her bir göze doldurulabilir.
- Gece boyunca 4 °, tercihen 37 ° C veya daha, önceki 2 saat için slayt inkübe ° C.
- Aktive antikor sol kaldırmaution ve hemen 300 ul PBS ile iki kez odasına yıkayın. Bu noktadan sonra, odaları tampon dolu kalır emin olun.
- 4 ° C de PBS-dolu bir slayt Mağaza Biz 1 hafta içinde hazırlanan slayt odaları kullanmanızı öneririz.
3. T hücre aktivasyonu ve Görüntüleme
- [1,25 ml HEPES (1 M) ile, 10 mL FCS, 38.75 ml RPMI fenol kırmızısı olmadan] görüntüleme tamponu hazırlayın. Görüntüleme tampon 4 ° C'de süzülerek saklanabilir.
- Zeiss LSM 510 Meta mikroskop etkinleştirin. 37 için mikroskop ısıtılabilir montaj çerçevesi Sıcak ° C "Uzman modu" seçeneğini seçin.
- "Edinme" sekmesine tıklayın ve aşağıdaki sekmeler açın: Lazerler, Mikroskopi, Yapılandırma, Tarama, Zaman Serisi.
- Gerekli lazerler etkinleştirin. AÇSAP ağırlıklı ve mYFP, uyarma için daha sonra "açık" 5 dakika "bekleme" için Argon / 2 lazer, ayarlayın.
- Aynı fluorophores kullanarak önce bu canlı hücre görüntüleme testi gerçekleştirdiyseniz, ortaya çıkan LSM dosyayı açmak, i "yeniden" tıklayıncon ve adım 9 yerden devam. Aksi takdirde adım 6 devam edin.
- Kullanılan floresan proteinlerin uyarma ve emisyon için uygun filtreleri kullanarak kanalları tanımlayın.
- "Tarama kontrol" penceresinde, Z yığını seçeneğini seçin.
- 0.5 mikron; Şu dilim: 3;: dilim sayısı: Aralığı 5 aşağıdaki tarama parametreleri girin.
- Mikroskop yakın 37 bir Accublock Dijital Kuru Banyo (Labnet) ° C hazırlayın.
- 37 ° C'ye ısıtın görüntüleme tampon
- Sıcak görüntüleme tampon 600 ul ile değiştirilmesi, PBS aspire saklanan slayt hazırlayın.
- 37 slayt inkübe ° C Adım 13 kadar, en az 15 dakika için inkübatör slayt tutun.
- 5 toplayın x 10 5 transfekte edilmiş T hücreleri.
- 400 × g 2 dakika hücreleri santrifüj.
- Süpernatantı atın.
- 1 ml sıcak görüntüleme tampon tekrar süspansiyon hücreleri ve 1.5 ml Eppendorf tüp aktarabilirsiniz.
- T yerleştirinAccublock Dijital Kuru Bath ile ilgili est tüp.
- Inkübatör ısıtılmış slayt alın ve ısıtılmış mikroskop montaj çerçevesi üzerine monte.
- "VIS" simgesine tıklayın.
- Hücre süspansiyonu karıştırın ve 1-2 ul çıkarın.
- Slayt alt üzerinde görüntüleme tampona pipet ucu yerleştirin. Slayt çizilmesini önlemek.
- Amacı en diyafram üzerinde tohum hücreleri.
- Onlar iner gibi hemen görsel floresan hücreleri izlemeye başlar. Iki kanal yüksek floresan görüntüleyen bir hücre seçin.
- Hücre slayt yüzeyine ulaşmadan önce, LSM modunu etkinleştirin.
- Sadece bir uyarma lazer geçiş. Bir DIC kanal sahip olduğunuz bir lazer seçin.
- 1 Zoom ayarlayın. "Hızlı XY" simgesine tıklayın. "Dur" simgesine tıklayın. Kırpma aracını kullanarak, hücre merkezli bir yatırım getirisi seçin.
- 3 Zoom ayarlayın. "Hızlı XY" simgesini tıklatın, sonra el en iyi şekilde hücre görmek için odağı ayarlayın. "Dur" ico tıklayınn.
- Tüm gerekli uyarma lazerler geçiş.
- "StartT" ikonuna tıklayarak kayıt başlayın. Resim yayılma süreci (genellikle 5 dakika) bütünlüğü için hücre. Bittiğinde, "Dur" simgesini tıklatın.
- Dosyayı kaydedin.
- Ek hücreleri elde etmek için, "VIS" simgesini tıklatın. Henüz slayt alt temas gelmedi hücre varsa, adım 23 devam. Zaten yayılma süreci başladı görüntüleme hücreleri kaçının. Aksi halde 32 adıma geçin.
- Gözlemlenen slayt alan hücreler çoğunlukla yoksun ise, hücreler (adım 20 ile devam edin) başka bir kısım ekleyin. Aksi halde 33 adıma geçin.
- Ek hücreler elde etmek için, objektif en açıklık üzerindeki alana hücrelerinden yoksun olduğunu kaydırmak.
- Hücreleri (ve adım 20 ile devam eder) bir başka kısım ekleyin.
- Tüm istenen görüntüleme yaptıktan sonra, kaydedilmiş bir EKK dosyasını açın.
- "Galeri", "Zaman + Z" ve "alt kümesi" tıklayın.
- Relevan seçint zaman aralığı ve Z yığını.
- Yeni dosyayı kaydedin.
- Tüm görüntüleme dosyalar için adımları 35-38 gerçekleştirin.
4. Görüntüleme Veri Analizi
- Imaris yazılım (Bitplane AG, Zürih İsviçre) kullanarak LSM dosyaları açın.
- "Aşan" tıklayın. "Görüntü İşleme" menüsüne tıklayın ve "Zaman ve Z Swap" seçin. Bu, görüntünün doğru kırpma yardımcı olacaktır.
- "Düzenle" araç çubuğu tıklayın ve açılan menüde "Kes 3D" seçeneğini seçin. Hücre çevresindeki sadece alanı bulunmaktadır görüntü kırpın. Biz hücre merkezli bir 300 × 300 piksel kare kırpma öneririz. Hücresinin şekli ve yeri zamanla değişebilir unutmayın. T ekseni Gözlem, hücre her zaman noktalarında kırpılmış bölge içinde olduğundan emin olun.
- "Görüntü İşleme" menüsüne tıklayın ve resmin orijinal zamansal ayrılık geri yüklemek için "Zaman ve Z Swap" seçin.
- Ana araç çubuğunda "COLOC" düğmesine basın. "De Zaman Yapı seçins. COLOC ". Imaris otomatik olarak her zaman noktasında her kanal için yoğunluk eşik hesaplar.
- "Kanal İstatistik" seçerek ko analiz sonuçlarını görüntülemek. "İhracat" tıklayarak veri verir.
- Her görüntülü hücre için 6 Adım 1 tekrarlayın. Biz en az 50 hücre bu şekilde analiz edilmesi önerilir.
- Ortalama Pearson ko katsayısı ve standart hata veya sapma hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz canlı T-hücre görüntüleme ve analiz bir örnek sunuyoruz. Görüntüleme deney öncesinde, SLP76 eksikliği T hücreleri (J14) floresan protein (Şekil 1) ifadesinin saptanması için FACS kullanımı ile analiz edilmiştir. Etiketli sinyal proteinleri AÇSAP ağırlıklı-Nck ve SLP76-mYFP ile transfekte T hücreleri aktive slaytlar üzerinde biriken ve T-hücre yayılan (Şekil 2) sırasında görüntülendi. Toplanan görüntüleri aktivasyon ve (Şekil 3) yayılan boyunca protein yerelleştirme dinamiklerini göstermektedir. Insan önyargı en aza indirirken bilgisayarlı görüntü işleme, yeni anlayışlar ve görsel hücrelerden kantitatif bilgi sağlar. Hücresel aktivasyon sürecinde iki proteinin ko incelemek için, Imaris yazılımı (Bitplane AG, Zürich İsviçre) ko aleti kullanılmaktadır. Görüntülü hücreler boyunca farklı zaman noktaları arasında ko katsayıları karşılaştırarak, biz Nck ve SLP76 en ko T-hücre aktivasyonu (p> 0.3) (Şekil 4) boyunca önemli bir değişiklik olmadığını tespit etmek mümkün.
Şekil 1. (B) mYFP,,. Hücrelerinin FACS analizi çift veri (A) 'AÇSAP ağırlıklı için floresan yoğunluğu histogramlar olarak gösterilmiştir floresan-etiketli proteinleri ile transfekte edilmiş ve (C), bir nokta arsa olarak. AÇSAP ağırlıklı-Nck ve SLP76-mYFP ile transfekte J14 hücrelerin floresan sırasıyla, kırmızı ve sarı temsil edilmektedir. Untransfected J14 negatif kontrol hücreleri siyah çizgiler ile gösterilir.
/ Files/ftp_upload/50076/50076fig2.jpg "/>
Şekil 2. Canlı bir şematik T hücre analizi yayılan (A) T hücre aktive slaytların hazırlanması;. (B) T hücre yayılan tahlil ve analiz yaşıyor;. (C) mikroskopi kurulum büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. AÇSAP ağırlıklı-Nck ve SLP76-mYFP eksprese eden bir T-hücresi aktivasyonu işlemi sırasında Nck ve SLP76 dağılımı. Hücreler, anti-CD3 antikoru uyarıcı önceden kaplanmış lameller üzerinde bırakılan ve sürekli olarak 7 dakikalık bir süre için görüntülendi. SLP76-mYFP sarı gösterilir ise AÇSAP ağırlıklı-Nck, mavi ile temsil edilir.
Şekil 4. Protein ko kantitatif analizi. Hücrelerin Görüntü işleme Imaris yazılım (Bitplane AG, Zürih İsviçre) kullanılarak yapıldı. Ko AÇSAP ağırlıklı kanalın yoğunluğu ve her piksel için mYFP kanal arasında Pearson korelasyon katsayısı olarak hesaplanır. Farklı zaman noktalarında hesaplanan Pearson ko katsayıları karşılaştırılmıştır. Otuz saniye aktivasyon sürecine, AÇSAP ağırlıklı-Nck ve SLP76-mYFP en ko katsayısı (p <0.05) önemli ölçüde artmıştır. Bu sonuçlar,> 50 bağımsız hücreler analiz ile hesaplanmıştır. Ortalama ± standart hata gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çoklu hücresel süreçlerin düzenlenmesi ve fonksiyonu protein-protein etkileşimleri oluşumu ve sonlandırma bağlıdır. Mikroskobik görüntüleme canlı hücrelerde floresan etiketli proteinlerin gerçek zamanlı izleme sağlar. Işaretlenmiş olan proteinlerin ko proteinler arasında doğrudan veya dolaylı olarak etkileşime önerebilir ve bu immüno-çökeltme gibi biyokimyasal yöntemler ile elde edilen bulguların güçlendirmek için kullanılabilir. Biyokimyasal yöntemler farklı olarak, canlı hücre görüntüleme bu arası protein etkileşimleri ortaya gibi fizyolojik süreçlerin izlenmesi kolaylaştırmak ve proteinlerin hücresel dağılımının saptanması, uzaysal ve bu süre boyunca gözlem sağlar. Ko kantitatif analiz için çeşitli araçlar geliştirilmiştir; Pearson korelasyon katsayısı iki protein 12 arasındaki ko derecesi ölçümü için çok çekici ve yaygın olarak kullanılan yöntem olmaya devam etmektedir. Da floresan rezonans Energy transferi (FRET) deneyleri yakın (10 nm) ile karakterize arası protein etkileşimleri tespiti sağlamak, bu yöntem özel ayarları (kullanılan floresan etiketlemeleri ekipman ve uyumluluk) ve karmaşık bilgi işlem gerektirir. Çoğu kullanım, ko analizi için, biyokimyasal yöntemler ile birleşik olarak, bir kolay kullanımlı için teşkil eder ve zaman içinde protein-protein etkileşimleri gözlemlemek için basit bir yöntem.
Ya kanal için yoğunluğu eşiğin altına piksel görmezden, analiz piksel için bir floresan yoğunluklu eşik kurulması doğru ve hassas ko analiz için kritik önem taşımaktadır. Bu eşik amacı ve otomatik belirlenmesi için yaygın olarak kullanılan algoritma 13. Costes ve arkadaşları tarafından geliştirilen ve bu Imaris ve Volocity gibi görüntü işleme programları tarafından yürütülmektedir.
Burada, canlı T-hücresi görüntüleme bölgesinin kullanımını göstermekSLP76 dinamiklerini analiz etmek için metodunu, önemli bir T-hücrelerinde, iskele ve Nck, bir adaptör protein, her ikisi de T-hücresi aktivasyonu için gerekli olan 14,15. Etkinleştirme sırasında toplanan T hücrelerinin Görüntüleri iki protein (Şekil 3), hücresel aktivasyon sürecinde kolokalize olduğunu göstermektedir. Bu nicel etkinleştirme işlemi boyunca toplanan görüntülerde Pearson ko testi pekiştirilmiştir. -1 -1 Bir puan anti-korelasyon anlamına gelir 1, için Pearson ko katsayıları aralığı, 1 puan mükemmel ko ve 0 anlamına gelir iki görüntü kanallar arasında bir ilişki anlamına gelir. Farklı zaman noktaları için ve farklı hücreler için hesaplanan Pearson ko katsayılarının karşılaştırılması Nck ve SLP76 bu ko önemli hücresel aktivasyonu sırasında değişmez gösterir, ancak (p> 0.3, Şekil 4) sabit kalır. Da genel ko eşBu proteinlerin verimli aktivasyon süreci boyunca değişmez, bu dernek ve bu proteinlerin 18 arasında meydana gelen ayrışma dinamik bir süreç olasılığını ortadan kaldırmaz.
Biz sunulan protokol de gerekir, gibi hücre büyüme koşullarının ayarlanması, söz konusu hücre çizgisi bir transfeksiyon için uygun ayar seçilmesi ve eğer varsa, hücresel aktivasyon işlemi değiştirerek diğer hematopoietik hücre hatları için adapte edilebilir. Biz uygun ayarların kullanımı ile, LSM 510 Meta konfokal mikroskop kullandı, diğer konfokal mikroskopi sistemleri başarıyla de kullanılabilir lütfen unutmayın.
Canlı T hücre görüntüleme kullanımı biyokimyasal ve moleküler yöntemler kullanılarak zamansal ve mekansal çözünürlükte kullanılamaz ile keşfedilmeyi sinyal olaylar sağlayan, düzenleyici ve aktivasyon işlemleri doğrudan takip edilmesine olanak sağlamaktadır. Biz basit bir meth mevcut, canlı bir T hücre yayılan deneyi yürüten gerçek zamanlı olarak ilgili proteinler izleme ve nicel sonuçlar için verileri analiz için od. Sonuç mikroskobu veriler de bu tür hücre-şekil indeksi analizi gibi diğer downstream uygulamalar, 16 için kullanılan ve özel deney düzeneği ve araştırma amacına göre, analiz 17,18 FRET edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Yazarlar teknik yardım için Sophia Fried teşekkür ederim. Hibe no.1659/08, 971/08 1503/08 491/10, hiçbir hibe Sağlık ve Bilim Bakanlıkları için İsrail Bilim Vakfı: MBS araştırma destek için aşağıdaki kurumlar teşekkür. 3-4.114 ve 3-6.540, geç Alexander Smidoda ve Emlak aracılığıyla İsrail Kanser Derneği ve Bio-tıp mükemmellik hibe için Taubenblatt Aile Vakfı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygomycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R87589 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame - Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 | |
References
- Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
- Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
- Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
- Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
- Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
- Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
- Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
- Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
- Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
- Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).
