Summary
星形胶质细胞被确认为是正常的大脑发育和功能，以及中枢神经系统的修复是必不可少的基本生物过程的多功能细胞参与。在这里，我们提出了一个快速的过程，以获得纯净的小鼠星形胶质细胞培养研究本类主要的中枢神经系统的细胞生物学。
Abstract
星形胶质细胞是哺乳动物大脑中的细胞类型丰富，但仍有许多工作有待了解它们的分子和功能特性。星形胶质细胞在体外培养系统可以用来详细研究这些神经胶质细胞的生物学功能。此视频协议显示了如何获得纯鼠标幼崽的混合皮层细胞的分离和培养的星形胶质细胞。该方法是基于上没有存活的神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞，小胶质细胞，三个主要的神经胶质细胞种群的中枢神经系统的，在培养和分离。在第一天的文化代表图像显示的混合细胞群的存在，并表示时间点，当星形胶质细胞的汇合和小胶质细胞和少突胶质细胞应分开。此外，我们表现出纯度和完善培养的星形胶质细胞，用免疫细胞化学染色星形胶质细胞形态和新近被描述的星形胶质细胞的标记。这种文化系统可以很容易地获得纯星形胶质细胞和星形胶质细胞条件培养液对星形胶质细胞生物学研究的各个方面。
Introduction
星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的一个非常丰富的细胞类型。在小鼠和大鼠皮质星形胶质细胞对神经元的比例是1:3，而每个神经元有1.4星形胶质细胞在人脑皮层1。在最近几年急剧增加星形胶质细胞功能的兴趣。一个关键功能的星形胶质细胞是神经元2,3结构和代谢支持的作用。新发现的星形胶质细胞的作用涵盖了广泛的功能。这些措施包括4-6在开发过程中，引导轴突和若干神经母细胞的迁移功能的突触传递，突触强度和信息处理的神经回路7-9，形成血脑屏障（BBB）的角色，在10和完整性11-13调节脑血管音14。的另一大特点是他们的星形胶质细胞对损伤的反应。在病理条件astrocyt的上课成为反应性和进一步上调表达的中间丝胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和抑制细胞外基质（ECM）蛋白15,16。划定的健康组织的损伤部位形成胶质瘢痕，主要由星形胶质细胞分泌的细胞外基质蛋白，硫酸软骨素蛋白多糖（CSPG）家庭星形胶质细胞反应性增生，抑制轴突再生的主要因素，中枢神经系统损伤后15日至17日 。
星形胶质细胞在胚胎发育晚期和产后早期生命起源于放射状胶质细胞（RG）。规范已发生后，星形胶质细胞，星形胶质细胞的前体迁移到它们的最终位置，在那里他们开始终末分化过程中， 在体内 ，星形胶质细胞似乎是成熟的出生后三至四个星期，如所指示的典型形态18,19。 RG细胞亚群转化为脑室下区星形胶质细胞（B型细胞）。乙超视距，RG型和B细胞的功能在开发过程中的成人星形胶质细胞的神经干细胞（NSCs）。喜欢的星形胶质细胞，RG和B型细胞也表达星形胶质细胞特异性的谷氨酸转运体（GLAST），脑脂质结合的蛋白（BLBP）的，和GFAP，表明这些标记可以不专门用于专门标记成人星形胶质细胞。相反成人的实质星形胶质细胞，没有分裂的健康的大脑，RG和B型细胞表现出干细胞的潜力，如自我更新的能力。星形胶质细胞失调有牵连的许多病症，包括老年痴呆症的20,21，亨廷顿氏病22，帕金森氏病23，Rett综合征24日和亚历山大的疾病25。此外，星形胶质细胞反应所有侮辱的中枢神经系统，导致星形胶质细胞活化和星形胶质细胞胶质瘢痕的形成16,26。星形胶质细胞胶质瘢痕形成以下大脑TRAUMA或脊髓损伤被认为是主要的屏障，防止神经细胞再生的15。
可靠的方法来隔离和保持纯化的细胞群的发展一直是我们了解神经系统的关键。创业的工作由麦卡锡和Vellis使调查人员，准备近纯培养的星形胶质细胞从新生大鼠组织27。关于使用这种方法，在这里稍加修改，以隔离小鼠脑皮层星形胶质细胞星形胶质细胞生物学已学到很多东西。补充体内研究中 ，星形胶质细胞以及空调介质使用所描述的体外培养，是宝贵的工具，以进一步深入了解星形胶质细胞的功能。
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Protocol
1。混合皮层细胞的分离和电镀
混合皮层星形胶质细胞培养细胞分离，可以使用P1到P4鼠标幼崽。为了实现适当的星形胶质细胞的密度，它是必要的使用4鼠标小狗皮质每T75组织培养烧瓶中。因此，以下协议中的卷是计算一个单元使用4次鼠标幼崽的准备。
- 开始解剖过程之前，prewarm 30毫升的星形胶质细胞的培养基（DMEM，高葡萄糖+ 10％热灭活的牛胎儿血清+ 1％青霉素/链霉素;见表）至37℃。涂布一T75烧瓶中，用20毫升的聚-D-赖氨酸（PDL），在1小时，在细胞培养级的水的浓度为50微克/毫升，在37℃下在CO 2培养箱中。
- 对于解剖过程中，准备所有必要的试剂和材料。你将需要：手术剪，抚平细小的镊子，平头镊子，纸巾，垃圾袋，70％乙醇D 2解剖菜（3.5厘米直径）冰填充用2 ml HBSS。
- 轻轻握住，并用70％乙醇的小狗鼠标喷的头部和颈部。被牺牲的动物通过斩首使用的剪刀。
- 执行正中切口，后到前，，沿头皮透露的头骨。
- 切头盖骨仔细地从脖子到鼻子。两个额外的削减，以便进一步进入大脑进行：第一刀前部的嗅球，另一种劣质的小脑断开的头盖骨，颅底。
- 颅翼片使用扁平喷嘴钳，轻轻翻转到侧和大脑被取出并置于第一解剖菜填充用HBSS。将菜上的冰和继续收集所有4个大脑。
- 在立体显微镜下进行解剖过程的其余部分。首先，在嗅球和小脑使用精细除去解剖钳（ 图1B）。
- 为了找回皮质，抓住后用细镊子的大脑，执行一个正中切口两半球，镊子插入第二组创建的树林和剥离的板状结构的皮质大脑。
- 仔细解剖脑膜皮质半球拉用细镊子（ 图1D）。此步骤可避免污染最终的星形胶质细胞的培养由脑膜细胞和成纤维细胞。准备皮质半球转移到第二盘充满了HBSS，并返回到冰。所有4个皮质继续进行。
- 最后，横切成小块，用锋利的刀片（约4至8倍）的皮质半球。
- 在无菌条件下，转印的皮质片放入一个50毫升Falcon管中，并添加至总体积为22.5毫升的HBSS中。
- 加入2.5毫升的2.5％的胰蛋白酶，混合孵育的组织在37℃下在水浴中30分钟。混合偶尔晃动每10分钟。
- 离心5分钟，在300×g离心沉淀皮层组织片。
- 仔细收集上清用倾析法。为了避免失去组织沉淀，您可以机械地保留使用吸管。解离成单细胞悬浮液，通过添加10毫升星形胶质细胞电镀介质和剧烈的移液使用10毫升塑料移液管，直到组织片解离成单细胞（20〜30次）的组织。调节音量使用星形胶质细胞电镀液20毫升。您可以证明的皮质组织的离解成单个细胞，用血细胞计数板计数。一个准备的4鼠标小狗的皮质产生10-15×10 6个分离的单个细胞。
- 吸干PDL从T75培养瓶中，板的解离的单细胞悬浮液和孵育在37℃下在CO 2培养箱中。
2。获取ENRiched星形胶质细胞文化
- 改变介质的电镀混合皮层细胞和所有的3天之后的2天之后。
- 7〜8天，当星形胶质细胞的汇合和叠加的小胶质细胞上的星形胶质细胞层坐在暴露或已经脱离的星形胶质细胞层（ 图2）后，摇动的T75烧瓶中，在180rpm下30分钟以除去小胶质细胞上轨道摇床。弃上清含小神经胶质细胞或文化，如果你想和检查小胶质细胞，旋转和文化28,29板。
- 添加20毫升新鲜星形胶质细胞的培养基中，并继续通过摇动烧瓶中，在240 rpm下6小时，以除去少突胶质细胞的前体细胞（OPC）。由于一些OPCs的不会完全从星形胶质细胞层分离，的继续用手剧烈振摇1分钟，为了防止OPC污染。弃上清或旋转板，如果你想培养OPCs的29。
- 冲洗剩余的confluent的星形胶质细胞层两次，用PBS，吸出PBS，添加5毫升胰蛋白酶-EDTA和孵育在37℃下在CO 2培养箱中每5分钟检查支队的星形胶质细胞和执行支队的星形胶质细胞的击中烧瓶中对你的手的手掌（2-3倍）。
- 后星形胶质细胞的分离培养瓶中，加入5毫升的星形胶质细胞的培养液中，自旋细胞在180×g离心5分钟，吸出上清液，加40毫升新鲜的星形胶质细胞的镀介质。一个T75细胞培养瓶中后的第一次细胞分裂产生约1×10 6个细胞。板细胞在CO 2培养箱中在37℃下在两个T75培养瓶中并孵育。更改的介质每2到3天。
- 12-14天，先拆后星形胶质细胞接种于合适的细胞浓度为24-48小时，然后再进行实验。一个T75细胞培养瓶中应该产生大约1.5-2×10 6个细胞后，第二次细胞分裂。
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Representative Results
当完整的小鼠脑组织（ 图1A），小脑和嗅球必须要除去（ 图1B）的隔离。小心地取出（ 图1E）的小鼠脑干个别皮层（ 图1D）（图1C）和脑膜皮层剥离。脑膜的是明显的由脑膜动脉系统的和不完整的去除污染由脑膜细胞和成纤维细胞，星形胶质细胞的最终文化结果。
电镀混合皮层细胞悬浮液后，某些星形胶质细胞已经附加到培养烧瓶中，在24小时内（ 图2A）。然而，细胞培养物上清液，将包含细胞碎片和死亡的神经元的第3〜5天（ 图2A-C），作为培养基中有利于神经胶质细胞的存活和生长的。一旦星形胶质细胞的汇合和小胶质细胞坐在的astrocyt暴露E层，通常在7天隔离后的混合皮层细胞，星形胶质细胞被分离的小胶质细胞和原花色素振荡（ 图2D）。 2天之后的第一次分裂细胞星形胶质细胞形态。在这一点上的星形胶质细胞的密度是低的胶质细胞和星形胶质细胞是浩繁（ 图2E，黑色箭头标记一个单元格）。在这一点上的预期收益率较低，约4-6×10 5个细胞T75细胞培养瓶中。然而，细胞增殖和成熟的文化在这个时间点。的星形胶质细胞通常是用于实验的第21天到第28（ 图2F），以确保一个成熟的孤立的星形胶质细胞的表型。在这一点上的预期的收率是约1.5-2×10 6个细胞每T75组织培养烧瓶中。
星形胶质细胞培养纯度的特点，通过电子显微镜形态学研究，细胞标记物的表达和药物的反应27。了污染strocyte文化可以检查通过使用小胶质细胞标记（IBA-1）和原花色素（O4）。应检查所获得的星形胶质细胞培养的纯度和成熟的免疫细胞化学检测GFAP蛋白的抗体。据预计，大多数的细胞显示一个密集，丝状的信号（ 图3）。我们的隔离和皮层星形胶质细胞的培养方法，导致在星形胶质细胞的纯度大于98％，所揭示的对GFAP蛋白（ 图3）中使用的抗体。如果该过程成功，污染细胞是罕见的（<2％），并含有小胶质细胞和原花色素，它可以通过使用IBA-1和O4分别染色。如果需要的话，进一步的分析，也可以使用其他的星形胶质细胞的标记物，如水通道蛋白4，BLBP，S100B和GLAST。此外，以GFAP，这些标记都表示，通过28天的星形胶质细胞培养。最近的基因表达纯化的星形胶质细胞群体的分析发现了新的潜在的ASTrocyte标记，如叶酸代谢酶ALDH1L1 30,31，这也是大多数分离的大鼠星形胶质细胞（ 图3）所表示。
图1。 A）全脑解剖产后（P3）鼠标皮质 。 B）搬迁后的嗅球及小脑脑。 C）的分离皮层剥离板状结构从大脑皮质。 D，D'）皮层腹侧和背侧网站与脑膜（黑色箭头表示脑膜动脉）。 E）的Cortex没有脑膜。比例尺，1.5毫米。
图2。分离后的不同时间点孤立的混合皮层细胞和星形胶质细胞纯文化的形态概述。A）电镀混合皮层细胞后第1天。第一星形胶质细胞的附着到烧瓶底部（黑色箭头），死亡的神经元是在上清液中。 B）电镀混合皮层细胞后第3天。星形胶质细胞层正在形成（黑色箭头）。神经元是几乎不存在。 C）后5日内电镀混合皮层细胞。第一小胶质细胞和OPCs的顶部的星形胶质细胞层（黑色箭头）。 D）电镀混合皮层细胞后第7天。星形胶质细胞层完全融合的。 E）分裂后剧烈摇动，2天取出后小胶质细胞和原花色素，贴壁细胞，星形胶质细胞形态与低密度（箭头表示一个细胞）。 F）星形胶质细胞层示出高密度的第一分割后2个星期。比例尺，10微米。
图3。免疫的小鼠原代星形胶质细胞的尽头星形胶质细胞的主要文化的纯度。Tures的标记GFAP，GLAST，S100B，水通道蛋白4，ALDH1L1和BLBP（全部绿色）显示星形胶质细胞纯小学文化。细胞核染色，4'，6'-二脒基-2 - 苯基吲哚（DAPI）（蓝色）。比例尺：10微米。
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Discussion
这里介绍的方法是基于从啮齿动物新生儿的大脑，于1980年27麦卡锡和德Vellis的原先所描述的星形胶质细胞培养制备。从出生P1到P4小鼠大脑皮质星形胶质细胞的分离和培养的方法，这里介绍的是速度快，产量纯星形胶质细胞是高度可重复性。这种技术可以很容易地转移到隔离来自其他物种的星形胶质细胞，如从大鼠或猪和由大脑的其他区域，如脊髓。而由麦卡锡和deVellis的方法，从新生儿脑星形胶质细胞祖细胞的分离产生高度增殖细胞，出生后的P1-P4鼠标幼崽，孤立的星形胶质细胞细胞的增殖和传播是有限的。分裂后星形胶质细胞在体外培养 7天（DIV），他们将增长至融合和成熟的。 在体内 ，最星形胶质细胞增殖，主要是完成P14 32。他再次，我们建议使用星形胶质细胞的实验，在每天21至28日的DIV（图2F），以确保孤立的星形胶质细胞的成熟型。由于星形胶质细胞培养增殖的内在约束不应该被劈裂的3倍以上。
在所描述的分离方法的关键步骤是皮质的消化和下面的研磨，消化的组织获得的单细胞悬浮液。因此，它是必要的，以优化研制后的大脑皮质组织为20-30倍，以得到单细胞悬浮液的胰蛋白酶的浓度和消化时间。为了减少变化的胰蛋白酶，应等分并应避免冻融循环。所描述的过程依赖于电镀混合皮层细胞PDL涂覆的培养瓶中，从而确保了对星形胶质细胞的结合和促进了合流的星形胶质细胞层电镀后几天。虽然PDL的涂层是没有必要的星形胶质细胞米aintenance之后所分离的小胶质细胞和少突胶质细胞，也可以进行一定的下游应用如免疫荧光染色。的第一小区分裂的良好的时序是非常重要的细胞的完整性和产量。如果星形胶质细胞的培养超越他们达到融合，你可能会失去大部分在第一个细胞分裂的细胞，由于没有足够的支队。这是不能克服脱离，越来越多的时间，因为大量的孵化时间与胰蛋白酶负面影响细胞的完整性。相反，几乎没有太皮质细胞悬浮液镀将导致汇合星形胶质细胞层的形成不充分。第一次细胞分裂的最佳时间是在7〜8天在电镀混合皮层细胞后，当星形胶质细胞的汇合和小胶质细胞坐在最上面的位置的星形胶质细胞层。
在皮质细胞培养，星形胶质细胞的异质性（<强图3），因为它已被描述为星形胶质细胞在体内 33,34。但是，定义不同的星形胶质细胞形态和功能已经阻碍了数量有限的标记来识别和区分潜在的异质性星形胶质细胞亚型。成熟的纤维和星形胶质细胞反应性增生是一个很好的特点标记GFAP。但是，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）几乎不表达成熟的原浆的星形胶质细胞，星形胶质细胞的标记物可用于所有限制其使用，它也表示由RG细胞在开发过程中，由B细胞在成人，作为一个阶段特异性的标记物，限制其使用。其他标记的星形胶质细胞，包括GLAST，ALDH1L1或BLBP，也由不成熟的星形胶质细胞中表达，因此，不完全成熟的星形胶质细胞的标记。最后，成熟的星形胶质细胞的标记物，如胶质纤维酸性蛋白，水通道蛋白-4，和S100B（ 图3）也越来越上调在出生后成熟。
在我们的手中，AST在4周龄的rocyte文化有成熟的星形胶质细胞在体内的特点。使用主星形胶质细胞培养，我们可以识别的分子机制如何出生的血液蛋白纤维蛋白原诱导星形胶质细胞活化17。我们的研究显示，纤维蛋白原是一种载体的休眠型TGF-β。导致活性型TGF-β的形成和激活TGF-β/Smad信号通路在星形胶质细胞17,26与纤维蛋白原的原代星形细胞治疗。这些结果已证实， 体内纤维蛋白原注射 。此外，星形胶质细胞控制其它类型的细胞所分泌的物质，它可以分析收获星形胶质细胞条件培养基，并应用此其他类型的细胞的条件培养基。我们以前使用的星形胶质细胞条件培养液中的纤维蛋白原治疗的星形胶质细胞条件培养液如何影响神经轴突生长的功能分析来分析。反应性星形胶质细胞表达和分泌蛋白质的的CSPG家庭，从而抑制神经轴突生长16。事实上，从处理过的纤维蛋白原的星形胶质细胞条件培养基显着下降突起长度和表示神经轴突生长17的细胞的百分比。
在本协议中所描述的星形胶质细胞的分离和培养的调查星形胶质细胞生物学提供了一个功能强大的工具，因为他们在不同的应用程序的可管理性，可大大体内完成调查。然而，应当牢记的已得到的星形胶质细胞在体外培养，并当它们反映许多星形胶质细胞的特性，它们也不同于在体内的星形胶质细胞。因此，其他的方法直接选择和隔离的星形胶质细胞通过immunopanning 35岁或抗体为基础的流式细胞术隔离36代表了新的途径，以进一步探讨星形胶质细胞的基本性质。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
SS，联邦教育与研究部（BMBF 01 EO 0803），KB和欧盟委员会FP7格兰特PIRG08-GA-2010-276989，NEUREX，德国研究基金会资助SCHA 1442 /的Fazit基金会研究生奖学金的支持下3-1 CS有没有冲突的财务权益。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
| Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
| PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Water bath | Julabo | SW20; 37 °C | |
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