Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

العزلة وثقافة الخلايا النجمية الماوس القشرية

Published: January 19, 2013 doi: 10.3791/50079

Summary

وقد تم الاعتراف الخلايا النجمية لتكون خلايا تنوعا المشاركة في العمليات البيولوجية الأساسية التي لا غنى عنها لنمو الدماغ الطبيعي وظيفة، ووسط إصلاح الجهاز العصبي. هنا نقدم إجراء سريع للحصول على الثقافات نقية نجمية الماوس لدراسة علم الأحياء من هذه الفئة الرئيسية من خلايا الجهاز العصبي المركزي.

Abstract

الخلايا النجمية هي نوع من الخلايا وفرة في أدمغة الثدييات، ولكن لا يزال هناك الكثير الذي يمكن تعلمه عن خصائصها الجزيئية والوظيفية. في أنظمة نجمية المختبر زراعة الخلايا يمكن استخدامها في دراسة الوظائف البيولوجية لهذه الخلايا الدبقية بالتفصيل. هذا البروتوكول الفيديو يوضح كيفية الحصول على الخلايا النجمية نقية من العزلة والثقافة من الخلايا القشرية مختلطة من الجراء الماوس. وتستند هذه الطريقة على عدم وجود الخلايا العصبية قابلة للحياة وفصل oligodendrocytes قد، والخلايا النجمية الخلايا الدبقية الصغيرة، والثلاثة الرئيسية من السكان الخلية الدبقية في الجهاز العصبي المركزي، في الثقافة. صور ممثل خلال الأيام الأولى للثقافة إثبات وجود السكان الخلية المختلطة وبيان timepoint، عندما تصبح الخلايا النجمية متكدسة ويجب أن يتم فصل الخلايا الدبقية الصغيرة من و oligodendrocytes. وعلاوة على ذلك، علينا أن نبرهن النقاء ومورفولوجيا الخلايا النجمية من نجمي مثقف باستخدام stainings immunocytochemical لراسخة ووصف علامات نجمية حديثا. ويمكن هذا النظام الثقافة استخدامها بسهولة للحصول على الخلايا النجمية الماوس نقية والمتوسطة نجمية مكيفة لدراسة مختلف جوانب البيولوجيا نجمية.

Introduction

الخلايا النجمية هي نوع من الخلايا وفيرة جدا في الجهاز العصبي المركزي (CNS). نسبة الخلايا النجمية لالخلايا العصبية هو 01:03 في القشرة من الفئران والجرذان، في حين هناك 1.4 الخلايا النجمية في الخلايا العصبية في القشرة الإنسان 1. وقد زاد الاهتمام في وظيفة الخلايا النجمية بشكل كبير في السنوات الأخيرة. إحدى الوظائف الرئيسية للالنجمية هو دورها في توفير الدعم الهيكلي والتمثيل الغذائي للخلايا العصبية 2،3. الأدوار المكتشفة حديثا عن الخلايا النجمية تغطي طيف واسع من الوظائف. وتشمل هذه الهجرة من توجيه محاور عصبية النامية وneuroblasts معينة خلال التنمية 4-6، وظائف في انتقال متشابك، المشبك القوة ومعالجة المعلومات من قبل الدوائر العصبية 7-9، في أدوار حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​تشكيل (10) وسلامة 11-13 وتنظيم ال 14 لهجة الدماغية. ميزة أخرى كبيرة من الخلايا النجمية هو استجابتها للإصابة. تحت astrocyt الحالات المرضيةأصبح وفاق رد الفعل وupregulate مزيد من التعبير عن البروتين المتوسطة الدبقية خيوط لييفي الحمضية (GFAP) والمثبطة البروتينات خارج الخلية المصفوفة (ECM) 15،16. الخلايا النجمية على رد الفعل ترسيم موقع الإصابة من الأنسجة السليمة من خلال تشكيل ندبة الدبقية، التي تتكون بشكل رئيسي من البروتينات نجمية ECM يفرز من عائلة كبريتات شوندروتن (CSPG) بروتيوغليكان، العوامل الرئيسية التي تحول دون تجدد المحاور بعد إصابة الجهاز العصبي المركزي 15-17.

الخلايا النجمية تنشأ من الخلايا الشعاعية (RG) الدبقية خلال مرحلة التطور الجنيني في وقت متأخر بعد الولادة والحياة في وقت مبكر. بعد تحديد نجمية حدث والسلائف نجمية الهجرة إلى مواقعها النهائية، حيث تبدأ عملية التمايز النهائي. في الجسم الحي، ويبدو أن الخلايا النجمية تكون ناضجة ثلاثة إلى أربعة أسابيع بعد الولادة كما أشارت إلى ذلك التشكل على 18،19 نموذجية. جزء من السكان من الخلايا النجمية RG تحويلها إلى منطقة subventricular (نوع B الخلايا). Bأوراسكوم تليكوم القابضة، والخلايا B RG نوع وظيفة ونجمية مثل الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) خلال التنمية وفي البالغين، على التوالي. مثل RG، الخلايا النجمية والخلايا B نوع أيضا تعبر عن نقل الغلوتامات نجمية محددة (GLAST) والدماغ الدهون ملزم البروتين (BLBP)، وGFAP، مشيرا إلى أن هذه العلامات لا يمكن أن تستخدم حصرا لتسمية الخلايا النجمية على وجه التحديد الكبار. وعلى النقيض من الخلايا النجمية متني الكبار، التي لا تفرق في RG صحية والدماغ والخلايا B نوع المعرض الجذعية المحتملة الخلية مثل القدرة على تجديد الذات. وقد تورط dysregulation من الخلايا النجمية في العديد من الأمراض، بما في ذلك مرض الزهايمر 20،21، مرض هنتنغتون 22، مرض باركنسون 23، متلازمة ريت 24 و المرض الإسكندر 25. وعلاوة على ذلك، الخلايا النجمية الرد على جميع الإهانات من CNS، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا النجمية ونجمي تشكيل ندبة الدبقية 16،26. ندبة الدبقية التي تشكل نجمي التالية TR الدماغويعتقد أوما أو اصابات الحبل الشوكي لتكون حاجزا منع تجديد الخلايا العصبية الوزراء 15.

وقد تم تطوير طرق موثوقة لعزل السكان والحفاظ على تنقية الخلايا ضرورية لفهمنا للجهاز العصبي. العمل الرائد من قبل مكارثي وتمكن المحققون دي Vellis حتى الآن لإعداد الثقافات نقية تقريبا من الخلايا النجمية من الأنسجة الفئران حديثي الولادة 27. وقد تعلمت الكثير عن علم الأحياء نجمية باستخدام هذا الأسلوب، الذي يقدم هنا في شكل معدل قليلا لعزل الخلايا النجمية الماوس القشرية. استكمال الدراسات المجراة في، الخلايا النجمية وكذلك المتوسطة مكيفة تم الحصول عليها باستخدام وصفها في الثقافة المختبر، هي أدوات قيمة للحصول على مزيد من نظرة ثاقبة وظائف نجمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. العزلة وتصفيح من الخلايا القشرية المختلطة

لا يمكن أن يؤديها مختلطة العزلة الخلية القشرية للثقافات نجمية باستخدام الماوس الجراء P1 إلى P4. من أجل تحقيق كثافة نجمية السليم لا بد من استخدام الماوس القشور 4 الجرو في قارورة T75 الأنسجة الثقافة. لذلك، يتم حساب وحدات التخزين في البروتوكول التالي لإعداد الخلية باستخدام الماوس الجراء 4.

  1. قبل البدء في إجراء تشريح، prewarm 30 مل من وسائل الإعلام الثقافة نجمية (DMEM، ارتفاع نسبة الجلوكوز + 10٪ للحرارة المعطل الجنين المصل البقري + 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، انظر الجدول) إلى 37 ° C. معطف T75 1 قارورة مع 20 مل من بولي-D-يسين (PDL) في تركيز 50 ميكروغرام / مل في الماء لزراعة الخلايا الصف 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة 2 CO.
  2. لإجراء تشريح، وإعداد جميع الكواشف والمواد الضرورية. سوف تحتاج إلى: مقص جراحي، ملقط غرامة على نحو سلس، ملقط غيض شقة، مناشف ورقية، وحقيبة النفايات، والإيثانول 70٪ لد 2 الأطباق تشريح (3.5 سم القطر) على الجليد مليئة HBSS 2 مل لكل منهما.
  3. عقد بلطف ورذاذ الرأس والرقبة من الفأرة الجرو مع الايثانول 70٪. وضحى الحيوان بقطع الرأس باستخدام المقص.
  4. إجراء شق خط الوسط، لالأمامي الخلفي، جنبا إلى جنب فروة الرأس للكشف عن الجمجمة.
  5. قطع الجمجمة بعناية من الرقبة إلى الأنف. يتم تنفيذ اثنين من تخفيضات إضافية للسماح بالوصول إلى مزيد من الدماغ: ويتكون أول خفض المصابيح الأمامية لحاسة الشم، والآخر أدنى من المخيخ لقطع الجمجمة من قاعدة الجمجمة.
  6. باستخدام ملقط غيض شقة، وبلطف اللوحات الجمجمة انقلبت إلى الجانب ويتم أخذ الدماغ من وضعها في أول طبق تشريح مليئة HBSS. وضع الطبق مرة أخرى على الجليد ومواصلة حصد جميع العقول 4.
  7. يتم تنفيذ ما تبقى من إجراء تشريح تحت stereomicroscope. أولا، يتم إزالة المصابيح حاسة الشم والمخيخ باستخدام الغرامةتشريح ملقط (1B الشكل).
  8. من أجل استرداد القشور، والاستيلاء على نهاية الخلفي من الدماغ مع ملقط الغرامة، أداء شق خط الوسط بين نصفي الكرة الأرضية، اضافة الى وجود مجموعة ثانية من ملقط لإنشاء بستان وقشر بعيدا هيكل لوحة تشبه القشرة من الدماغ.
  9. تشريح بعناية السحايا من نصفي الكرة الأرضية القشرة عن طريق سحب الملقط مع غرامة (1D الشكل). هذه الخطوة تجنب تلوث ثقافة نجمية النهائي من قبل خلايا السحائي والخلايا الليفية. نقل الكرة الأرضية القشرة المعدة في طبق الثانية المملوءة HBSS وإعادته إلى الجليد. تواصل مع جميع القشور وفقا لذلك 4.
  10. وأخيرا، وقطع كل نصف الكرة القشرة إلى قطع صغيرة باستخدام شفرات حادة (حوالي 4 إلى 8 مرات).
  11. تحت ظروف معقمة، وقطع القشرة نقل إلى واحدة 50 مل أنبوب فالكون وإضافة إلى وحدة تخزين HBSS إجمالي قدره 22.5 مل.
  12. إضافة 2.5 مل من 2.5٪ المزيج، واحتضان التربسينالأنسجة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. مزيج من عرضية تهز كل 10 دقيقة.
  13. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 XG لقطع الأنسجة بيليه القشرة.
  14. إزالة بعناية طاف من الصفق. من أجل تجنب فقدان الأنسجة بيليه قد تحتفظ ميكانيكيا باستخدام الماصة ل. فصل الأنسجة في تعليق خلية واحدة بإضافة 10 مل المتوسطة الطلاء نجمية وpipetting قوية باستخدام ماصة 10 مل من البلاستيك حتى قطع الأنسجة هي فصل واحد في الخلايا (20 إلى 30 مرة). لضبط مستوى الصوت باستخدام 20 مل نجمية المتوسطة الطلاء. يمكنك دليل على تفكك النسيج إلى خلايا القشرة واحدة عن طريق عد باستخدام عدادة الكريات. ينبغي للمرء أن إعداد القشور الماوس 4 الجرو تسفر 10-15 X10 6 خلايا واحدة فصل.
  15. نضح PDL من القارورة الثقافة T75، لوحة للفصل التعليق خلية واحدة واحتضان عند 37 درجة مئوية في الحاضنة 2 CO.

2. الحصول على ENRنجمية الثقافة iched

  1. تغيير المتوسطة 2 بعد أيام من الطلاء خلايا القشرية المختلطة وجميع 3 أيام بعد ذلك.
  2. بعد 7 إلى 8 أيام، عندما الخلايا النجمية هي الخلايا الدبقية الصغيرة متكدسة وتتراكب الجلوس تعرض على طبقة أو نجمية هي بعيدة بالفعل من طبقة نجمية (الشكل 2)، هز قارورة T75 في 180 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة على شاكر المداري لإزالة الخلايا الدبقية الصغيرة. تجاهل طاف الخلايا الدبقية الصغيرة تحتوي على أو إذا كنت ترغب في دراسة الثقافة والخلايا الدبقية الصغيرة، وتدور عليه و28،29 وحة للثقافة.
  3. إضافة 20 مل الطازجة مستنبت نجمية والاستمرار عن طريق هز قارورة في 240 دورة في الدقيقة لمدة 6 ساعة لإزالة خلايا دبقية قليلة التغصن السلائف (OPC). منذ بعض لن يجد OPCs فصل تماما من طبقة نجمية، تواصل يهز بقوة باليد لمدة 1 دقيقة من أجل منع التلوث OPC. تجاهل طاف أو تدور عليه ولوحة، إذا كنت ترغب في الثقافة يجد OPCs 29.
  4. شطف conflue المتبقيةNT طبقة نجمية مرتين مع PBS، نضح في برنامج تلفزيوني، إضافة 5 مل التربسين EDTA واحتضان-في الحاضنة 2 CO في 37 ° C. تحقق مفرزة من الخلايا النجمية كل 5 دقائق وإنفاذ مفرزة من الخلايا النجمية من خلال ضرب القارورة ضد راحة يدك (2-3 مرات).
  5. بعد فصل الخلايا النجمية من القارورة الثقافة، إضافة 5 مل من مستنبت نجمية، وخلايا تدور في 180 XG لمدة 5 دقائق، نضح طاف وإضافة 40 مل الطازجة المتوسطة الطلاء نجمية. ينبغي للمرء أن زراعة الأنسجة قارورة T75 تسفر حول 1x10 6 خلايا بعد الانقسام الخلية الأولى. لوحة الخلايا في اثنين من قوارير الثقافة T75 واحتضان عند 37 درجة مئوية في الحاضنة 2 CO. تغيير المتوسطة كل يوم 2 إلى 3.
  6. ومطلي 12-14 يوما بعد انقسام الخلايا النجمية الأولى في الخلية المناسبة ساعة 24-48 تركيز قبل تنفيذ التجربة. ينبغي للمرء أن زراعة الأنسجة قارورة T75 تسفر حول 1،5-2 X10 6 خلايا بعد الانقسام الخلية الثانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

على العزلة من مخ الفأر كاملة (الشكل 1A)، والمخيخ المصابيح حاسة الشم لا بد من إزالة (1B الشكل). ومقشر والقشور من الفأرة جذع الدماغ (الشكل 1C) والسحايا من القشرة الفردية (1D الشكل ') تتم إزالة بعناية (الشكل 1E). السحايا واضحة من قبل النظام الشريان السحائي والنتائج غير كاملة في إزالة التلوث من ثقافة نجمية النهائي من قبل خلايا السحائي والخلايا الليفية.

بعد الطلاء لتعليق الخلية القشرية المختلطة، وبعض الخلايا النجمية إرفاق بالفعل إلى قارورة الثقافة في غضون 24 ساعة (الشكل 2A). ومع ذلك، فإن طاف الثقافة الخلية تحتوي على الحطام الخلية والخلايا العصبية الموت ل3 إلى 5 أيام الأولى (الشكل 2A-C)، باعتبارها وسيلة الثقافة تفضل بقاء ونمو الخلايا الدبقية. مرة واحدة هي الخلايا النجمية متموجة والجلوس تتعرض الخلايا الدبقية الصغيرة على astrocytه طبقة، وعادة في يوم 7 بعد عزل الخلايا القشرية مختلطة، يجب فصل الخلايا النجمية من الخلايا الدبقية الصغيرة ويجد OPCs عن طريق هز (الشكل 2D). 2 يوم بعد الانشقاق الأول الخلايا نجمية تظهر التشكل. في هذه الكثافة نجمية نقطة منخفضة والخلايا النجمية وافرة (2E الشكل والسهام السوداء علامة خلية واحدة). العائد المتوقع في هذه المرحلة هو حوالي 4-6 مع انخفاض خلايا X10 5 في قارورة T75 الأنسجة الثقافة. ومع ذلك، لا تزال تتكاثر الخلايا وتنضج في الثقافة في هذا timepoint. وعادة ما تستخدم الخلايا النجمية للتجارب في اليوم 21 إلى 28 (الشكل 2F) لضمان النمط الظاهري ناضجة من الخلايا النجمية معزولة. في هذه المرحلة العائد المتوقع هو حوالي 1،5-2 X10 6 خلايا الأنسجة قارورة T75 في الثقافة.

وقد اتسمت نقاء الثقافة نجمية من الدراسات المورفولوجية المجهر الإلكتروني، خلية التعبير والقدرة على الاستجابة الدوائية علامة 27. تلوث علىيمكن فحص ثقافة strocyte باستخدام علامة للحصول على الخلايا الدبقية الصغيرة (IBA-1) ويجد OPCs (O4). ينبغي دراسة الحصول على نقاء الثقافة والنضج نجمية عن طريق الفحص باستخدام الأجسام المضادة immunocytochemical ضد البروتين GFAP. ومن المتوقع أن الغالبية العظمى من الخلايا تظهر مكثفة، إشارة الخيطية (الشكل 3). أدى دينا العزلة والثقافة القشرية طريقة الخلايا النجمية في نقاء نجمية أكبر من 98٪، وكشفت باستخدام الأجسام المضادة ضد البروتين GFAP (الشكل 3). إذا كان الإجراء قد تمت بنجاح، والخلايا الملوثة نادرة (<2٪) وتحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة ونسمة، والتي يمكن ملطخة باستخدام IBA-1 و O4، على التوالي. ويمكن استخدام إذا رغبت، إلى مزيد من التحليل من علامات نجمية أخرى، مثل Aquaporin-4، S100B، وBLBP GLAST. بالإضافة إلى GFAP، وأعرب عن جميع هذه العلامات من قبل 28 يوما نجمية الثقافات القديمة. كشفت مؤخرا التنميط التعبير الجيني للسكان تنقية نجمية AST جديدة محتملةrocyte علامات، مثل إنزيم الأيض حمض الفوليك ALDH1L1 30،31، وهو ما يعبر عنه أيضا من قبل غالبية الخلايا النجمية والقشرية معزولة (الشكل 3).

الشكل 1
الشكل 1. تشريح ما بعد الولادة القشرة الماوس (P3). دماغ) الجامعة. B) بعد إزالة الدماغ من المصابيح حاسة الشم والمخيخ. C) عزل القشور عن طريق تقشير قبالة هيكل لوحة تشبه القشرة من الدماغ. D، D ') اللحاء من موقع بطني وظهري مع السحايا (الأسهم السوداء تشير إلى الشرايين السحائي). E) اللحاء دون السحايا. شريط النطاق، 1.5 مم.

الشكل 2
الشكل 2. المورفولوجية محة عامة عن الخلايا القشرية معزولة المختلطة وثقافة نقية نجمية في timepoints مختلفة بعد العزلة.A) 1 بعد يوم من الخلايا القشرية الطلاء مختلطة. وترد الخلايا النجمية الأولى إلى الجزء السفلي من القارورة (الأسهم السوداء) والخلايا العصبية تموت هي في طاف. B) 3 أيام بعد الطلاء من الخلايا القشرية مختلطة. طبقة نجمية هو تشكيل (الأسهم السوداء). الخلايا العصبية غائبة تقريبا. C) 5 أيام بعد الطلاء من الخلايا القشرية مختلطة. أولا الخلايا الدبقية الصغيرة ويجد OPCs على رأس طبقة نجمية (الأسهم السوداء). D) 7 أيام بعد الطلاء من الخلايا القشرية مختلطة. طبقة نجمية هو متموجة تماما. E) بعد إزالة الخلايا الدبقية الصغيرة ويجد OPCs عن طريق هز قوية وأيام 2 بعد تقسيم، وخلايا نجمية المرفقة تظهر التشكل ذات الكثافة المنخفضة (تشير الأسهم خلية واحدة). F) طبقة نجمية يظهر كثافة عالية 2 أسابيع بعد الانقسام الأول. شريط النطاق، 10 ميكرومتر.

الشكل 3
الشكل 3. نقاء الثقافة نجمية الأولية. Immunolabeling الأولية الماوس طريق مسدود نجميةكشفت توريس مع علامات GFAP، GLAST، S100B، Aquaporin 4-، ALDH1L1 وBLBP (كل أخضر) نقية الثقافة نجمية الأولية. هي ملطخة النوى مع 4 '، 6'-diamidino-2-phenylindole (دابي) (الأزرق). شريط النطاق: 10 ميكرومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتستند هذه الطريقة المذكورة هنا على إعداد ثقافة نجمية من أدمغة القوارض حديثي الولادة، وصفت في الأصل من قبل مكارثي وVellis دي في عام 1980 27. طريقة معدلة من العزلة وثقافة الخلايا النجمية القشرية من الدماغ إلى ما بعد الولادة P1 الماوس P4 المقدمة هنا هو سريع، والمحاصيل الخلايا النجمية الأساسية نقية وغير قابلة للتكرار للغاية. يمكن بسهولة نقل هذه التقنية أن الخلايا النجمية لعزل من الأنواع الأخرى، مثل الفئران أو من الخنازير ومن مناطق الدماغ الأخرى، مثل النخاع الشوكي. في حين نجمية العزلة الخلية السلف من الدماغ حديثي الولادة من قبل مكارثي وطريقة deVellis يولد خلايا التكاثري للغاية، يقتصر انتشار الخلايا النجمية ونشر المعزولة من الجراء بعد الولادة الماوس P1-P4. بعد تقسيم الخلايا النجمية مرة واحدة في 7 أيام في المختبر (DIV)، وسوف تنمو لconfluency وناضجة. في الجسم الحي، وانتشار معظم نجمية يكاد يكون تاما من قبل P14 32. هوإعادة، نقترح استخدام الخلايا النجمية للتجارب في يوم 21 حتي 28 DIV (الشكل 2F) لضمان النمط الظاهري ناضجة من الخلايا النجمية معزولة. يجب أن لا يعود إلى ضبط النفس المتأصلة في الثقافات تتكاثر نجمية أن انقسم أكثر من 3 مرات.

الخطوات الحاسمة في طريقة العزل هي وصف هضم القشور وسحن التالية من النسيج هضمها للحصول على تعليق خلية واحدة. ولذلك، فمن الضروري التركيز على تحسين الهضم التربسين والوقت من أجل الحصول على تعليق خلية واحدة بعد سحن من الدماغ الأنسجة القشرة لمدة 20-30 مرات. وينبغي من أجل تقليل الاختلاف أن aliquoted التربسين وينبغي تجنب تجميد ذوبان الجليد دورات. الإجراءات الموصوفة يعتمد على الطلاء الخلايا القشرية مختلطة على قوارير الثقافة PDL المغلفة، التي تضمن الربط من الخلايا النجمية ويعزز طبقة متموجة نجمية عدة أيام بعد الطلاء. بينما PDL طلاء ليس من الضروري لم نجميةaintenance بعد انفصالهما من الخلايا الدبقية الصغيرة و oligodendrocytes، قد يتم تنفيذ في التطبيقات المصب معينة مثل تلطيخ immunofluorescene. التوقيت المناسب للانقسام الخلية الأولى مهم لسلامة الخلايا والعائد. إذا مثقف الخلايا النجمية وصلوا إلى ما بعد confluency، قد تفقد معظم الخلايا بسبب عدم كفاية مفرزة خلال انقسام الخلية الأولى. هذا لا يمكن التغلب عليها من خلال زيادة الوقت للانفصال، منذ فترة حضانة مكثفة مع التربسين يؤثر سلبا سلامة الخلية. في المقابل، سوف الطلاء تعليق الخلية القشرية نادرا جدا يؤدي إلى تشكيل طبقة كافية من خلايا نجمية متموجة. أفضل وقت للانقسام الخلية الأولى هو الساعة 7 إلى 8 أيام بعد الطلاء من الخلايا القشرية المختلطة، عندما الخلايا النجمية والخلايا هي الخلايا الدبقية الصغيرة متموجة الجلوس على موقف العلوي من طبقة نجمية.

في الثقافة الخلية القشرية وصفها، تظهر الخلايا النجمية عدم التجانس الخلوية (<STRONG> الشكل 3)، كما وصفها لالنجمية في الجسم الحي 33،34. ومع ذلك، وتحديد مورفولوجيا نجمية متنوعة وظائف أعيقت من قبل عدد محدود من علامات لتحديد وتمييز أنواع فرعية غير متجانسة نجمية محتملة. A علامة تميز جيدا ليفية ناضجة والخلايا النجمية على رد الفعل هو GFAP. ومع ذلك، أعرب بالكاد GFAP من الخلايا النجمية جبلي ناضجة، مما يحد من استخدامه كعلامة لجميع الخلايا النجمية، ويعبر أيضا من قبل خلايا RG خلال التنمية والخلايا B في البالغين، وتقييد استخدامه كعلامة مرحلة معينة. وأعرب أيضا عن علامات أخرى من الخلايا النجمية، بما في ذلك GLAST، ALDH1L1 أو BLBP، عن طريق الخلايا النجمية غير ناضجة وبالتالي لا حصرا بمناسبة الخلايا النجمية ناضجة. وأخيرا، وعلامات نجمية ناضجة مثل GFAP، Aquaporin-4، وS100B (الشكل 3) على نحو متزايد حتى النضج خلال التنظيم بعد الولادة.

في أيدينا، ASTrocyte الثقافات في سن 4 أسابيع من الخلايا النجمية لها خصائص ناضجة في الجسم الحي. باستخدام الثقافات نجمية الأولية يمكننا تحديد الآلية الجزيئية كيف الفيبرينوجين في الدم البروتين ولد يدفع تفعيل نجمية 17. كشفت دراساتنا أن الفيبرينوجين هو الناقل من β-TGF الكامنة. علاج الخلايا النجمية الأولية مع الفيبرينوجين أدى إلى تشكيل TGF-β النشطة وتفعيل المسار TGF-β/Smad يشير في الخلايا النجمية 17،26. وقد تم تأكيد هذه النتائج باستخدام حقن الفيزيولوجية في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، الخلايا النجمية السيطرة أنواع الخلايا الأخرى عن طريق إفراز المواد، والتي يمكن تحليلها عن طريق حصاد نجمية مكيفة المتوسطة وتطبيق هذه الوسيلة مكيفة لأنواع الخلايا الأخرى. كنا في السابق نجمية مكيفة المتوسطة لتحليل مقايسة وظيفية في كيفية تكييف المتوسطة من الفيبرينوجين المعالجة الخلايا النجمية يؤثر ثمرة محوار. رد الفعل السريع وتفرز الخلايا النجميةالبروتينات للأسرة CSPG، التي تحول دون ثمرة محوار 16. في الواقع، تكييف المتوسطة من الفيبرينوجين المعالجة الخلايا النجمية انخفضت بشكل ملحوظ كل من طول محوار والنسبة المئوية للخلايا تظهر ثمرة محوار 17.

عزل الخلايا النجمية وثقافة القشرية المبينة في هذا البروتوكول يوفر أداة قوية للتحقيق في علم الأحياء نجمية، منذ الإدارة في تطبيقات متنوعة يمكن استكمال تحقيقاتها بشكل كبير في الجسم الحي. ومع ذلك، ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن تم زرعها في الخلايا النجمية التي تم الحصول عليها في المختبر، وحين أنها تعكس خصائص نجمية كثيرة، كما أنها تختلف من الخلايا النجمية في الجسم الحي. لذلك، وسائل أخرى للاختيار المباشر وعزل الخلايا النجمية من immunopanning 35 أو الأجسام المضادة القائمة على العزل 36 FACS تمثل آفاقا جديدة للتحقيق مزيد من الخصائص الأساسية للالنجمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

بدعم من زمالة دراسات عليا Fazit مؤسسة لSS، والوزارة الاتحادية للتعليم والبحث العلمي (BMBF 01 EO 0803) لKB والمفوضية الأوروبية FP7-المنح PIRG08 GA-2010-276989، NEUREX، ومؤسسة البحوث الألمانية المنح SCHA 1442 / 3-1 لCS الكتاب ليس لديهم مصالح متضاربة المالية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Astrocyte culture media
DMEM, high glucose Life Technologies 31966-021
FBS, heat-inactivated Life Technologies 10082-147 Final Concentration: 10%
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122 Final Concentration: 1%
Solution for brain tissue digestion
HBSS Life Technologies 14170-088
2.5% Trypsin Life Technologies 15090-046 Final Concentration: 0.25%
Other
70% (vol/vol) ethanol Roth 9065.2
Poly-D-Lysine Millipore A-003-E 50 μg/ml
Water PAA S15-012 cell culture grade
PBS PAA H15-002 cell culture grade
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-062
0.45 μm Sterile filter Sartorius 16555
3.5 cm petri dish BD Falcon 353001
15 ml Falcon tube BD Falcon 352096
50 ml Falcon tube BD Falcon 352070
75 cm2 Tissue culture flask BD Falcon 353136
Forceps, fine Dumont 2-1032; 2-1033 # 3c; # 5
Forceps, flat tip KLS Martin 12-120-11
13 cm surgical scissors Aesculap BC-140-R
Stereomicroscope Leica MZ7.5
Stereomicroscope + Camera Leica MZ16F; DFC320
Microscope + Camera Zeiss; Canon Primo Vert; PowerShot A650 IS
Centrifuge Eppendorf 5805000.017 Centrifuge5804R
Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE 4450-1CE MaxQ 4450
Water bath Julabo SW20; 37 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).
  2. Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation. Cell Metab. 14, 724-738 (2011).
  3. Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia - more than just brain glue. Nature. 457, 675-677 (2009).
  4. Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology. Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).
  5. Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression. BMC Neurosci. 11, 132 (2010).
  6. Kaneko, N., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
  7. Min, R., Nevian, T. Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses. Nat. Neurosci. , (2012).
  8. Eroglu, C., Barres, B. A. Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature. 468, 223-231 (2010).
  9. Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Action-potential modulation during axonal conduction. Science. 331, 599-601 (2011).
  10. Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 Forthcoming.
  11. Alvarez, J. I., et al. The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence. Science. 334, 1727-1731 (2011).
  12. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
  13. Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).
  14. Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles. Nature. 456, 745-749 (2008).
  15. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).
  16. Schachtrup, C., Moan, N. L. e, Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).
  17. Schachtrup, C., et al. Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage. J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).
  18. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).
  19. Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113, 221-233 (2002).
  20. Dabir, D. V., et al. Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes. J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).
  21. Wisniewski, H. M., Wegiel, J. Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components. Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).
  22. Shin, J. Y., et al. Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity. J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).
  23. Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson's disease brains. Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).
  24. Lioy, D. T., et al. A role for glia in the progression of Rett's syndrome. Nature. 475, 497-500 (2011).
  25. Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. GFAP and its role in Alexander disease. Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).
  26. Beck, K., Schachtrup, C. Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta. Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).
  27. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  28. Siao, C. J., Tsirka, S. E. Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II. J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).
  29. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
  30. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).
  31. Anthony, T. E., Heintz, N. The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects. J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).
  32. Skoff, R. P., Knapp, P. E. Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages. Glia. 4, 165-174 (1991).
  33. Molofsky, A. V., et al. Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective. Genes Dev. 26, 891-907 (2012).
  34. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
  35. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71, 799-811 (2011).
  36. Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60, 894-907 (2012).

Tags

علم الأعصاب، العدد 71، بيولوجيا الأعصاب، علم الأحياء الخلوي والطب والبيولوجيا الجزيئية، والدماغ، والماوس، والثقافة نجمية، نجمية، الخلايا الليفية، الفيبرينوجين، شوندروتن سلفات بروتيوغليكان، وتجديد الخلايا العصبية، الخلايا الثقافة، نموذج حيواني
العزلة وثقافة الخلايا النجمية الماوس القشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K.,More

Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes. J. Vis. Exp. (71), e50079, doi:10.3791/50079 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter