Summary
Astrositler normal beyin gelişimi ve işlevi, ve merkezi sinir sistemi onarımı için gerekli olan temel biyolojik süreçler katılan yönlü hücreler olduğu kabul edilmiştir. Burada santral sinir sistemi hücrelerinin bu büyük sınıf biyoloji eğitimi saf fare astrosit kültürleri elde etmek için hızlı bir prosedürdür.
Abstract
Astrositler memeli beyin içinde bol bir hücre tipi, henüz çok moleküler ve işlevsel özellikleri öğrendik gerekmektedir. Astrosit in vitro hücre kültürü sistemlerinde detaylı olarak bu glial hücrelerin biyolojik fonksiyonları incelemek için kullanılabilir. Bu video protokol fare yavrular karışık kortikal hücrelerin izolasyonu ve kültürü ile saf astrositler edinme gösterir. Yöntem, canlı nöronların ve astrositlerin yokluğunda, oligodendrosit ve mikroglia, kültür içinde merkezi sinir sistemi üç ana glial hücre popülasyonları, ayrılmasına dayanır. Kültürün ilk günlerinde Örnek görüntüleri karışık bir hücre popülasyonunun varlığına göstermek ve astrositler konfluent haline ve mikroglia ve oligodendrosit ayrılmalıdır zaman timepoint göstermektedir. Ayrıca, saflık ve iyi kurulmuş için immünohistokimyasal boyamalar kullanarak kültürlü astrositlerde astrositik morfolojisi göstermek veYeni astrosit belirteçler nitelendirdi. Bu kültür sistemi kolaylıkla astrosit biyolojinin çeşitli yönlerini araştırmak için saf fare astrosit ve astrosit-şartlı ortam elde etmek için de kullanılabilir.
Introduction
Astrositler merkezi sinir sistemi (MSS) bir çok bol hücre tipi vardır. İnsanda korteksin 1 nöron başına 1,4 astrositler vardır oysa nöronlara astrositlerde oranı, fareler ve sıçanların kortekste 01:03 olduğunu. Astrosit fonksiyonu ilgi son yıllarda önemli ölçüde artmıştır. Astrositlerde bir anahtar işlevi nöronlar 2,3 yapısal ve metabolik destek sağlayarak onların rolüdür. Astrositlerin Yeni keşfedilen rolleri işlevleri geniş bir yelpazesini kapsar. Bu gelişim 4-6 esnasında gelişen aksonlar ve bazı nöroblast göç rehberlik, sinaptik iletim fonksiyonları, nöral devreleri 7-9 ile sinaps gücü ve bilgi işleme, kan-beyin bariyeri roller (BBB) oluşumu 10 ve bütünlük 11-13 içerir serebrovasküler tonu 14 ve düzenlenmesi. Astrositlerde bir diğer önemli özelliği yaralanma onların yanıttır. Patolojik koşullar altında, astrocytes reaktif hale gelir ve daha fazla ara filaman glial fibriler asidik protein (GFAP) ve inhibitör ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleri 15,16 ekspresyonunu upregüle. Reaktif astrositler kondroitin sülfat proteoglikan (CSPG) ailesinin astrosit salgılanan ECM proteinleri çoğunlukla oluşan bir glial skar oluşması, sağlıklı doku hasarı sitesi ayırmak, bu önemli faktörler MSS yaralanması 15-17 sonrasında aksonal rejenerasyon inhibe ederler.
Astrositler geç embriyogenez ve erken postnatal ömrü boyunca radyal glial (RG) hücrelerden kaynaklanır. Astrosit belirtim oluştu sonra astrosit habercileri son konumlarına göç, onlar terminal farklılaşma süreci başlar nerede. İn vivo olarak, astrositler bunların tipik morfoloji 18,19 ile gösterildiği gibi üç ila dört hafta doğumdan sonra olgun görünmektedir. RG hücre subpopülasyonu subventricular dilimi astrositler (tip B hücreleri) dönüştürmek. Both, RG ve B tipi hücrelerin sırasıyla, geliştirme sırasında ve yetişkin astrosit benzeri nöral kök hücreler (NSC'lerde) olarak işlev. Astrositler, RG ve B tipi hücreler gibi de bu belirteçler sadece özellikle yetişkin astrositler etiketlemek için kullanılamaz belirten astrosit özgü glutamat taşıyıcısı (GLAST), beyin lipid-bağlayıcı protein (BLBP) ve GFAP ifade. Sağlıklı beyin, RG ve böyle kendini yenilemek için kapasite olarak B tipi hücreler sergi kök hücre potansiyeli bölmek değil yetişkin parankimal astrositler, aksine. Astrosit düzensizliği Alzheimer hastalığı 20,21, 22, Huntington hastalığı, Parkinson hastalığı 23, Rett sendromu, 24 ve 25 Alexander hastalığı da dahil olmak üzere, çeşitli patolojiler kapsamına dahil edilmiştir. Ayrıca, astrositler astrosit aktivasyonu ve astrositik glial skar 16,26 yol MSS tüm hakaretlerini tepki. Aşağıdaki beyin tr oluşturan astrositik glial skarauma veya spinal kord yaralanması nöronal rejenerasyon 15 engelleyen ana engel olarak düşünülmektedir.
Hücrelerin saflaştırılmış popülasyonları ayırmak ve korumak için güvenilir yöntemler geliştirilmesi sinir sisteminin anlayışımıza önemli olmuştur. McCarthy ve de Vellis tarafından öncülük çalışmaları yenidoğan sıçan doku 27'den astrositlerde neredeyse saf kültürleri hazırlamak için bugüne kadar araştırmacılar sağlar. Much fare kortikal astrositler izole etmek için biraz değiştirilmiş bir formu burada sunulan bu yöntemle, astrosit biyoloji öğrendi olmuştur. Vivo çalışmalar, astrositler yanı sıra klimalı ortamda elde edilen in vitro kültür açıklanan kullanarak tamamlayan, daha astrosit işlevleri içgörüler kazanmak için değerli araçlardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Karışık Kortikal Hücre İzolasyonu ve Kaplama
Astrosit kültürleri için Karma kortikal hücre izolasyonu P4 fare yavruları P1 kullanılarak yapılabilir. Uygun astrosit yoğunluğu elde etmek için, her iki T75 doku kültürü şişesi başına 4 fare korteksi pup kullanmak gereklidir. Bu nedenle, aşağıdaki protokol miktarlar 4 fare yavru kullanarak bir hücre hazırlama için hesaplanmıştır.
- Diseksiyon işlemine başlamadan önce, kültür ortamı astrosit prewarm 30 ml (DMEM, yüksek glikoz +% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu +% 1 penisilin / streptomisin; tabloya bakınız) 37 ° C'ye kadar 37, 1 saat boyunca hücre kültür dereceli su içinde 50 mg / ml 'lik bir konsantrasyon ° CO2 kuluçka makinesi içinde C, poli-D-lizin (PDL) 20 ml T75 ile kaplayın bir flask.
- Diseksiyon işlemi için gerekli tüm reaktifleri ve malzemeleri hazırlamak. İhtiyacınız olanlar: cerrahi makas, düz ince forseps, düz meme forseps, kağıt havlu, çöp torbası,% 70 etanol birbuz üzerinde d 2 diseksiyon yemekleri (3.5 cm çapında) 2 ml HBSS her ile doldurulur.
- Hafifçe tutun ve% 70 etanol ile yavru fare baş ve boyun püskürtün. Hayvan makas kullanarak hayvanlar feda edilir.
- Kafatası ortaya çıkarmak için kafa derisi boyunca anterior posterior orta hat kesi, gerçekleştirin.
- Boyun burun dikkatli kafatası kesin. İki ek kesikler beyne daha fazla erişim sağlamak için yapılır: İlk kesik olfaktor, kafatası tabanından kafatası kesmek için serebellumun alt diğeri anterior yapılır.
- Düz uç forseps kullanılarak, kafatası kanatlar hafifçe yana doğru çevrilmiş ve beyin HBSS ile dolu birinci kesme çanak içine alınır ve yerleştirilir. Buz üzerinde yemeğin geri yerleştirin ve tüm 4 beyinleri hasat devam ediyor.
- Disseksiyon Prosedürün geri kalan bir stereomikroskop altında gerçekleştirilir. Birincisi, olfaktor ve beyincik ince kullanarak kaldırılırdiseksiyon forseps (Şekil 1B).
- , Korteksleri almak ince forseps ile beyin arka ucunu yakalamak için, hemisfer arasında orta hattan bir kesik gerçekleştirmek oluşturulan koru ile forseps ikinci bir dizi eklemek ve soyma uzağa dan korteksin plaka benzeri bir yapıya beyin.
- Dikkatlice ince forseps (Şekil 1D ') ile çekerek korteks hemisferden meninksler teşrih. Bu adım, meningeal hücreler ve fibroblastlar tarafından nihai astrosit kültürünün kirletmeyecek. HBSS ile dolu ikinci yemeğin içine hazırlanmış korteks hemisferlerin aktarın ve buz üzerine geri. Tüm 4 korteksleri buna göre devam edin.
- Son olarak, keskin bıçakları (yaklaşık 4 ila 8 kez) kullanarak küçük parçalar halinde her korteks yarımkürede kesti.
- Steril koşullar altında, transfer korteks bir 50 ml Falcon tüp içine parçalar ve 22.5 ml toplam hacmi ile HBSS ekleyin.
- % 2.5 tripsin, karışımı 2.5 ml ekleyin ve inkübe37 su banyosunda doku ° C'de 30 dakika süre ile. Her 10 dakikada sallayarak arada çevirerek karıştırın.
- Pelet korteks doku parçaları için 300 xg'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Dikkatle dekantasyon ile süpernatant kaldırmak. Doku pelet kaybetmemek için size mekanik bir pipet kullanarak tutabiliriz. Doku parçaları tek hücreler (20-30 defa) içine ayrılamaz oluncaya kadar bir 10 ml plastik pipet kullanılarak 10 mL astrosit kaplama orta ve şiddetli pipetleme eklenmesi ile tek bir hücre süspansiyonu içine doku ayrışır. Astrosit kaplama orta kullanarak 20 ml ses seviyesini ayarlayın. Bir hematocytometer kullanarak sayarak tek hücre içine kanıtı korteks doku ayrışma olabilir. 4 fare yavru korteks biri hazırlanması 10-15 x10 6 disosiye tek hücre boyun eğmek zorundadır.
- T75 kültür şişelerinde gelen PDL aspire plakası 37 disosiye tek bir hücre süspansiyonu ve inkübe ° CO 2 inkübatör C.
2. Bir Enr Edinmeiched astrosit Kültür
- Bundan sonra karışık kortikal hücreleri ve tüm 3 gün sonra kaplama orta 2 gün değiştirin.
- Astrositler konfluent ve bindirilirken mikroglia vardır astrosit katmanda maruz oturmak veya zaten astrosit tabakası (Şekil 2) ayrılmış olan 7 ila 8 gün sonra, mikroglia kaldırmak için orbital çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca 180 rpm'de T75 çalkalanır. Süpernatant içeren mikroglia atın veya kültür isteyen ve mikroglia tetkik edersek, aşağı doğru döndürün ve kültür 28,29 için plaka.
- 20 ml taze astrosit besiyeri ekleyin ve oligodendrosit prekürsör hücrelerinin (OPC) kaldırmak için 6 saat boyunca 240 rpm'de şişeyi sallayarak devam. Bazı OPCs tamamen astrosit katmanından terketmez yana, OPC kirlenmesini önlemek amacıyla 1 dakika boyunca elle şiddetle sarsmaya devam ediyor. Süpernatantı atın veya kültür OPCs 29 isterseniz, aşağı ve plaka dönerler.
- Kalan conflue DurulamaPBS ile iki kere nt astrosit tabaka, 37 CO2 kuluçka makinesi içinde 5 ml tripsin-EDTA ile inkübe eklemek ° C'de, PBS aspire Astrositlerde dekolmanı her 5 dakikada kontrol edin ve elinizi (2-3 kez) ve palmiye karşı şişeyi vurarak astrositlerde dekolmanı zorlamak.
- Astrositler kültürü şişesi ayrılmış, sonra, astrosit kültür ortamı, 5 dakika boyunca 180 xg'de sıkma hücreler, 5 ml eklemek süpernatan aspire ve 40 ml taze ortam astrosit kaplama ekleyin. Bir T75 doku kültürü şişesi ilk hücre bölünmesinden sonra 6 1x10 çevresindeki hücreleri boyun eğmek zorundadır. 37 iki T75 kültür şişeleri ve inkübe Levha hücreleri ° CO 2 inkübatör C. Her 2 ila 3 gün orta değiştirin.
- Ilk split astrositler sonra 12-14 gün deneme gerçekleştirmeden önce uygun hücre konsantrasyonu 24-48 saat içinde kaplanır. Bir T75 doku kültürü şişesi ikinci hücre bölünmesinden sonra 1.5-2 çevresindeki x10 6 hücre boyun eğmek zorundadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tam fare beyin (Şekil 1A), serebellum ve olfaktor (Şekil 1B) kaldırılması gerekir izolasyonu üzerine. Korteksleri fare beyin sapı (Şekil 1C) ve bireysel korteks (Şekil 1D ') arasında menenjlerin soyulmuş özenle (Şekil 1E) kaldırılır. Meninksler meningeal arter sistemi ve meningeal hücreler ve fibroblastlar tarafından nihai astrosit kültür kirlenmesine eksik kaldırma sonuçları ortada.
Mikst kortikal hücre süspansiyonu kaplama sonra, bazı astrositler zaten 24 saat (Şekil 2A) içindeki kültürü şişesi iliştirin. Kültür ortamı glial hücre hayatta kalma ve büyüme yanadır Ancak, hücre kültür yüzey maddesi, ilk olarak 3 ile 5 gün (Şekil 2A-C) için hücre artıkları ve ölen nöronların içerir. Bir kez astrositler konfluent ve mikroglia astrocyt çıplak oturmakE tabakası, genellikle karma kortikal hücrelerin izolasyonu sonrası 7. günde, astrositler (Şekil 2B) sallayarak mikroglia ve OPCs ayrılmalıdır. Ilk split hücreler 2 gün sonra astrosit morfoloji göstermektedir. Bu noktada astrosit yoğunluğu düşüktür ve astrositler hacimli vardır (Şekil 2E, siyah oklar bir hücre işaretleyebilirsiniz). Bu noktada beklenen verim T75 doku kültürü şişesi başına yaklaşık 4-6 x10 5 hücreleri ile düşüktür. Ancak, hücreleri hala çoğalırlar ve bu timepoint kültür olgun. Astrositler genelde izole astrositlerin fenotipi, bir olgun sağlamak için 28 (Şekil 2F) ile 21. günde deneyler için kullanılır. Bu noktada beklenen verim T75 doku kültürü şişesi başına 1.5-2 hakkında x10 6 hücre olduğunu.
Astrosit kültür saflığı elektron mikroskobu morfolojik çalışmalarda, hücre işaretleyici ifade ve farmakolojik yanıt 27 ile karakterize edilmiştir. Bir kirlenmesistrocyte kültürü mikroglia (IBA-1) ve OPC (O4) için işaretleyici kullanılarak incelenebilir. Elde astrosit kültür saflığı ve vade GFAP proteinine karşı bir antikor kullanılarak immünohistokimyasal inceleme ile muayene edilmelidir. Bu, hücrelerin büyük bir kısmını bir yoğun, filamentli sinyali (Şekil 3) göstermektedir beklenmektedir. Kortikal astrositlerin Bizim izolasyonu ve kültürü yöntemi protein GFAP (Şekil 3) karşı bir antikor kullanılarak saptandı den daha büyük ve% 98 bir saflık astrosit ile sonuçlanmıştır. Prosedürü başarılı olursa, kontamine hücreler nadirdir (<% 2) ve sırasıyla IBA-1 ve O4 kullanılarak lekeli olabilir mikroglia ve OPCs içerir. Bu tür AQUAPORIN-4, BLBP, S100B ve GLAST gibi diğer astrosit işaretleri, ve arzu edildiği takdirde, daha ileri analizinde de kullanılabilir. GFAP ek olarak, bu belirteçler her 28 günlük astrosit kültürleri ile ifade edildi. Astrosit nüfus saflaştırılmış Yeni gen ekspresyon profili yeni potansiyel ast ortayaayrıca bu gibi izole edilmiş kortikal astrositler (Şekil 3) büyük kısmının ile ifade edilir folat metabolik enzim ALDH1L1 30,31, rocyte gibi belirteçler,.
Şekil 1. Postnatal (P3) fare korteksin Diseksiyonu. A) Tüm beyin. Olfaktor ve serebellumun alınmasından sonra B) Beyin. Beyin korteksinin plaka benzeri yapı soyulması ile korteksleri C) İzolasyon. D, meninksler (siyah oklar meningeal arterlerin belirtiniz) ile ventral ve dorsal sitesinden D ') Cortex. E) Cortex meninksler olmadan. Ölçek çubuğu, 1.5 mm.
Şekil 2. Izolasyonu sonrası farklı zaman noktalarında izole karışık kortikal hücreler ve saf astrosit kültür Morfolojik bakış.Mikst kortikal hücrelerin sonra kaplama A) 1 gün. İlk astrositlerde balonun altına (siyah oklar) bağlı ve ölmekte olan nöronların süpernatantta vardır. B) 3 gün karışık kortikal hücre sonra kaplama. Astrosit tabaka (siyah oklar) şekillendirme olduğunu. Nöronlar neredeyse bulunmaz. C) 5 gün karışık kortikal hücre sonra kaplama. İlk mikroglia ve astrosit tabakanın üstüne OPCs (siyah oklar). D) 7 gün mikst kortikal hücrelerin sonra kaplama. Astrosit tabakası tamamen konfluent olduğunu. E) bölme sonra güçlü titreme ve 2 gün ile mikroglia ve OPCs çıkardıktan sonra, ekteki hücreler düşük yoğunluklu (oklar tek bir hücreyi işaret) ile astrosit morfolojisi göstermektedir. F) astrosit katmanı 2 hafta ilk split sonra yüksek yoğunluklu gösterir. Ölçek çubuğu, 10 mikron.
Şekil 3,. Primer astrosit kültür Saflık. Birincil fare astrosit cul immünbelirteçler GFAP, GLAST, S100B, AQUAPORIN-4, ALDH1L1 ve BLBP (tüm yeşil) ile tures saf primer astrosit kültürü ortaya çıkardı. Çekirdekler 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (mavi) ile boyanmış. Ölçek çubuğu: 10 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada belirtilen yöntem, ilk olarak 1980 de 27 McCarthy ve De Vellis tarafından tarif kemirgen neonatal beyin gelen astrosit kültür hazırlanması dayanmaktadır. Postnatal P1 P4 fare beyin kortikal astrositlerde izolasyonu ve kültür modifiye metodu Burada sunulan, verimleri saf primer astrosit hızlı ve son derece tekrarlanabilir olduğunu. Bu teknik kolaylıkla böyle sıçan veya domuz ve böyle omurilik gibi diğer beyin bölgelerinden gibi diğer türler, gelen astrositler yalıtmak için transfer edilebilir. McCarthy ve deVellis yöntemi ile neonatal beyin astrosit progenitör hücre izolasyonu yüksek proliferatif hücreleri üretir Oysa, hücre çoğalması ve postnatal P1-P4 fare yavrular izole astrositlerde yayılımı sınırlıdır. Yarma astrositler kez vitro 7 günde (DIV), onlar büyüyecek sonra confluency ve olgun. Vivo olarak, çoğu astrosit proliferasyonu P14 32 tarafından büyük ölçüde tamamlandı. Ore, biz izole astrositlerde olgun fenotipi sağlamak için günde 21 ila 28 DIV (Şekil 2F) deneyleri için astrositler kullanmanızı öneririm. Astrosit kültürleri çoğalmaya içsel kısıtlama nedeniyle 3 kat daha fazla parçalı edilmemelidir.
Tarif edilen ayırma yöntemi kritik adımlar korteksleri sindirim ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için sindirilmiş doku aşağıdaki ezerek toz haline getirme bulunmaktadır. Bu nedenle, 20-30 kat için beyin korteks dokusu ezerek toz haline getirme sonra tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için tripsin konsantrasyon ve sindirim süresini optimize etmek için gereklidir. En aza indirmek için varyasyon tripsin aliquoted edilmeli ve donma-çözülme döngüleri kaçınılmalıdır. Açıklanan prosedür PDL kaplı kültürü şişeleri, astrositlerde bağlayıcı sağlar ve birkaç gün sonra kaplama bir konfluent astrosit tabakası teşvik üzerine karışık kortikal hücrelerin kaplama dayanmaktadır. PDL kaplama astrosit m için gerekli olmamakla birliktemikroglia ve oligodendrositler onların ayrılması sonra aintenance, bu tür immunofluorescene boyama gibi belirli uygulamalar için alt-yapılabilir. İlk hücrenin bölünmesi İyi zamanlama hücre bütünlüğü ve verimi açısından önemlidir. Onlar confluency ulaştı ötesinde astrosit kültürleri varsa, ilk hücre bölünme sırasında yetersiz dekolmanı nedeniyle hücrelerin çoğunluğu kaybedebilir. Bu olumsuz hücre bütünlüğünü etkileyen tripsin ile kapsamlı inkübasyon zamandan beri, dekolmanı için zaman artırarak üstesinden gelinemez. Buna karşın, pek çok kortikal hücre süspansiyonu kaplama birleşen astrosit hücre tabakasının yetersiz oluşumuna neden olur. Astrositler konfluent ve mikroglia hücreleri astrosit tabakasının üst konumda oturduğunuzda ilk hücre bölünme için en iyi zaman, karışık kortikal hücrelerin kaplama sonrasında 7 ila 8 günüdür.
Tarif kortikal hücre kültüründe, astrositler (hücresel heterojenite göstermektedir <kuvvetli> Şekil 3), bu da in vivo 33,34 astrositler için tarif edildiği gibi. Ancak, çeşitli astrosit morfolojisi ve işlevselliğini tanımlayan potansiyel heterojen astrosit alt tiplerini tanımlamak ve ayırt etmek belirteçlerinin sınırlı sayıda engel olmuştur. Olgun fibröz ve reaktif astrositlerde bir iyi karakterize işaretleyici GFAP olduğunu. Ancak, GFAP ancak tüm astrositler için bir belirteç olarak kullanımı sınırlayıcı, olgun protoplazmik astrositler ile ifade edilir ve aynı zamanda bir sahne özgü marker olarak kullanımını kısıtlayan, gelişim sırasında ve erişkin B hücreleri tarafından RG hücreler tarafından ifade edilir. GLAST, ALDH1L1 veya BLBP dahil astrositlerin, diğer belirteçler de olgunlaşmamış astrositler tarafından ifade edilmiştir ve bu nedenle sadece olgun astrositler işareti yok. Son olarak, GFAP, AQUAPORIN-4 ve S100B gibi olgun astrosit işaretleyicileri (Şekil 3) postnatal olgunlaşma boyunca giderek up-regüle vardır.
Bizim ellerde, ast4 haftalık bir yaşta rocyte kültürlerde in vivo olgun astrositlerde özelliklere sahiptir. Primer astrosit kültürleri kullanarak biz kanla proteini fibrinojen astrosit aktivasyon 17 indükler nasıl moleküler mekanizmayı belirlemede olabilir. Çalışmalarımız fibrinojen latent TGF-β bir taşıyıcı olduğunu ortaya koydu. Aktif TGF-β oluşumu ve astrositler 17,26 de TGF-β/Smad sinyalizasyon yolunun aktivasyonuna yol açan fibrinojen ile birincil astrositlerin tedavisi. Bu sonuçlar, in vivo olarak fibrinojen enjeksiyonları kullanılarak teyit edilmiştir. Ayrıca, astrositler astrosit klima orta hasat ve diğer hücre türleri için bu şartlı ortam uygulanarak analiz edilebilir maddelerin salgılanması ile diğer hücre tipleri kontrol eder. Biz daha önce akson uzantısı nasıl etkilediğini klimalı orta fibrinojen-işlenmiş astrositlerde fonksiyonel bir deneyde analiz etmek astrosit klimalı ortam kullanılmıştır. Reaktif astrositler ekspres ve salgılarakson uzantısı 16 inhibe CSPG ailenin proteinleri,. Fibrinojen işlenmiş astrosit Nitekim, klimalı ortamda anlamlı nörit uzunluğu ve akson uzantısı 17 gösteren hücrelerin yüzdesi de azalmıştır.
Çeşitli uygulamalarda yönetilebilirlik büyük vivo soruşturması tamamlanana çünkü bu protokolü açıklanan kortikal astrositlerde izolasyonu ve kültürü, astrosit biyoloji araştırmak için güçlü bir araç sağlar. Bununla birlikte, elde edilen astrositler in vitro kültürlenmiştir ve bir çok astrosit özelliklerini yansıtmaktadır iken, aynı zamanda in vivo astrositlerde farklı edilmiştir akılda tutulmalıdır. Bu nedenle, 35 veya antikor-tabanlı FACS izolasyon 36 immunopanning tarafından doğrudan seçim ve astrositler izolasyonu diğer yöntemleri daha astrositlerde temel özelliklerini araştırmak için yeni yollar temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
SS, KB ve Avrupa Komisyonu FP7 Hibe PIRG08-GA-2010-276989, NEUREX için Eğitim ve Araştırma Federal Bakanlığı (BMBF 01 EO 0803), ve / Alman Araştırma Vakfı Hibe scha 1442 için Fazit Vakfı Lisansüstü bursu tarafından desteklenir CS 3-1 yazarlar çakışan mali çıkarları var.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
| Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
| PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Water bath | Julabo | SW20; 37 °C | |
References
- Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).
- Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation. Cell Metab. 14, 724-738 (2011).
- Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia - more than just brain glue. Nature. 457, 675-677 (2009).
- Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology. Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).
- Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression. BMC Neurosci. 11, 132 (2010).
- Kaneko, N., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Min, R., Nevian, T. Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses. Nat. Neurosci. , (2012).
- Eroglu, C., Barres, B. A. Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature. 468, 223-231 (2010).
- Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Action-potential modulation during axonal conduction. Science. 331, 599-601 (2011).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 Forthcoming.
- Alvarez, J. I., et al. The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence. Science. 334, 1727-1731 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).
- Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles. Nature. 456, 745-749 (2008).
- Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).
- Schachtrup, C., Moan, N. L. e, Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).
- Schachtrup, C., et al. Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage. J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113, 221-233 (2002).
- Dabir, D. V., et al. Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes. J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).
- Wisniewski, H. M., Wegiel, J. Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components. Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).
- Shin, J. Y., et al. Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity. J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).
- Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson's disease brains. Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).
- Lioy, D. T., et al. A role for glia in the progression of Rett's syndrome. Nature. 475, 497-500 (2011).
- Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. GFAP and its role in Alexander disease. Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).
- Beck, K., Schachtrup, C. Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta. Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Siao, C. J., Tsirka, S. E. Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II. J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).
- Anthony, T. E., Heintz, N. The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects. J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).
- Skoff, R. P., Knapp, P. E. Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages. Glia. 4, 165-174 (1991).
- Molofsky, A. V., et al. Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective. Genes Dev. 26, 891-907 (2012).
- Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71, 799-811 (2011).
- Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60, 894-907 (2012).
