Summary
Vi beskriver en live-cell imaging metod som ger en inblick i protein dynamik under T-cells aktivering process. Vi visar den kombinerade användningen av T-cell sprider analysen, konfokalmikroskopi och bildanalys för att ge kvantitativa resultat att följa signalering komplexbildning hela T-cell aktivering.
Abstract
Skydd mot infektionssjukdomar medieras av immunsystemet 1,2. T-lymfocyter är befälhavaren samordnare av immunförsvaret, reglerar aktivering och svar av flera immunceller 3,4. T-cells aktivering är beroende av erkännande av specifika antigener visas av antigenpresenterande celler (APC). Den T-cell-antigenreceptorn (TCR) är specifika för varje T-cellklon och bestämmer antigenspecificitet 5. Bindningen av TCR till antigenet inducerar fosforylering av komponenter i TCR-komplexet. I syfte att främja en T-cells aktivering, måste denna signal omvandlas från membranet till cytoplasman och kärnan, initiera olika viktiga reaktioner, såsom rekrytering av signalering proteiner till TCR, APC webbplats (immun synaps), deras molekylära aktivering, cytoskeletal omlagring, förhöjning av intracellulär kalcium koncentration, och förändringar i genuttryck 6,7. Den korrekta iitiation och uppsägning av aktiverande signaler är avgörande för lämpliga T-cells svar. Aktiviteten av signalproteiner är beroende av bildandet och avslutande av protein-proteininteraktioner, post translationella modifieringar såsom proteinfosforylering, bildning av proteinkomplex, protein ubiquitylation och rekryteringen av proteiner till olika cellulära platser 8. Förstå inre arbetet i T-cells aktivering process är avgörande för både immunologisk forskning och kliniska tillämpningar.
Olika analyser har utvecklats i syfte att undersöka protein-protein-interaktioner, men gör biokemiska analyser, såsom det ofta används co-immunoprecipitation metoden, inte tillåta protein plats att skönjas, vilket utesluter observation av värdefulla insikter om dynamiken i cellulära mekanismer. Dessutom dessa bulk analyser kombineras vanligen proteiner från många olika celler som kan vara i olika stadier av tHan undersökte cellulär process. Detta kan ha en skadlig effekt på tidsupplösning. Användningen av realtid avbildning av levande celler tillåter både den rumsliga spårning av proteiner och förmågan att tidsmässigt skilja mellan signalering händelser, alltså belysa dynamiken i processen 9,10. Vi presenterar en metod för realtid avbildning av signalering-komplexbildning under T-cells aktivering. Primära T-celler eller T-cellinjer, såsom Jurkat, transfekteras med plasmider som kodar för proteiner av intresse sammansmälta med monomera fluorescerande proteiner, hindrar icke-fysiologisk oligomerisation 11. Live T-celler sjönk under ett täckglas förbelagt med T-cell-aktiverande antikropp 8,9, som binder till CD3/TcR komplexet, inducera T-cells aktivering samtidigt undvika behovet av specifika aktiverande antigener. Aktiverade celler ständigt avbildas med hjälp av konfokalmikroskopi. Imaging data analyseras för att ge kvantitativa resultat, såsom colocalization koefficient för de signalproteiner.
Protocol
Ett. T-celltransfektion
- Förbered aktiverade Amaxa Nucleofector lösning genom att blanda satsens "Tillägg" lösning på Nucleofector Solution. Den aktiverade lösningen kan förvaras vid 4 ° C i upp till tre månader.
- Väx Jurkat T-celler i odlingsmedium [10% fetalt kalvserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin-lösning, och 2 mM L-glutamin i RPMI]. Optimalt bör celler användas 1-2 veckor efter upptining. Använda cellkulturer i logaritmisk tillväxt är avgörande för hög transfektion effektivitet och cellernas överlevnad. Alternativt, med mindre modifieringar, kan detta protokoll användas med primära T-celler, som tidigare beskrivits 8. Det bör understrykas att eftersom varaktigheten av aktiveringsprocessen av primära T-celler är längre än den hos Jurkat T-celler (~ 30 min), monterat en mikroskop scenen inkubationssystemet måste användas för att bibehålla CO2, luftfuktighet och temperatur genom hela aktiveringsprocessen.
- Samla 5× 10 6 log-fas T-celler per transfektion till en 15-ml tub.
- Centrifugera cellerna under 7 min vid 400 x g vid rumstemperatur.
- Under centrifugeringen, förbereda en 6-brunnars platta. Fyll en brunn för varje transfektion med 5 ml odlingsmedium, och pre-inkubera vid 37 ° C.
- Samla rören från centrifugen och kassera supernatanten. Resuspendera cellpelleten i 1 ml RPMI.
- Centrifugera cellerna under 7 min vid 400 x g vid rumstemperatur.
- Under centrifugering, förbereda transfektion lösningen. I en brunn i en 96-brunnar, blanda aktiverad 100 pl Amaxa Nucleofector lösning som framställts i steg 1 med 5 ^ g DNA från plasmiden av intresse som kodar för en fluorescent märkt protein. Optimalt bör DNA-koncentrationen vara större än 1 | ig / ml för att undvika utspädning av transfektionslösningen.
- Blanda väl genom försiktig pipettering.
- Efter centrifugering av cellerna, försiktigt bort alla supernatanten utan disturbing pelleten.
- Pipettera DNA / transfektion lösning två gånger.
- Tillsätt DNA / transfektion lösning till pelleten.
- Överför cellerna till Amaxa kyvetten.
- Sätt i kyvetten i Amaxa Nucleofector enheten.
- Använd H-10 Amaxa transfektion inställning för elektroporering (för Jurkat) eller T-23 (för primära T-celler).
- Ta den 6-brunnar från inkubatorn.
- Efter elektroporering, noggrant överför supernatanten med cellsuspensionen till den 6-brunnar med användning av en pasteurpipett. En pellet bestående av cellfragment bildas. Undvik att överföra pelleten.
- Inkubera cellerna i 24 timmar vid 37 ° C.
- Överför 2,5 ml av cellsuspension från varje brunn till en ny brunn. Tillsätt 2,5 ml varm odlingsmedium (beskrivs i steg 2) till varje brunn.
- Efter 72 timmar, överföra celler till ett sterilt rör och centrifugera i 7 minuter vid 400 x g vid rumstemperatur. Avlägsna supernatanten och ersätta det with odlingsmedium kompletterat med däggdjurscellen val antibiotikum lämplig för den använda plasmiden (tillämpa en koncentration som är lämplig för de använda antibiotika, vi använde G418 och / eller Hygromycin i koncentrationer av 1,3 mg / ml och / eller 0,2 mg / ml, respektive). Kultur cellsuspensionen i en fräsch väl. Alternativt kan cellerna transfekteras transient och avbildas 48 h efter transfektion. För att bereda tillfälligt transfekterade celler, co-transfektera cellerna med de två plasmider samtidigt vid steg 8, fortsätter normalt till steg 20, och gå sedan direkt till steg 23. Observera att det enligt detta scenario, bör cellerna användas omedelbart, och i allmänhet deras fluorescensintensitet är heterogen och inte nödvändigtvis hög.
- Odla cellerna med odlingsmedium kompletterat med den lämpliga val antibiotikum. Dela upp celler och komplettera dem med antibiotika-kompletterat odlingsmedium efter behov.
- Efter 2 veckor, kontrollera framgångsrik transfektion med användning av FACS (influensaorescence cellsortering) enligt följande:
- Samla 10 6-transfekterade celler, 10 6 mock-transfekterade celler (negativ kontroll), och 10 6 celler som är kända för att stabilt uttrycka den fluorescensmärkta proteinet. Om celler transfekteras med mer än ett fluorescerande protein (se steg 27), använder flera, var för sig taggade cellinjer som positiva kontroller.
- Centrifugera cellerna under 7 min vid 400 x g vid rumstemperatur.
- Kasta bort supernatanten. Återsuspendera cellerna i 500 | il FACS-buffert (PBS w / o Ca 2 + och Mg 2 +, 5% FCS, 0,05% natriumazid).
- Använd en analytisk FACS att kontrollera cellulär fluorescens. Jämför fluorescens av de transfekterade cellerna med den för de negativa och positiva kontrollerna.
- Att transfektera cellerna med ett ytterligare, fluorescerande taggade proteiner, upprepa steg 3-26 med de transfekterade cellerna.
- Celler som uppvisar höga nivåer av fluorescens bör användas. Optimalt, minst 50% avcellerna i kulturen bör vara mycket fluorescerande. Cell fluorescens kan ökas genom cellsortering via FACS.
Eventuella ytterligare taggade proteiner måste vara sammansmält till olika fluoroforer och kodas på plasmider som kodar för olika val antibiotika. Selection medium för celler transfekterade med mer än en plasmid bör kompletteras med alla lämpliga antibiotika.
2. T-cell Spridning analys Förberedelse
- Använd Lab-Tek II Tyska coverglass systemet 4 kammare diabilder. Se till att inte av misstag repa insidan av kamrarna, t.ex. med en pipett spets, under framställning eller användning.
- Förbered 50 ml lösning preparatet: Ta 4,6 ml av 12 M (37%) HCl, tillsätt 38,5 ml 100% etanol, och 6,9 ml dubbelt destillerat vatten.
- Fyll varje kammare av bilden med 500 pl preparatet lösning.
- Inkubera vid rumstemperatur under 10 min.
- Aspirera kammarens, torka dem helt.
- Inkubera otäckta bilderna för 1 timme vid 45 ° C tills helt torrt.
- Förbered 0,01% poly-L-lysin-lösning genom att späda 0,1% poly-L-lysin (Sigma-Aldrich) i dubbeldestillerat vatten.
- Applicera 500 | il till varje kammare.
- Inkubera objektglaset under 15 min vid rumstemperatur.
- Sug kamrarna, torka dem helt.
- Inkubera under 3 timmar vid 45 ° C tills helt torrt.
- Belagda objektglasen kan lagras torrt i flera månader vid rumstemperatur.
- Bered en lösning aktiverande antikropp. Använd en anti-CD3-antikropp: antingen HIT3a (BD Pharmingen, # 555.337) eller UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 10 | ig / ml i 400 pl PBS, per kammare. Denna lösning bör beredas strax före preparatet.
- Fyll varje kammare med 400 | il av den aktiverande antikroppen lösningen.
- Inkubera objektglaset under 2 h vid 37 ° C eller företrädesvis över natt vid 4 ° C.
- Avlägsna sol aktiverande antikroppenmepannor och omedelbart tvätta kammaren två gånger med 300 l PBS. Från denna punkt, se till att kamrarna förblir fylld med buffert.
- Förvara PBS-fyllda slide vid 4 ° C. Vi föreslår att du använder de preparerade bildspel kamrarna inom 1 vecka.
Tre. T-cellsaktivering och avbildning
- Förbered imaging buffert [1,25 ml HEPES (1 M), 10 ml FCS, 38.75 ml RPMI utan fenol rött]. Imaging buffert kan lagras vid 4 ° C efter filtrering.
- Aktivera Zeiss LSM 510 Meta mikroskop. Värm mikroskopet upphettningsbar monteringsram till 37 ° C. Välj "Expert-läge".
- Klicka på "Hämta"-fliken och öppna följande flikar: Lasrar, Mikroskopi, konfiguration, Scan, tidsserier.
- Aktivera behövs lasrar. För excitation av MCFP och mYFP, ställa Argon / 2 laser till "standby" i 5 minuter, sedan till "på".
- Om du har utfört den här live-cell imaging test innan, med samma fluoroforer, öppnar det LSM-filen, klicka på "återanvändning" icon, och fortsätta från steg 9. Annars fortsätter från steg 6.
- Definiera kanaler med filter lämpliga för excitation och emission av de använda fluorescerande proteiner.
- I "Scan kontroll" fönstret väljer Z stacken alternativet.
- Ange följande scan-parametrar: Antal skivor: 5; Intervall: 0,5 um; Aktuell skiva: 3.
- Preparera en Accublock Digital Torr Bad (Labnet) vid 37 ° C i närheten av mikroskopet.
- Värm avbildning buffert till 37 ° C.
- Förbered den lagrade bilden genom att aspirera PBS och ersätta den med 600 pl varm imaging buffert.
- Inkubera bilden vid 37 ° C. Förvara sliden i inkubatorn tills steg 13, i minst 15 min.
- Samla 5 × 10 5 transfekterade T-celler.
- Centrifugera cellerna för 2 minuter vid 400 x g..
- Kasta bort supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i 1 ml varm imaging buffert, och överföra dem till en 1,5-ml Eppendorf-rör.
- Placera test röret på Accublock Digital Dry Bath.
- Ta det uppvärmda glida ur inkubatorn, och montera den på den uppvärmda mikroskop monteringsram.
- Klicka på "VIS" ikonen.
- Blanda cellsuspension och ta bort 1-2 pl.
- För in spetsen på pipetten i bildbehandling bufferten ovanför botten av bilden. Undvik att repa glaset.
- Seed cellerna över objektivets bländare.
- Omedelbart börjar visuellt spåra fluorescerande celler som de härstammar. Välj en cell som visar hög fluorescens i båda kanalerna.
- Innan cellen når ytan av bilden, aktivera LSM läget.
- Växla endast en excitation laser. Välj en laser som du har en DIC kanal.
- Ställ Zoom till 1. Klicka på "Snabb XY"-ikonen. Klicka på "Stop"-ikonen. Använda beskärningsverktyget markerar en ROI centrerad på cellen.
- Ställ Zoom till 3. Klicka på "Snabb XY"-ikonen, sedan manuellt ställa in fokus på optimalt visa cellen. Klicka på "Stop" ICOn.
- Växla alla nödvändiga excitation lasrar.
- Starta inspelningen genom att klicka på "StartT" ikonen. Bild cellen för helheten av spridningskoden processen (vanligen 5 min). När du är klar klickar du på "Stop"-ikonen.
- Spara filen.
- För att förvärva ytterligare celler, klicka på "VIS" ikonen. Om det finns celler som ännu inte kommit i kontakt med bildens botten, fortsätta från steg 23. Undvik att avbilda celler som redan har börjat sprida processen. Annars går du vidare till steg 32.
- Om den observerade bildområdet är oftast saknar celler, lägga till ytterligare en delmängd av celler (fortsätt från steg 20). Annars går du vidare till steg 33.
- För att förvärva ytterligare celler, flytta bilden så att området ovanför objektivets bländare saknar celler.
- Lägg en annan delmängd av celler (och fortsätter från steg 20).
- Efter att ha utfört alla önskad avbildning, öppna en sparad LSM fil.
- Klicka på "Galleri", "Time + Z" och "delmängd".
- Välj relevant tidsområde och Z stacken.
- Spara den nya filen.
- Utför steg 35-38 för alla avbildning filer.
4. Imaging Data Analysis
- Öppna LSM filer med Imaris programvara (Bitplane AG, Zurich Schweiz).
- Klicka på "Surpass". Klicka på "Bildbehandling" menyn och välj "Byt Tid och Z". Detta kommer att bidra till en korrekt beskärning av bilden.
- Klicka på "Redigera" verktygsfältet och välj "Beskär 3D" i drop-menyn. Beskära bilden för att inkludera endast det område som omger cellen. Vi föreslår att beskära en 300 × 300 pixel kvadrat centrerad på cellen. Observera att form och placering av cellen kan ändras med tiden. Observation av t-axeln, se till att cellen är inom den beskurna området vid alla tidpunkter.
- Klicka på "Bildbehandling" menyn och välj "Byt Tid och Z" för att återställa den ursprungliga temporala separationen av bilden.
- Tryck på "Coloc" knappen på verktygsfältet. Välj "byggtid Desid. Coloc ". Imaris kommer automatiskt beräkna stödnivåer för varje kanal vid varje tidpunkt.
- Se resultaten av colocalization analysen genom att välja "Kanal Statistics". Exportera data genom att klicka på "Exportera".
- Upprepa steg 1 till 6 för varje avbildade cell. Vi rekommenderar att minst 50 celler analyseras på detta sätt.
- Beräkna medelvärdet Pearsons colocalization koefficient och dess standardavvikelse eller avvikelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterar ett exempel på levande T-cell imaging och analys. Före avbildning experimentet SLP76 deficienta T-celler (J14) analyserades med användning av FACS för att bestämma uttrycket av de fluorescerande proteiner (Figur 1). T-celler transfekterade med de taggade signalproteiner MCFP-Nck och SLP76-mYFP avsattes över aktiverande diabilder och avbildas under T-cell-spridning (figur 2). Insamlade bilder visar dynamiken i protein lokalisering hela aktivering och spridning (Figur 3). Datoriserad bildbehandling ger nya insikter och kvantitativ information från de visualiserade cellerna, och samtidigt minimera människors fördomar. För att undersöka colocalization av de två proteinerna i hela den cellulära aktiveringsprocessen, utnyttjade vi den colocalization verktyget enligt Imaris mjukvara (Bitplane AG, Zurich Schweiz). Genom att jämföra colocalization koefficienter mellan olika tidpunkter över avbildade celler, var vi kunnat konstatera att det colocalization av Nck och SLP76 inte förändras avsevärt under T-cells aktivering (p> 0,3) (Figur 4).
Figur 1. FACS-analys av celler transfekterade dubbel med fluorescensmärkta proteiner Data visas som fluorescensintensiteten histogram för (A) MCFP,. (B) mYFP, och (C) som ett punktdiagram. Fluorescensintensiteten av J14-celler transfekterade med MCFP-Nck och SLP76-mYFP är representerade i cyan och gult, respektive. Otransfekterade J14 negativa kontrollcellerna anges med svarta linjer.
/ Files/ftp_upload/50076/50076fig2.jpg "/>
Figur 2. En schematisk bild av den levande T-cell sprider assay (A) Framställning av T-cell-aktiverande slides,. (B) levande T-cell sprider analysen och analys,. (C) mikroskopi inställning Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Fördelning av Nck och SLP76 under T-cell-aktiveringsprocessen. Celler som uttrycker MCFP-Nck och SLP76-mYFP tappades över anti-CD3 förbelagda stimulatory antikropp täckglas och ständigt avbildas under en period av 7 min. MCFP-Nck representeras av cyan, medan SLP76-mYFP visas i gult.
Figur 4. Kvantitativ analys av protein colocalization. Bildbehandling av celler utfördes med användning av Imaris mjukvara (Bitplane AG, Zurich Schweiz). Colocalization beräknas som Pearsons korrelationskoefficient mellan intensiteten hos MCFP kanalen och mYFP kanal för varje pixel. Pearsons colocalization koefficienter beräknade från olika tidpunkter jämförs. Trettio sekunder in i aktiveringsprocessen, var colocalization koefficienten MCFP-Nck och SLP76-mYFP ökade signifikant (p <0,05). Dessa resultat beräknades genom att analysera> 50 självständiga celler. Medelvärde ± standardfel visas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Regleringen och funktion av flera cellulära processer beror på bildandet och avslutande av protein-proteininteraktioner. Mikroskopisk bildbehandling gör det i realtid spårning av fluorescerande taggade proteiner i levande celler. Colocalization av märkta proteiner kan föreslå en direkt eller indirekt interaktion mellan proteinerna, och kan användas för att förstärka resultaten erhållna genom biokemiska metoder, såsom immunutfällning. Till skillnad biokemiska metoder, gör live-cell imaging dessa inter-protein växelverkan som skall iakttas rumsligt och över tid, underlätta övervakningen av fysiologiska processer när de uppstår och att upptäcka den cellulära fördelningen av proteiner. Olika verktyg för kvantitativ analys av colocalization har utvecklats, Pearsons korrelationskoefficient är fortfarande en mycket attraktiv och allmänt tillgänglig metod för kvantifiering av graden av samlokalisering mellan två proteiner 12. Medan fluorescensresonans energy (FRET) experiment möjliggör detektion av inter-protein-interaktioner som kännetecknas av närhet (10 nm), kräver denna metod specialiserade inställningar (utrustning och kompatibilitet av fluorescerande begagnade märkningar) och komplex databehandling. För de flesta användningsområden, colocalization analys, i konjugation med biokemiska metoder, utgör en enkel att använda och enkel metod för att observation protein-protein interaktioner över tiden.
Etablera en fluorescens-intensitet tröskeln för analyserade pixlar, och bortse pixlar nedanför intensiteten tröskeln för antingen kanal, är av avgörande betydelse för noggrann och känslig colocalization analys. Den vanligaste algoritmen för objektiv och automatisk bestämning av dessa gränsvärden utvecklades av Costes et al. 13 och genomförs av bildbehandlingsprogram såsom Imaris och Volocity.
Här visar vi användningen av den levande T-cell-imagtod för att analysera dynamiken i SLP76, en nyckel byggnadsställning i T-celler, och NCK en adapter protein, som båda är viktiga för T-cell aktivering 14,15. Bilder av T-celler som samlats in under aktivering tyder på att de två proteinerna är colocalized hela den cellulära aktiveringen (Figur 3). Detta är kvantitativt bekräftas genom att utföra Pearsons colocalization test på bilder som samlats in under aktiveringen. Den Pearsons colocalization koefficienter varierar från -1 till 1, där en poäng på -1 betyder anti-korrelation, innebär en värdering av en perfekt colocalization och 0 betyder ingen korrelation mellan de två bildkanaler. Jämförelse av Pearsons colocalization koefficienterna för olika tidpunkter och för olika celler indikerar att colocalization av Nck och SLP76 inte påtagligt förändras under cellulär aktivering, men förblir konstant (p> 0,3, Figur 4). Medan den övergripande colocalization coeffektiva av dessa proteiner inte förändras under aktiveringen, undanröjer därför inte möjligheten av en dynamisk process för associering och avståndstagande som inträffar mellan dessa proteiner 18.
Protokollet presenterade vi kan även anpassas till andra hematopoetiska cellinjer genom att justera cell-tillväxt förhållanden som krävs, välja en transfektion inställning är lämplig för cellinje i fråga och modifiera den cellulära aktiveringen, om tillämpligt. Observera att medan vi använde LSM 510 Meta konfokalmikroskop, med lämpliga justeringar och användning av inställningar, kan andra konfokalmikroskopi system med framgång användas också.
Användning av levande T-cell imaging tillåter de reglerande och aktivering processer som ska direkt övervakas, så att signalering händelser som ska utforskas med temporal och spatial upplösning otillgänglig använda biokemiska och molekylära metoder. Vi presenterar en enkel method för att utföra en levande T-cellspridning analys, övervakning relevanta proteiner i realtid och analysera data för att ge kvantitativa resultat. Resulterande mikroskopi data kan också användas för andra nedströms tillämpningar, såsom cell-formindex analys 16 och FRET analys 17,18, beroende på den specifika experimentella uppställningen och mål forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inga intressekonflikter att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar Sophia Fried för tekniskt bistånd. MBS tackar följande myndigheter för deras forskningsstöd: The Israel Science Foundation för bidrag no.1659/08, 971/08, 1503-1508 och 491/10, ministerierna för Health & Science för bidrag inga. 3-4114 och 3-6540, Israel Cancer Association genom Estate av den sena Alexander Smidoda, och Taubenblatt Family Foundation för biomedicin excellence bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygomycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R87589 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame - Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 | |
References
- Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
- Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
- Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
- Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
- Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
- Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
- Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
- Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
- Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
- Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).
