Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Isolasjon og kultur av mus Kortikale Astrocytes

Published: January 19, 2013 doi: 10.3791/50079

Summary

Astrocytes har blitt anerkjent for å være allsidige celler som deltar i grunnleggende biologiske prosesser som er avgjørende for normal utvikling av hjernen og funksjon, og det sentrale nervesystemet reparasjon. Her presenterer vi en rask prosedyre for å få rene mus astrocyte kulturer å studere biologi denne store klassen av sentralnervesystemet celler.

Abstract

Astrocytes er et rikt celletype i hjernen hos pattedyr, men mye gjenstår å lære om deres molekylære og funksjonelle egenskaper. In vitro astrocyte cellekultur-systemer kan brukes til å studere de biologiske funksjonene til disse gliacellene i detalj. Denne videoen protokollen viser hvordan du kan få rene astrocytes av isolering og kultur av blandede kortikale celler av mus valper. Metoden er basert på fravær av levedyktige nevroner og utskillelse av astrocytes, oligodendrocytes og microglia, de tre viktigste glial cellepopulasjoner av det sentrale nervesystemet, i kultur. Representative bilder under de første dagene av kultur påvise en blandet cellepopulasjon og indikere endepunktet, når astrocytes blir sammenflytende og skal skilles fra microglia og oligodendrocytes. Videre viser vi renhet og astrocytic morfologi dyrkede astrocytes bruker immuncytokjemisk stainings for godt etablert ognylig beskrevet astrocyte markører. Denne kulturen system lett kan brukes til å oppnå rene mus astrocytes og astrocyte klimaanlegg medium for å studere ulike aspekter av astrocyte biologi.

Introduction

Astrocytes er en meget rikelig celletype i sentralnervesystemet (CNS). Forholdet mellom astrocytes til nevroner er 01:03 i cortex av mus og rotter, mens det er 1,4 astrocytes per nervecelle i den menneskelige cortex en. Interessen for astrocyte funksjon har økt dramatisk de siste årene. En viktig funksjon av astrocytes er deres rolle i å gi strukturell og metabolsk støtte til nevroner 2,3. Nyoppdagede roller for astrocytes dekker et bredt spekter av funksjoner. Disse inkluderer guiding migrering av utviklingsland axoner og visse neuroblasts under utvikling 4-6, funksjoner i synaptisk transmisjon, synapse styrke og informasjonsbehandling ved nevrale kretser 7-9, roller i blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​formasjon 10 og integritet 11-13 og regulering av den cerebrovaskulære tonen 14. En annen viktig funksjon i astrocytes er deres respons på skade. Under patologiske tilstander astrocytes bli reaktive og ytterligere oppregulere uttrykk for den mellomliggende filament glial fibrillary surt protein (GFAP) og hemmende ekstracellulære matrix (ECM) proteiner 15,16. Avgrense reaktive astrocytes skaden området fra friskt vev ved å danne en glial arr, som består hovedsakelig av astrocyte skilles ECM proteiner av chondroitin sulfat proteoglykan (CSPG) familie, de viktigste faktorene som hemmer aksonal regenerasjon etter CNS skade 15-17.

Astrocytes stammer fra radial glial (RG) celler i slutten embryogenese og tidlig postnatal liv. Etter astrocyte spesifikasjonen har skjedd, astrocyte forløpere migrere til sine endelige posisjoner, hvor de begynner prosessen med terminal differensiering. In vivo, astrocytes synes å være moden tre til fire uker etter fødselen som indikert av sine typiske morfologi 18,19. En undergruppe av RG celler konvertere til subventricular sone astrocytes (type B-celler). Both, RG og type B-celler fungere som astrocyte-lignende nevrale stamceller (NSCs) under utvikling og i den voksne, henholdsvis. Som astrocytes, RG og type B-celler også uttrykke astrocyte-spesifikke glutamat transporter (GLAST), hjernen lipid-bindende protein (BLBP), og GFAP, noe som indikerer at disse markørene kan ikke bare brukes til å spesifikt merke voksne astrocytes. I motsetning til voksne parenkymatøs astrocytes, som ikke deler i sunn hjerne, RG og type B celler utstillingen stamcelle potensial slik som evnen til å selv fornye. Feilregulering astrocytes har blitt implisert i en rekke patologier, inkludert Alzheimers sykdom 20,21, Huntingtons sykdom 22, Parkinsons sykdom 23, Retts syndrom 24 og Alexander sykdom 25. Videre astrocytes reagere på alle fornærmelser i CNS, noe som fører til aktivering og astrocyte astrocytic glial arrdannelse 16,26. Den astrocytic glial arr som danner følgende hjernen trAUMA eller ryggmargsskade er tenkt å være den viktigste barrieren hindrer neuronal regenerasjon 15.

Å utvikle pålitelige metoder for å isolere og vedlikeholde rensede populasjoner av celler har vært avgjørende for vår forståelse av nervesystemet. Pionerarbeid av McCarthy og de ​​Vellis gjør etterforskere til dato for å forberede nesten rene kulturer av astrocytes fra neonatal rotte vev 27. Mye har blitt lært om astrocyte biologi ved hjelp av denne metoden, som er presentert her i en litt modifisert form for isolering mus kortikale astrocytes. Supplerer in vivo studier, astrocytes samt betinget medium oppnådd ved hjelp av den beskrevne in vitro kultur, er verdifulle verktøy for å ytterligere få innsikt i astrocyte funksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolering og Plating av Mixed Kortikale Cells

Blandet kortikal celleisolasjon for astrocyte kulturer kan utføres ved hjelp P1 til P4 mus valper. For å oppnå riktig astrocyte tetthet er det nødvendig å bruke fire mus pup cortices pr T75 vevskultur kolbe. Derfor er volumene i følgende protokoll beregnet for en celle forberedelse på 4 mus unger.

  1. Før disseksjon prosedyren, prewarm 30 ml astrocyte dyrkningsmedier (DMEM, høy glukose + 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum + 1% penicillin / streptomycin, se tabell) til 37 ° C. Belegge en T75 kolbe med 20 ml av poly-D-lysin (PDL) ved en konsentrasjon på 50 ug / ml i cellekultur gradert vann i 1 time ved 37 ° C i CO 2 inkubator.
  2. For disseksjon prosedyren, forberede alle nødvendige reagenser og materialer. Du trenger: kirurgisk saks, glatte fin tang, flat spiss tang, papirhåndklær, avfall bag, 70% etanol end 2 dissecting retter (3,5 cm diameter) på is fylt med 2 ml HBSS hver.
  3. Hold og spray hodet og nakken av musen valpen med 70% etanol. Dyret blir avlivet ved dekapitering hjelp saksen.
  4. Utfør en midtlinjesnitt, posterior til anterior, langs hodebunnen å avsløre skallen.
  5. Skjær kraniet nøye fra nakken til nesen. To ytterligere kutt er utført for å tillate ytterligere tilgang til hjernen: Den første kutt er gjort anterior av olfactory pærer, den andre en mindreverdig av lillehjernen å koble kraniet fra skallebasis.
  6. Bruke Flattrekkere tang, blir den kraniale flaps forsiktig snudd til siden og hjernen tas ut og plasseres i den første dissecting parabolen fylt med HBSS. Sett fatet tilbake på isen og fortsette å høste alle 4 hjerner.
  7. Resten av disseksjon Prosedyren utføres under en stereomikroskop. Først blir olfactory pærer og lillehjernen fjernes ved hjelp av den finedissecting tang (figur 1b).
  8. For å hente cortices, grip bakre enden av hjernen med de fine pinsett, utføre en midtlinjesnitt mellom halvkulene, sette inn et andre sett av tang til den opprettede grove og skrelle bort platelignende struktur av cortex fra hjernen.
  9. Nøye dissekere hjernehinnene fra cortex halvkuler ved å trekke med de fine pinsett (figur 1D '). Dette trinnet unngår forurensing av det endelige astrocyte kulturen ved meningeal celler og fibroblaster. Overfør de preparerte cortex halvkuler i andre rett fylt med HBSS og returnere det på is. Fortsett deretter med alle 4 cortices.
  10. Endelig kutt hver cortex halvkule i små biter med skarpe blader (ca 4 til 8 ganger).
  11. Under sterile forhold, overføre cortex brikker i ett 50 ml Falcon rør og legge HBSS til et totalt volum på 22,5 ml.
  12. Legg 2,5 ml av 2,5% trypsin, bland og inkubervevet i vannbadet ved 37 ° C i 30 min. Bland ved sporadiske risting hvert 10 min.
  13. Sentrifuger i 5 minutter ved 300 xg til pellet cortex vev stykker.
  14. Fjern forsiktig supernatanten ved dekantering. For å unngå å miste vev pellet du kan mekanisk beholde den med en pipette. Dissosierer vevet til en enkelt cellesuspensjon ved tilsetning av 10 ml astrocyte Plating medium og livskraftige pipettering med en 10 ml plastpipette inntil vev bitene er dissosiert i enkeltceller (20 til 30 ganger). Justere volumet til 20 ml med astrocyte plating medium. Du kan kontrollere den dissosiasjon av hjernebarken vevet inn enkeltceller ved å telle ved hjelp av en hematocytometer. En forberedelse av 4 mus valp cortices bør gi 10-15 x10 6 dissosierte enkeltceller.
  15. Aspirer PDL fra T75 kultur kolbe, plate dissosiert enkelt celle suspensjon og inkuber ved 37 ° C i CO 2 inkubator.

2. Opparbeidelse av en Enriched astrocyte Kultur

  1. Endre medium 2 dager etter plating av de blandede kortikale celler og alle 3 dager etterpå.
  2. Etter 7-8 dager, når astrocytes er sammenflytende og overlegging mikroglia sitte eksponert på astrocyte lag eller allerede løsrevet fra astrocyte laget (figur 2), riste T75 kolben ved 180 opm i 30 min på en orbital shaker til fjerne microglia. Kast supernatanten inneholder microglia eller hvis du ønsker å kultur og undersøke microglia, spinner den ned og plate for kultur 28,29.
  3. Tilsett 20 ml fersk astrocyte dyrkingsmedium og fortsette ved å riste kolben ved 240 opm i 6 hr å fjerne oligodendrocyte forløper celler (OPC). Siden enkelte OPCS ikke vil fullstendig løsner fra astrocyte lag, fortsetter å riste kraftig for hånd i 1 minutt for å forhindre OPC kontaminering. Kast supernatant eller snurre den ned og plate, hvis du ønsker å kultur OPCs 29.
  4. Skyll resten confluent astrocyte lag to ganger med PBS, aspirer PBS, tilsett 5 ml trypsin-EDTA og inkuber i CO 2 inkubator ved 37 ° C. Sjekk avløsning av astrocytes hver 5 min og håndheve avløsning av astrocytes ved å treffe kolben mot håndflaten (2-3 ganger).
  5. Etter astrocytes er løsrevet fra kultur kolbe, tilsett 5 ml astrocyte kultur medium, spin cellene ved 180 xg i 5 min, aspirer supernatant og tilsett 40 ml frisk astrocyte plating medium. En T75 vevskultur kolbe bør gi rundt 1x10 6 celler etter den første cellen splittet. Plate celler i to T75 kultur kolber og Inkuber ved 37 ° C i CO 2 inkubator. Bytter mediet hver 2 til 3 dager.
  6. 12-14 dager etter at de første delte astrocytes er belagt i den aktuelle celle konsentrasjon 24-48 time før utfører eksperimentet. En T75 vevskultur kolbe bør gi rundt 1,5 til 2 x10 6 celler etter den andre cellen splittet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved isolering av den komplette mus hjernen (figur 1A), lillehjernen og olfactory pærer må fjernes (figur 1B). De cortices skrelles av musen hjernestammen (figur 1C) og hjernehinnene den enkelte cortex (figur 1D ') er omhyggelig fjernet (figur 1E). Hjernehinnene er åpenbart av meningeal arterien systemet og ufullstendige fjerning resulterer i forurensning av det endelige astrocyte kulturen ved meningeal celler og fibroblaster.

Etter plettering av blandet kortikale cellesuspensjon, noen astrocytes allerede feste til kulturen kolben innenfor 24 timer (figur 2A). Vil imidlertid den cellekultur supernatanten inneholde cellerester og døende nevroner for de første 3 til 5 dager (figur 2A-C), som dyrkningsmediet favoriserer overlevelse og vekst av gliaceller. Når astrocytes er konfluent og microglia sitter eksponert på astrocyte lag, vanligvis på dag 7 etter isolering av blandede kortikale celler, bør astrocytes skilles fra microglia og OPCs ved å riste (figur 2D). 2 dager etter at de første delte cellene viser astrocyte morfologi. På dette punktet astrocyte tetthet er lav og astrocytes er voluminøs (figur 2E, svarte pilene markerer en celle). Den forventede avkastning på dette punktet er lav med ca 4-6 x10 5 celler per T75 vevskultur kolbe. Men cellene fortsatt sprer og modnes i kultur på dette endepunktet. Astrocytes er vanligvis brukes til forsøk på dag 21 til 28 (Figur 2F) for å sikre en moden fenotype av isolerte astrocytes. På dette punktet forventet avkastning er ca 1,5 til 2 x10 6 celler per T75 vevskultur kolbe.

Den astrocyte kultur renhet har vært preget av elektronmikroskopi morfologiske studier, celle markør uttrykk og farmakologiske respons 27. Forurensning av den astrocyte kultur kan bli undersøkt ved hjelp av markør for microglia (IBA-1) og OPCs (O4). Den oppnådde astrocyte kultur renhet og modenhet bør undersøkes av immuncytokjemisk undersøkelse ved et antistoff mot GFAP protein. Det er forventet at de fleste av cellene viser en intensiv, trådformede signal (figur 3). Vår isolering og dyrkning av kortikale astrocytes resulterte i en astrocyte renhet større enn 98%, avslørt ved hjelp av en antistoff mot GFAP protein (figur 3). Hvis prosedyren var vellykket, kontaminerende celler er sjeldne (<2%) og inneholder microglia og OPCS, som kan farges ved hjelp av IBA-1 og O4, henholdsvis. Hvis ønskelig, ytterligere analyse av andre astrocyte markører, for eksempel aquaporin-4, BLBP, S100B og GLAST kan benyttes. I tillegg til GFAP, ble disse markørene alle uttrykt av de 28 dager gamle astrocyte kulturer. Siste gene expression profilering av renset astrocyte populasjoner avdekket nye potensielle astrocyte markører, for eksempel folat metabolske enzym ALDH1L1 30,31, som også er uttrykt av de fleste av de isolerte kortikale astrocytes (figur 3).

Figur 1
Figur 1. Disseksjon av postnatal (P3) mus cortex. A) Hele hjernen. B) Brain etter fjerning av olfactory pærer og lillehjernen. C) Isolering av cortices ved å trekke av plate-lignende struktur av cortex fra hjernen. D, D ') Cortex fra ventral og dorsal nettsted med hjernehinnene (svarte piler indikerer meningeal arterier). E) Cortex uten hjernehinnene. Skala bar, 1,5 mm.

Figur 2
Figur 2. Morfologisk oversikt over isolerte blandede kortikale celler og ren astrocyte kultur på ulike tidspunkter etter isolasjon.A) 1 dag etter plettering av blandede kortikale celler. First astrocytes er festet til bunnen av kolben (sorte piler) og døende nevroner er i supernatanten. B) 3 dager etter plettering av blandede kortikale celler. Astrocyte laget er forming (svarte piler). Nevroner er nesten fraværende. C) 5 dager etter plettering av blandede kortikale celler. Først microglia og OPCs på toppen av en astrocyte lag (svarte piler). D) 7 dager etter plating av blandet kortikale celler. Astrocyte laget er helt konfluent. E) Etter å ha fjernet microglia og OPCs av kraftig risting og 2 dager etter splitting, vedlagte celler viser astrocyte morfologi med lav tetthet (piler indikerer en celle). F) astrocyte lag viser høy tetthet 2 uker etter den første split. Skala bar, 10 mikrometer.

Figur 3
Figur 3. Renhet primær astrocyte kultur. Immunolabeling av primær mus astrocyte culperaturer med markører GFAP, GLAST, S100B, aquaporin-4, ALDH1L1 og BLBP (alt grønt) viste ren primære astrocyte kultur. Atomkjerner er farget med 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blå). Målestokk: 10 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden beskrevet her er basert på den astrocyte kultur forberedelse fra gnagere neonatal hjerner, opprinnelig beskrevet av McCarthy og de ​​Vellis i 1980 27. Den modifiserte metode for isolering og kultur av kortikale astrocytes fra postnatal P1 til P4 mus hjernen som presenteres her er rask, avkastning rene primære astrocytes og er reproduserbar. Denne teknikken kan enkelt overføres til isolere astrocytes fra andre arter, for eksempel fra rotte eller gris og fra andre hjerneregioner som ryggmargen. Mens astrocyte stamceller isolert fra neonatal hjerne ved McCarthy og deVellis metoden genererer svært proliferative celler, er celleproliferasjon og utbredelse av isolerte astrocytes av postnatal P1-P4 mus valper begrenset. Etter splitting astrocytes gang på 7 dager in vitro (DIV), vil de vokse til sammenflyting og moden. In vivo, er mest astrocyte spredning i stor grad ferdig med P14 32. Hanre, foreslår vi å bruke astrocytes for eksperimenter på dag 21 til 28 DIV (figur 2F) for å sikre den modne fenotype av isolerte astrocytes. Grunnet den iboende tilbakeholdenhet å spre astrocyte kulturer bør ikke splitted mer enn 3 ganger.

Kritiske trinnene i den beskrevne isolasjon metoden er fordøyelsen av cortices og følgende utgnidning av det fordøyde vevet for å skaffe den enkel cellesuspensjon. Derfor er det nødvendig å optimalisere Trypsin konsentrasjon og fordøyelse tid for å oppnå en enkel cellesuspensjon etter utgnidning av hjernebarken vevet for 20-30 ganger. For å minimalisere variasjonen trypsin bør alikvoteres og fryse-tine sykluser bør unngås. Den beskrevne fremgangsmåten avhengig plating den blandede kortikale celler på PDL-belagte kultur kolber, noe som sikrer binding av astrocytes og fremmer en konfluent astrocyte lag flere dager etter plating. Mens PDL-belegg er ikke nødvendig for astrocyte maintenance etter deres separasjon fra microglia og oligodendrocytes, kan det utføres for visse nedstrøms applikasjoner som immunofluorescene farging. God timing av den første cellen delt er viktig for celleintegritet og utbytte. Hvis astrocytes dyrkes utover de nådde sammenflyting, kan du miste flertallet av celler på grunn av utilstrekkelig avløsning i løpet av første cellen splittet. Dette kan ikke bli overvunnet ved å øke tiden for løsrivelse, siden omfattende inkubasjonstid med trypsin negativt påvirker celleintegritet. I kontrast vil plettere kortikale cellesuspensjon altfor knapt resultere i utilstrekkelig dannelse av en konfluent astrocyte cellelaget. Den beste tiden for den første cellen splitt er på 7 til 8 dager etter plating av blandet kortikale celler, når astrocytes er konfluent og microglia celler sitte på øverste stilling astrocyte laget.

I den beskrevne kortikale cellekulturer astrocytes viser cellulær heterogenitet (<strong> Figur 3), som det har blitt beskrevet for astrocytes in vivo 33,34. Imidlertid har definere mangfoldig astrocyte morfologi og funksjonalitet blitt hemmet av begrenset antall markører for å identifisere og skille potensielt heterogene astrocyte subtyper. En godt karakterisert markør for modne fibrøs og reaktive astrocytes er GFAP. Imidlertid er GFAP knapt uttrykt av modne protoplasmiske astrocytes, begrense dens anvendelse som en markør for alle astrocytes og det er også uttrykt ved RG celler under utvikling og av B-celler i den voksne, begrense dens bruk som en fase-spesifikk markør. Andre markører for astrocytes, inkludert GLAST, ALDH1L1 eller BLBP, er også uttrykt av umodne astrocytes og derfor ikke utelukkende Mark Eldre astrocytes. Endelig modne astrocyte markører som GFAP, aquaporin-4, og S100B (figur 3) er stadig oppregulert under postnatal modning.

I våre hender, astrocyte kulturer i en alder av 4 uker har karakteristikkene av modne astrocytes in vivo. Bruke primære astrocyte kulturer kan vi identifisere den molekylære mekanismen hvordan blodet født protein fibrinogen induserer astrocyte aktivering 17. Våre studier viste at fibrinogen er en bærer av latent TGF-β. Behandling av primære astrocytes med fibrinogen førte til aktiv TGF-β dannelse og aktivering av TGF-β/Smad signalveien i astrocytes 17,26. Disse resultatene er blitt bekreftet ved hjelp av fibrinogen injeksjoner in vivo. Videre astrocytes styre andre celletyper av sekresjon av stoffer, som kan bli analysert ved å høste astrocyte-kondisjonerte medium og bruke denne kondisjonerte medium til andre celletyper. Vi brukte tidligere astrocyte klimaanlegg medium for å analysere i en funksjonell analyse hvor conditioned medium av fibrinogen-behandlede astrocytes påvirker neurite utvekst. Reaktive astrocytes ekspress og skillerproteiner av CSPG familien, som inhiberer neurite utvekst 16. Faktisk, klimaanlegg medium fra fibrinogen-behandlede astrocytes betydelig redusert både neurite lengde og andelen av celler som viser neurite utvekst 17.

Isolasjon og kultur av kortikale astrocytes beskrevet i denne protokollen gir et kraftig verktøy for å undersøke astrocyte biologi, siden deres administrasjon i ulike applikasjoner kan i stor grad fullføre etterforskningen in vivo. Imidlertid bør det holdes i tankene at de oppnådde astrocytes er stemt dyrket in vitro, og mens de reflekterer mange astrocyte egenskaper, har de også avvike fra in vivo astrocytes. Derfor andre metoder for direkte valg og isolering av astrocytes ved immunopanning 35 eller antistoff-baserte FACS isolasjon 36 representerer nye veier for å ytterligere undersøke de grunnleggende egenskapene astrocytes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Støttes av Fazit Foundation Graduate Fellowship til SS, Federal Utdannings-og forskningsdepartementet (BMBF 01 EO 0803) til KB og Europakommisjonen FP7 Grant PIRG08-GA-2010-276989, NEUREX, og den tyske Research Foundation Grant SCHA 1442 / 3-1 til CS Forfatterne har ingen motstridende økonomiske interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Astrocyte culture media
DMEM, high glucose Life Technologies 31966-021
FBS, heat-inactivated Life Technologies 10082-147 Final Concentration: 10%
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122 Final Concentration: 1%
Solution for brain tissue digestion
HBSS Life Technologies 14170-088
2.5% Trypsin Life Technologies 15090-046 Final Concentration: 0.25%
Other
70% (vol/vol) ethanol Roth 9065.2
Poly-D-Lysine Millipore A-003-E 50 μg/ml
Water PAA S15-012 cell culture grade
PBS PAA H15-002 cell culture grade
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-062
0.45 μm Sterile filter Sartorius 16555
3.5 cm petri dish BD Falcon 353001
15 ml Falcon tube BD Falcon 352096
50 ml Falcon tube BD Falcon 352070
75 cm2 Tissue culture flask BD Falcon 353136
Forceps, fine Dumont 2-1032; 2-1033 # 3c; # 5
Forceps, flat tip KLS Martin 12-120-11
13 cm surgical scissors Aesculap BC-140-R
Stereomicroscope Leica MZ7.5
Stereomicroscope + Camera Leica MZ16F; DFC320
Microscope + Camera Zeiss; Canon Primo Vert; PowerShot A650 IS
Centrifuge Eppendorf 5805000.017 Centrifuge5804R
Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE 4450-1CE MaxQ 4450
Water bath Julabo SW20; 37 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).
  2. Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation. Cell Metab. 14, 724-738 (2011).
  3. Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia - more than just brain glue. Nature. 457, 675-677 (2009).
  4. Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology. Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).
  5. Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression. BMC Neurosci. 11, 132 (2010).
  6. Kaneko, N., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
  7. Min, R., Nevian, T. Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses. Nat. Neurosci. , (2012).
  8. Eroglu, C., Barres, B. A. Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature. 468, 223-231 (2010).
  9. Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Action-potential modulation during axonal conduction. Science. 331, 599-601 (2011).
  10. Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 Forthcoming.
  11. Alvarez, J. I., et al. The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence. Science. 334, 1727-1731 (2011).
  12. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
  13. Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).
  14. Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles. Nature. 456, 745-749 (2008).
  15. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).
  16. Schachtrup, C., Moan, N. L. e, Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).
  17. Schachtrup, C., et al. Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage. J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).
  18. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).
  19. Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113, 221-233 (2002).
  20. Dabir, D. V., et al. Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes. J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).
  21. Wisniewski, H. M., Wegiel, J. Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components. Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).
  22. Shin, J. Y., et al. Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity. J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).
  23. Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson's disease brains. Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).
  24. Lioy, D. T., et al. A role for glia in the progression of Rett's syndrome. Nature. 475, 497-500 (2011).
  25. Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. GFAP and its role in Alexander disease. Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).
  26. Beck, K., Schachtrup, C. Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta. Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).
  27. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  28. Siao, C. J., Tsirka, S. E. Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II. J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).
  29. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
  30. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).
  31. Anthony, T. E., Heintz, N. The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects. J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).
  32. Skoff, R. P., Knapp, P. E. Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages. Glia. 4, 165-174 (1991).
  33. Molofsky, A. V., et al. Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective. Genes Dev. 26, 891-907 (2012).
  34. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
  35. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71, 799-811 (2011).
  36. Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60, 894-907 (2012).

Tags

Nevrovitenskap nevrobiologi cellebiologi medisin Molecular Biology hjerne mus astrocyte kultur astrocyte fibroblast fibrinogen chondroitin sulfat proteoglykan neuronal regenerasjon cellekultur dyremodell
Isolasjon og kultur av mus Kortikale Astrocytes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K.,More

Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes. J. Vis. Exp. (71), e50079, doi:10.3791/50079 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter