Summary
نحن تصف طريقة التصوير الخلية الحية التي توفر نظرة ثاقبة ديناميات البروتين أثناء عملية التنشيط تي خلية. ونحن لشرح الاستخدام المشترك لتي خلية نشر الفحص، الفحص المجهري متحد البؤر وتحليل التصوير أن تسفر النتائج الكمية لمتابعة إشارات تشكيل المعقدة في جميع أنحاء تي خلية التنشيط.
Abstract
وتتوسط حماية ضد الأمراض المعدية من قبل 1،2 الجهاز المناعي. الخلايا اللمفية تي هي المنسقين ماجستير في الجهاز المناعي، وتنظيم وتفعيل والاستجابات من الخلايا المناعية متعددة 3،4. تي خلية التنشيط يعتمد على الاعتراف مستضدات محددة المعروضة بواسطة خلايا مقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة). مستقبلات مستضد الخلايا التائية (TCR) الخاصة بكل استنساخ خلايا T ويحدد مستضد خصوصية 5. الربط من TCR للمستضد الحث على الفسفرة من مكونات مجمع TCR. من أجل تعزيز تي خلية التنشيط، يجب ترانسدوسيد هذه إشارة من الغشاء إلى السيتوبلازم والنواة، وبدء مختلف الاستجابات حاسمة مثل تجنيد يشير البروتينات إلى TCR؛ موقع APC (المشبك المناعي)، وتفعيل الجزيئية، إعادة ترتيب هيكل الخلية، ارتفاع تركيز الكالسيوم داخل الخلايا، والتغيرات في التعبير الجيني 6،7. الصحيح فيitiation وإنهاء الإشارات تفعيل أمر حاسم لتي خلية الاستجابات المناسبة. النشاط من البروتينات مما يشير يعتمد على تشكيل وإنهاء البروتين البروتين التفاعلات، إضافة التعديلات متعدية مثل الفسفرة البروتين، وتشكيل المجمعات البروتين، ubiquitylation البروتين وتجنيد البروتينات لمختلف المواقع الخلوية 8. فهم الأعمال الداخلية للعملية التنشيط تي خلية أمر بالغ الأهمية لكلا البحوث المناعية والتطبيقات السريرية.
وقد وضعت فحوصات مختلفة من أجل تحقيق البروتين البروتين التفاعلات، ولكن فحوصات الكيمياء الحيوية، مثل المستخدمة على نطاق واسع طريقة التعاون للمناعي، لا تسمح الموقع البروتين يمكن أن يلاحظ، مما يحول دون مراقبة من معلومات قيمة حول ديناميات الخلوية الآليات. بالإضافة إلى ذلك، معظم هذه المقايسات عادة الجمع بين البروتينات من العديد من الخلايا المختلفة التي قد تكون في مراحل مختلفة من رانه عملية التحقيق الخلوية. هذا يمكن أن يكون لها تأثير ضار على القرار الزماني. استخدام التصوير في الوقت الحقيقي من الخلايا الحية يسمح كل من تتبع المكانية للبروتينات والقدرة على التمييز بين الأحداث يشير زمنيا، وبالتالي تسليط الضوء على ديناميات العملية 9،10. فإننا نقدم وسيلة من التصوير في الوقت الحقيقي من تشكيل الإشارات المعقدة خلال تفعيل الخلايا التائية. و transfected الأولية خلايا T أو T-خطوط الخلية، مثل Jurkat، مع البلازميدات ترميز للبروتينات ذات الاهتمام تنصهر إلى البروتينات الفلورية أحادى، ومنع oligomerization غير الفسيولوجية 11. يتم إسقاط تعيش خلايا تي خلال ساترة قبل المغلفة مع الأجسام المضادة الخلايا T-تفعيل 8،9، الذي يربط المجمع CD3/TCR، الأمر الذي أدى تنشيط خلايا T في حين التغلب على ضرورة تفعيل مستضدات محددة. يتم تصوير الخلايا تفعيلها باستمرار مع استخدام الفحص المجهري متحد البؤر. ويتم تحليل البيانات التصوير أن تسفر النتائج الكمية، مثل عمودمعامل ocalization من البروتينات الإشارة.
Protocol
1. ترنسفكأيشن خلايا T
- إعداد المنشط الحل Nucleofector Amaxa عن طريق خلط حل "الملحق" عدة إلى الحل Nucleofector. قد يتم تخزين الحل تفعيلها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.
- تنمو الخلايا التائية Jurkat في مستنبت [10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 1٪ حل البنسلين، الستربتوميسين، و 2 مم L-الجلوتامين في RPMI]. على النحو الأمثل، والخلايا ينبغي أن تستخدم بعد 1-2 أسابيع الذوبان. باستخدام مزارع الخلايا في النمو لوغاريتمي أمر بالغ الأهمية لتحقيق الكفاءة ترنسفكأيشن عالية وبقاء الخلية. بدلا من ذلك، مع تعديلات طفيفة، وهذا البروتوكول يمكن استخدامها مع الخلايا التائية الأولية، كما هو موضح سابقا 8. وينبغي التأكيد على أن مثل مدة عملية تنشيط خلايا T الأساسي هو أطول من خلايا تي Jurkat (~ 30 دقيقة)، شنت مرحلة المجهر يجب أن تستخدم نظام الحضانة للحفاظ على CO 2، ومستويات الرطوبة ودرجة الحرارة في جميع أنحاء عملية التنشيط.
- جمع 5× 10 6 خلايا T مرحلة سجل في ترنسفكأيشن في أنبوب 15 مل.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 7 دقائق في 400 × ز في درجة حرارة الغرفة.
- أثناء الطرد المركزي، وإعداد لوحة 6 جيدا. ملء بئر واحدة لكل ترنسفكأيشن مع 5 مل مستنبت، وقبل احتضان عند 37 درجة مئوية.
- جمع أنابيب من أجهزة الطرد المركزي وتجاهل طاف. Resuspend وبيليه الخلية في 1 مل RPMI.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 7 دقائق في 400 × ز في درجة حرارة الغرفة.
- أثناء الطرد المركزي، وإعداد الحل ترنسفكأيشن. في بئر واحدة من لوحة 96 جيدا، خلط تنشيط 100 ميكرولتر Amaxa الحل Nucleofector أعدت في الخطوة 1 مع 5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد من الاهتمام ترميز البروتين الموسومة fluorescently. على النحو الأمثل، يجب أن يكون تركيز الحمض النووي أكبر من 1 ميكروغرام / مل من أجل تجنب تمييع الحل ترنسفكأيشن.
- مزيج جيد من قبل pipetting لطيف.
- بعد الطرد المركزي من الخلايا، وإزالة بعناية طاف كل حين لا دisturbing بيليه.
- ماصة الحل DNA / ترنسفكأيشن مرتين.
- إضافة محلول الحمض النووي / ترنسفكأيشن لبيليه.
- نقل الخلايا إلى Amaxa كفيت.
- إدراج كفيت في الجهاز Nucleofector Amaxa.
- استخدام Amaxa H-10 ترنسفكأيشن الإعداد ل electroporation (لJurkat) أو T-23 (للخلايا T الابتدائي).
- إزالة لوحة 6 جيدا من الحاضنة.
- التالية electroporation، ونقل بعناية طاف مع تعليق الخلية إلى لوحة 6 جيدا باستخدام ماصة باستور. بيليه تتألف من حطام خلية قد تشكل. تجنب نقل بيليه.
- احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- نقل 2.5 مل من تعليق خلية من كل بئر إلى بئر جديد. إضافة 2.5 مل مستنبت دافئ (موضح في الخطوة 2) إلى كل بئر.
- بعد 72 ساعة، ونقل الخلايا إلى أنبوب العقيمة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق في 400 × ز في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف واستبدالها وايال مستنبت تستكمل مع اختيار خلايا الثدييات المضادات الحيوية المناسبة لالبلازميد المستخدمة (تطبيق تركيز مناسبة للمضادات الحيوية المستخدمة؛ استخدمنا G418 و / أو هيغروميسين في تركيزات من 1.3 ملغ / مل و / أو 0.2 ملغ / مل، على التوالي). ثقافة تعليق الخلية في بئر جديدة. بدلا من ذلك، يمكن خلايا transfected عابر والتقط 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن. لإعداد الخلايا transfected عابر، وشارك في بالنقل الخلايا مع البلازميدات اثنين في وقت واحد في الخطوة 8، واستمرار عادة إلى الخطوة 20، ثم انتقل مباشرة إلى الخطوة 23. لاحظ أنه في ظل هذا السيناريو، فإن الخلايا ينبغي استخدامها على الفور، وعموما حدتها مضان هو غير متجانسة وليس بالضرورة عالية.
- تنمو الخلايا مع مستنبت تستكمل مع المضادات الحيوية الاختيار المناسب. انقسام الخلايا وتكملة لهم مع المضادات الحيوية تستكمل مستنبت حسب الحاجة.
- بعد 2 أسابيع، تحقق ترنسفكأيشن ناجحة مع استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية (انفلونزافرز الخلايا orescence تنشيط) على النحو التالي:
- جمع 10 6 الخلايا transfected، 10 6 الخلايا transfected وهمية (المراقبة السلبية)، و 10 6 خلايا التي هي معروفة للتعبير عن ثابت البروتين الموسومة fluorescently. إذا و transfected الخلايا مع بروتين فلوري أكثر من واحد (راجع الخطوة 27)، متعددة الاستخدامات، وخطوط الخلايا الموسومة منفردة والضوابط الإيجابية.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 7 دقائق في 400 × ز في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل طاف. Resuspend الخلايا في 500 العازلة FACS ميكرولتر (PBS ث / س كا 2 + والمغنيسيوم 2 +، 5٪ FCS، 0.05٪ أزيد الصوديوم).
- استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليلية للتحقق من مضان الخلوية. قارن مضان من الخلايا transfected إلى أن من الضوابط السلبية والإيجابية.
- ل transfect الخلايا مع مبلغ إضافي، الموسومة fluorescently البروتين، كرر الخطوات من 3-26 باستخدام الخلايا transfected.
- الخلايا بعرض مستويات عالية من مضان ينبغي استخدامها. على النحو الأمثل، لا يقل عن 50٪ منالخلايا في الثقافة يجب أن تكون نيون للغاية. ويمكن زيادة مضان الخلية عن طريق الفرز الخلية عبر نظام مراقبة الأصول الميدانية.
يجب أن تنصهر أي البروتينات الموسومة إضافية لfluorophores مختلفة ويتم تشفيرها على البلازميدات ترميز للمضادات الحيوية اختيار مختلفة. وينبغي أن يستكمل اختيار المتوسطة للخلايا transfected مع أكثر من واحد البلازميد مع جميع المضادات الحيوية المناسبة.
2. تي خلية نشر تحضير الفحص
- استخدام لاب تيك II نظام ساترة الألمانية 4 شرائح الغرفة. تأكد من عدم خدش بالصدفه السطح الداخلي للدوائر، على سبيل المثال مع طرف ماصة، أثناء إعداد أو استخدام.
- إعداد 50 مل من محلول إعداد الشريحة: خذ 4.6 مل من 12 M (37٪) حمض الهيدروكلوريك، إضافة 38.5 مل الإيثانول بنسبة 100٪، و 6.9 مل من الماء المقطر على نحو مضاعف.
- ملء كل غرفة من الشريحة مع 500 ميكرولتر حل إعداد الشرائح.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- نضح في غرفةق، تجفيفها تماما.
- احتضان الشرائح غير مغطى لمدة 1 ساعة عند 45 درجة مئوية حتى تجف تماما.
- إعداد 0.01٪ محلول بولي-L-يسين عن طريق تمييع 0.1٪ بولي-L-يسين (سيغما الدريخ) في الماء المقطر مزدوجة.
- تطبيق 500 ميكرولتر لكل غرفة.
- احتضان الشرائح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نضح الدوائر وتجفيفها تماما.
- احتضان لمدة 3 ساعة على 45 درجة مئوية حتى تجف تماما.
- ويمكن تخزين الشرائح المغلفة الجافة لعدة شهور في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد الحل الضد تفعيل. استخدام الأجسام المضادة لمكافحة CD3: إما HIT3a (BD Pharmingen، # 555337) أو UCHT1 (BD Pharmingen، # 555330)، 10 ميكروغرام / مل في 400 ميكرولتر PBS، لكل غرفة. وينبغي إعداد هذا الحل قبل إعداد الشرائح قريبا.
- ملء كل غرفة مع 400 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة تفعيل.
- احتضان الشرائح لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية، أو يفضل، بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- إزالة الأجسام المضادة تفعيل سولution ويغسل فورا الغرفة مرتين مع 300 ميكرولتر PBS. من هذه النقطة، تأكد تبقى ملأت غرف مع العازلة.
- تخزين الشريحة PBS مملوءة في 4 درجات مئوية. نقترح استخدام الدوائر الشريحة أعد في غضون الأسبوع 1.
3. تنشيط خلايا T والتصوير
- إعداد العازلة التصوير [HEPES 1.25 مل (1 M)، 10 مل FCS، 38.75 مل RPMI دون الفينول الأحمر]. ويمكن تخزين العازلة التصوير في 4 درجات مئوية بعد الترشيح.
- تفعيل زايس LSM 510 ميتا المجهر. تدفئة المجهر مع صفيحة تسخين إطار تصاعد مستمر إلى 37 درجة مئوية. حدد "وضع الخبير".
- انقر فوق علامة التبويب "اكتساب" وفتح علامات التبويب التالية: ليزر؛ الميكروسكوب؛ التكوين؛ الفحص؛ السلاسل الزمنية.
- تفعيل الليزر الحاجة. لإثارة MCFP وmYFP، تعيين ليزر الأرجون / 2 إلى "الاستعداد" لمدة 5 دقائق، ثم إلى "على".
- إذا تم تنفيذ هذا الاختبار التصوير الخلية الحية قبل، وذلك باستخدام نفس fluorophores، فتح الملف LSM الناتجة عن ذلك، انقر فوق "إعادة الاستخدام" طيخدع، والاستمرار من الخطوة 9. تستمر إلا من الخطوة 6.
- تحديد قنوات باستخدام مرشحات مناسبة لالإثارة وانبعاث من البروتينات الفلورية المستخدمة.
- في "مسح التحكم" نافذة، حدد الخيار المكدس Z.
- أدخل المعلمات المسح التالية: عدد شرائح: 5؛ الفاصل الزمني: 0.5 ميكرومتر؛ شريحة الحالية: 3.
- إعداد الرقمية الحمام Accublock الجاف (Labnet) عند 37 درجة مئوية قرب المجهر.
- تدفئة العازلة التصوير إلى 37 درجة مئوية.
- إعداد الشريحة المخزنة بواسطة الشفط في برنامج تلفزيوني، والاستعاضة عنها مع 600 ميكرولتر من العازلة التصوير دافئ.
- احتضان الشريحة عند 37 درجة مئوية. إبقاء الشريحة في الحاضنة حتى الخطوة رقم 13، لمدة 15 دقيقة على الأقل.
- جمع 5 × 10 5 خلايا T خلايا.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 2 دقيقة في 400 × ز.
- تجاهل طاف.
- Resuspend الخلايا في 1 مل العازلة التصوير دافئ، ونقلها إلى أنبوب إيبندورف 1.5 مل.
- وضع رEST أنبوب على حمام جاف الرقمية Accublock.
- خذ الشريحة حرارة من الحاضنة، وتركيبها على حرارة المجهر إطار تصاعد مستمر.
- انقر فوق "VIS" رمز.
- مزيج تعليق الخلية وإزالة 1-2 ميكرولتر.
- إدراج غيض من ماصة في المخزن المؤقت التصوير فوق الجزء السفلي من الشريحة. تجنب خدش الشريحة.
- بذور الخلايا خلال فتحة الهدف لل.
- تبدأ على الفور تتبع بصريا الخلايا الفلورسنت لأنها تنحدر. حدد الخلية التي يعرض مضان عالية في كل القنوات.
- قبل الخلية تصل إلى سطح الشريحة، قم بتنشيط وضع LSM.
- تبديل واحد فقط ليزر الإثارة. اختر الليزر التي لديك قناة مدينة دبي للإنترنت.
- ضبط التكبير إلى 1. انقر فوق "سريع XY" رمز. انقر فوق "إيقاف" رمز. باستخدام أداة المحاصيل، وتحديد العائد على الاستثمار تركز على الخلية.
- ضبط التكبير إلى 3. انقر فوق "سريع XY" رمز، ثم يدويا تعيين التركيز لمشاهدة أمثل الخلية. انقر فوق "إيقاف" ICOن.
- تبديل جميع أجهزة الليزر الإثارة المطلوبة.
- بدء التسجيل بالنقر على "StartT" رمز. صورة الخلية لمجمل عملية نشر (عادة 5 دقائق). عند الانتهاء، انقر فوق "إيقاف" رمز.
- حفظ الملف.
- للحصول على خلايا إضافية، انقر فوق "VIS" رمز. إذا كان هناك الخلايا التي لم تدخل بعد حيز الاتصال مع أسفل الشريحة، تستمر من 23 خطوة. تجنب الخلايا التصوير التي بدأت بالفعل عملية نشر. المضي قدما خلاف ذلك إلى الخطوة 32.
- إذا كانت المنطقة الشريحة المرصودة هي في معظمها خالية من الخلايا، إضافة قسامة آخر من الخلايا (متابعة من الخطوة 20). المضي قدما خلاف ذلك إلى الخطوة 33.
- للحصول على خلايا إضافية، حرك الشريحة بحيث المنطقة فوق الفتحة هدف يخلو من الخلايا.
- إضافة قسامة آخر من الخلايا (وتستمر من الخطوة 20).
- بعد القيام بجميع التصوير المطلوب، فتح ملف LSM المحفوظة.
- انقر على زر "معرض"، "تايم + Z" و "المجموعة الثانوية".
- اختر relevanر نطاق الوقت وZ المكدس.
- حفظ الملف الجديد.
- تنفيذ الخطوات 35-38 لكافة الملفات التصوير.
4. التصوير تحليل البيانات
- فتح الملفات باستخدام برنامج LSM Imaris (Bitplane AG، زيوريخ، سويسرا).
- انقر على زر "فق". انقر على "معالجة الصور" القائمة، ثم حدد "مبادلة الوقت وZ". وهذا سوف يساعد في زراعة المحاصيل الصحيح للصورة.
- انقر فوق "تحرير" شريط الادوات واختر "3D المحاصيل" الخيار في القائمة المنسدلة. اقتصاص الصورة لتشمل فقط المنطقة المحيطة الخلية. نقترح الاقتصاص مربع بكسل 300 × 300 تركزت على الخلية. لاحظ أن شكل وموقع الخلية يمكن أن تتغير بمرور الوقت. مراقبة محور تي، وتأكد من أن الخلية داخل المنطقة المزروعة في كل نقطة زمنية.
- انقر على "معالجة الصور" القائمة، ثم حدد "مبادلة الوقت وZ" لاستعادة فصل الزمنية الأصلية للصورة.
- اضغط على زر "Coloc" على شريط الأدوات الرئيسية. حدد "بيلد الوقت ديف. سوف Coloc ". Imaris تلقائيا بحساب عتبات كثافة لكل قناة في كل نقطة زمنية.
- عرض نتائج تحليل colocalization عن طريق اختيار "القناة الاحصائيات". تصدير البيانات بالنقر على "تصدير".
- كرر الخطوات من 1-6 لكل خلية المصورة. نوصي بأن يتم تحليلها لا يقل عن 50 خلايا في هذه الطريقة.
- حساب متوسط معامل colocalization بيرسون والخطأ المعياري أو الانحراف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نقدم مثالا لايف التصوير T-خلية والتحليل. قبل التجربة والتصوير، وقد تم تحليل SLP76 خلايا T ناقص (J14) مع استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لتحديد التعبير عن البروتينات الفلورية (الشكل 1). أودعت خلايا T transfected مع البروتينات إشارات الموسومة MCFP-NCK وSLP76-mYFP أكثر الشرائح تفعيل وتصويرها خلال T-خلية من الانتشار (الشكل 2). الصور التي تم جمعها تظهر ديناميات توطين البروتين في جميع أنحاء تفعيل ونشر (الشكل 3). معالجة الصور بالحاسوب يقدم أفكارا جديدة والمعلومات الكمية من الخلايا تصور، مع التقليل من التحيز الإنسان. لدراسة colocalization من البروتينات اثنين خلال عملية التنشيط الخلوية، ونحن استخدام الأداة colocalization من البرنامج Imaris (Bitplane AG، زيوريخ، سويسرا). بمقارنة معاملات colocalization بين نقاط زمنية مختلفة عبر الخلايا المصورة، كنا قادرة على التأكد من أن colocalization من NCK وSLP76 لا يتغير بشكل ملحوظ في جميع أنحاء تنشيط خلايا T (P> 0.3) (الشكل 4).
الشكل 1. تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية من الخلايا transfected مزدوجة مع البروتينات fluorescently المسمى وتظهر بيانات ورسوم بيانية للكثافة مضان (A) MCFP؛ (B) mYFP، و (ج) باعتباره مؤامرة نقطة. يتم تمثيل كثافة مضان من الخلايا J14 transfected مع MCFP-NCK وSLP76-mYFP في السماوي والأصفر، على التوالي. يشار إلى Untransfected J14 الخلايا السيطرة السلبية من قبل خطوط سوداء.
/ files/ftp_upload/50076/50076fig2.jpg "/>
الشكل 2. A التمثيل التخطيطي لحية T-خلية نشر مقايسة (أ) إعداد الشرائح تفعيل خلايا T؛ (B) يعيشون تي خلية نشر الفحص والتحليل؛ (C) الإعداد المجهر اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل (3). أسقطت توزيع NCK وSLP76 أثناء عملية التنشيط تي خلية. الخلايا معربا عن MCFP-NCK وSLP76-mYFP على مكافحة CD3 الأجسام المضادة المحفزة coverslips على قبل المغلفة وتصويرها باستمرار لمدة 7 دقائق. ويمثل MCFP-NCK بواسطة سماوي، في حين يظهر SLP76-mYFP باللون الأصفر.
المحافظة على together.within الصفحات = "دائما"> 
الشكل 4. تم إجراء التحليل الكمي للcolocalization البروتين. معالجة الصور من الخلايا باستخدام برنامج Imaris (Bitplane AG، زيوريخ، سويسرا). ويحسب معامل Colocalization كما بيرسون علاقة بين شدة القناة MCFP وقناة mYFP لكل بكسل. تتم مقارنة معاملات colocalization بيرسون تحسب من نقاط زمنية مختلفة. ثلاثين ثانية في عملية التنشيط، تم زيادة معامل colocalization من MCFP-NCK وSLP76-mYFP معنويا (P <0.05). تم حساب هذه النتائج من خلال تحليل> 50 خلية مستقلة. يعني ± وترد الخطأ المعياري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تنظيم وظيفة من العمليات الخلوية متعددة تعتمد على تشكيل وإنهاء البروتين البروتين التفاعلات. التصوير المجهري يسمح تتبع في الوقت الحقيقي من البروتينات الموسومة fluorescently في الخلايا الحية. Colocalization من البروتينات الموسومة يمكن أن تشير إلى التفاعل المباشر أو غير المباشر بين البروتينات، ويمكن استخدامها لتعزيز النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق أساليب الكيمياء الحيوية، مثل مناعي. خلافا لأساليب الكيمياء الحيوية، والتصوير الخلية الحية يسمح لهذه التفاعلات بين البروتينات التي يتعين مراعاتها مكانيا وعلى مر الزمن، وتسهيل رصد العمليات الفسيولوجية وقوعها والكشف عن توزيع الخلوية للبروتينات. وقد تم تطوير أدوات مختلفة للتحليل الكمي من colocalization؛ يبقى معامل ارتباط بيرسون وسيلة جذابة للغاية ومتاحة على نطاق واسع لتقدير لدرجة colocalization بين اثنين من البروتينات 12. بينما صدى مضان هنقل (الحنق) تجارب شركة نيرجي المساعدة في الكشف عن التفاعلات بين البروتينات التي تتميز مقربة (10 نانومتر)، يتطلب هذا الأسلوب الإعدادات المتخصصة (المعدات والتوافق من taggings الفلورسنت المستخدمة) ومعالجة البيانات المعقدة. بالنسبة لمعظم الاستخدامات، تحليل colocalization، في الاقتران مع أساليب الكيمياء الحيوية، ويشكل وسيلة سهلة الاستخدام وطريقة واضحة لمراقبة البروتين البروتين التفاعلات مع مرور الوقت.
إنشاء عتبة كثافة مضان لتحليل بكسل، في حين تجاهل بكسل تحت عتبة كثافة لأي قناة، ذات أهمية حاسمة لتحليل دقيق وحساس colocalization. وقد تم تطوير الخوارزمية المستخدمة عادة لتحديد الهدف والآلية لهذه العتبات من قبل كوستيس آخرون 13 ويتم تنفيذه بواسطة برامج معالجة الصور مثل Imaris وVolocity.
هنا، ونحن لشرح استخدام الحية ايماج تي خليةطريقة جي لتحليل ديناميات SLP76، سقالة رئيسيا في خلايا T، وNCK، وهو بروتين محول، وكلاهما ضروري لتنشيط خلايا T 14،15. صور من الخلايا T التي تم جمعها خلال تفعيل توحي بأن colocalized البروتينات اثنين خلال عملية التنشيط الخلوي (الشكل 3). وهذا ما تؤكده كميا عن طريق إجراء اختبار colocalization وبيرسون على الصور التي تم جمعها خلال عملية التنشيط. colocalization معاملات وتتراوح بيرسون من -1 إلى 1، حيث يعني بنتيجة -1 المضادة للارتباط، على درجة من 1 يدل colocalization الكمال و0 يعني عدم وجود ارتباط بين القنوات صورة اثنين. مقارنة معاملات colocalization بيرسون يحسب للحصول على نقاط زمنية مختلفة وللخلايا مختلفة إلى أن colocalization من NCK وSLP76 لا يتغير بشكل ملحوظ خلال تفعيل الخلوية، ولكن لا تزال مستمرة (P> 0.3، الشكل 4). في حين أن التعاون colocalization العامكفاءة هذه البروتينات لا تتغير طوال عملية التنشيط، فإنه لا يلغي احتمال وجود عملية دينامية للجمعية وتفارق التي تحدث بين هذه البروتينات 18.
ويمكن أيضا أن بروتوكول قدمنا أن تتكيف مع غيرها من خطوط الخلايا المكونة للدم من خلال تعديل ظروف نمو الخلايا كما هو مطلوب، واختيار الإعداد ترنسفكأيشن مناسبة لخط الخلية في سؤال وتعديل عملية التنشيط الخلوية، إن وجدت. يرجى ملاحظة أنه بينما استخدمنا LSM 510 ميتا المجهر متحد البؤر، مع التعديلات واستخدام الإعدادات المناسبة، نظم الفحص المجهري متحد البؤر الأخرى يمكن أن تستخدم بنجاح أيضا.
استخدام التصوير الحية تي خلية يسمح العمليات التنظيمية والتفعيل ليتم رصدها مباشرة، مما يتيح الأحداث يشير إلى أن تستكشف مع القرار الزماني والمكاني غير متوفرة باستخدام أساليب الكيمياء الحيوية والجزيئية. نقدم ميث مباشرةالتطوير التنظيمي لتنفيذ حية T-خلية الانتشار فحص ورصد البروتينات ذات الصلة في الوقت الحقيقي وتحليل البيانات لتسفر عن نتائج الكمي. ويمكن أيضا أن تستخدم البيانات الناتجة المجهري للتطبيقات المصب الأخرى، مثل تحليل مؤشر الخلية على شكل 16 والحنق تحليل 17،18، اعتمادا على الإعداد التجريبية محددة وأهداف البحث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا أي تضارب في المصالح في الكشف عنها.
Acknowledgments
المؤلفان بالشكر صوفيا فرايد للحصول على المساعدة الفنية. MBS يشكر الجهات التالية للحصول على دعم أبحاثهم: مؤسسة العلوم الإسرائيلية للحصول على منح no.1659/08، 971/08، 1503-1508 و 491/10، وزارتي الصحة والعلوم للحصول على منح لا. 3-4114 3-6540 و، وجمعية السرطان اسرائيل من خلال تركة الراحل الكسندر Smidoda، ومؤسسة أسرة Taubenblatt للحصول على منحة التميز الادوية الحيوية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygomycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R87589 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame - Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 | |
References
- Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
- Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
- Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
- Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
- Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
- Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
- Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
- Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
- Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
- Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).
