Summary
Astrozyten wurden erkannt, vielseitige beteiligten Zellen in grundlegender biologischer Prozesse, die wichtig für die normale Entwicklung des Gehirns und Funktion, und das zentrale Nervensystem Reparatur sein. Hier präsentieren wir ein schnelles Verfahren zur reinen Maus Astrozytenkulturen erhalten, um die Biologie dieser wichtigen Klasse von zentralen Nervensystems Zellen zu untersuchen.
Abstract
Astrozyten sind eine reiche Zelltyp im Gehirn von Säugetieren, aber es bleibt noch viel über ihre molekularen und funktionellen Eigenschaften erlernt werden. In vitro Astrozyten Zellkultur-Systeme können verwendet werden, um die biologischen Funktionen dieser Gliazellen im Detail zu studieren. Dieses Video-Protokoll zeigt, wie reine Astrozyten durch Isolierung und Kultivierung von gemischten kortikalen Zellen der Maus Welpen zu erhalten. Die Methode basiert auf der Abwesenheit von lebensfähigen Neuronen und der Trennung von Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia, die drei wichtigsten glialen Zellpopulationen des zentralen Nervensystems, in Kultur. Repräsentative Bilder in den ersten Tagen der Kultur zeigen die Gegenwart einer gemischten Zellpopulation, und zeigen den Zeitpunkt, wann Astrozyten konfluent werden und sollte von Mikroglia und Oligodendrozyten getrennt werden. Darüber hinaus zeigen wir, Reinheit und astrozytären Morphologie der Astrozyten mit immunzytochemische Färbungen für gut etabliert undneu beschriebenen Astrozyten Marker. Diese Kultur kann leicht verwendet werden, um reine Maus Astrozyten und Astrozyten-konditioniertem Medium zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Astrozyten Biologie erhalten.
Introduction
Astrozyten sind eine sehr reichliche Zelltyp im zentralen Nervensystem (ZNS). Das Verhältnis von Astrozyten mit Neuronen ist 1:3 im Cortex von Mäusen und Ratten, während es 1,4 Astrozyten pro Neuron im menschlichen Hirnrinde 1 sind. Das Interesse an Astrozytenfunktion hat sich in den letzten Jahren zugenommen. Eine wichtige Funktion der Astrozyten ist ihre Rolle bei der Bereitstellung von strukturellen und metabolischen Unterstützung Neuronen 2,3. Neu entdeckte Rollen für Astrozyten decken ein breites Spektrum von Funktionen. Dazu gehören Führen des Migration von Axonen und die Entwicklung bestimmter Neuroblasten während der Entwicklung 4-6, Bildung Funktionen im synaptischen Übertragung, Synapse Festigkeit und Informationsverarbeitung durch neuronalen Schaltkreise 7-9, Rollen in Blut-Hirn-Schranke (BBB) 10 und Integrität 11-13 und Regulierung des zerebrovaskulären Ton 14. Ein weiteres wichtiges Merkmal der Astrozyten ist ihre Reaktion auf eine Verletzung. Unter pathologischen Bedingungen astrocytes reaktiv werden und ferner hochregulieren die Expression des Intermediärfilament gliales fibrilläres saures Protein (GFAP) und inhibitorische extrazellulären Matrix (ECM)-Proteine 15,16. Reaktiven Astrozyten Abgrenzung der verletzten Stelle aus gesundem Gewebe durch Bildung einer glialen Narbe, die hauptsächlich aus Astrozyten sezernierten ECM Proteine des Chondroitinsulfat-Proteoglykan (CSPG) Familie, hemmen die wichtigsten Faktoren, die axonale Regeneration nach ZNS-Verletzung 15-17.
Astrozyten stammen aus radialen Gliazellen (RG)-Zellen während der späten Embryogenese und der frühen postnatalen Leben. Nach Spezifikation Astrozyten aufgetreten ist, Astrozyten Vorstufen ihren Endpositionen zu migrieren, wo sie den Prozess der terminalen Differenzierung beginnen. In vivo erscheinen Astrozyten als drei bis vier Wochen nach der Geburt, wie durch ihre reife typische Morphologie 18,19 angedeutet. Eine Subpopulation von RG Zellen wandeln in Subventrikulärzone Astrozyten (Typ B-Zellen). Both, RG und Typ B-Zellen funktionieren wie Astrozyten-wie neurale Stammzellen (NSCs) während der Entwicklung und in der erwachsenen sind. Wie Astrozyten, RG und Typ B-Zellen exprimieren auch den Astrozyten-spezifischen Glutamat-Transporter (GLAST), Hirn Lipid-bindendes Protein (BLBP) und GFAP, was anzeigt, dass diese Marker nicht ausschließlich verwendet werden, um spezifisch zu markieren erwachsenen Astrozyten. Im Gegensatz zu erwachsenen parenchymatösen Astrozyten, die nicht im gesunden Gehirn, RG und Typ B-Zellen zeigen Stammzellpotenzial wie die Fähigkeit sich selbst zu erneuern müssen teilen. Fehlregulation von Astrozyten wurden in zahlreichen Erkrankungen in Verbindung gebracht, einschließlich Alzheimer-Krankheit 20,21, Chorea Huntington 22, Parkinson-Krankheit 23, 24 Rett-Syndrom und Alexander-Krankheit 25. Zudem reagieren Astrozyten für alle Beleidigungen des ZNS, die zu Astrozyten-Aktivierung und Astrozyten Gliazellen Narbenbildung 16,26. Die Astrozyten Glianarbe die folgenden Gehirn tr bildetauma oder Rückenmarksverletzung wird angenommen, dass die wichtigste Barriere gegen neuronale Regeneration 15 sein.
Die Entwicklung von zuverlässigen Methoden zu isolieren und zu erhalten gereinigten Populationen von Zellen war wesentlich für das Verständnis des Nervensystems. Bahnbrechende Arbeiten von McCarthy und de Vellis können Ermittler bislang fast reine Kulturen von Astrozyten aus neugeborenen Ratten Gewebes 27 vorzubereiten. Viel ist über Astrozyten Biologie mit dieser Methode, die hier in einer leicht modifizierten Form zur Isolierung Maus kortikalen Astrozyten präsentiert gelernt. Ergänzend in vivo Studien, Astrozyten als auch konditioniertem Medium unter Verwendung der in vitro-Kultur beschrieben werden, sind wertvolle Werkzeuge, um weitere Einblicke in Astrozyten Funktionen.
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Protocol
Ein. Isolierung und Beschichtung von Mixed kortikalen Zellen
Mixed kortikalen Zellen Isolierung für Astrozytenkulturen kann mit P1 bis P4 Maus Welpen werden. Um eine ordnungsgemäße Astrozyten Dichte zu erreichen ist es notwendig, 4 Maus pup Kortex pro T75 Zellkulturflasche verwenden. Daher werden in der folgenden Volumina Protokoll für ein Zellpräparat unter Verwendung von 4 Maus Jungtieren berechnet.
- Vor Beginn des Verfahrens Dissektion, vorwärmen 30 ml Astrozyten Kulturmedien (DMEM, hohe Glucose + 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum + 1% Penicillin / Streptomycin; siehe Tabelle) bis 37 ° C Mantel ein T75-Flasche mit 20 ml Poly-D-Lysin (PDL) in einer Konzentration von 50 pg / ml in der Zellkultur-Wasser für 1 Stunde bei 37 ° C im CO 2-Inkubator.
- Für die Dissektion Verfahren, bereiten alle notwendigen Reagenzien und Materialien. Sie benötigen: chirurgische Schere, glatte feinen Pinzette, flache Spitze Pinzette, Papierhandtücher, Abfallbeutel, 70% Ethanol eind 2 Sezieren Gerichten (3,5 cm Durchmesser) auf Eis mit 2 ml HBSS jeweils gefüllt.
- Sanft halten und sprühen Sie den Kopf und Hals der Maus Welpen mit 70% Ethanol. Das Tier wird durch Enthauptung mit der Schere geopfert.
- Führen Sie einen Medianschnitt, von hinten nach vorne, entlang der Kopfhaut, um den Schädel zu offenbaren.
- Schneiden Sie den Schädel vorsichtig aus dem Hals bis zur Nase. Zwei weitere Schnitte werden durchgeführt, um einen weiteren Zugriff auf das Gehirn zu ermöglichen: Der erste Schnitt erfolgt anterioren der Riechkolben, der andere inferior des Kleinhirns, um den Schädel von der Schädelbasis trennen.
- Verwendung der flachen Spitze Pinzette sind die kraniale Klappen leicht zur Seite gekippt und das Gehirn erfolgt und in die erste Schale mit HBSS Sezieren gefüllt genommen platziert. Die Schale wieder auf Eis und weiter ernten Alle 4 Gehirne.
- Der Rest des Verfahrens ist Dissektion unter einem Stereomikroskop durchgeführt. Zunächst werden die Riechkolben und das Kleinhirn entfernt mit den feinenPinzette (Abbildung 1B).
- Um die cortices abzurufen, greifen die hinteren Ende des Gehirns mit den feinen Pinzette, führen Sie eine Inzision zwischen den Hemisphären, legen Sie einen zweiten Satz von Zangen zum erstellten Hain und abziehen das plattenförmige Struktur der Rinde von der Gehirn.
- Sorgfältig sezieren die Hirnhäute aus den Cortex Hemisphären durch Ziehen mit der feinen Pinzette (Abbildung 1D). Dieser Schritt vermeidet Kontaminationen des endgültigen Astrozyten Kultur durch meningealen Zellen und Fibroblasten. Übertragen Sie die vorbereiteten Cortex Hemisphären in die zweite Schüssel mit HBSS gefüllt und schicken Sie es auf Eis. Weiter dementsprechend mit allen 4 Rinden.
- Schließlich schneiden jedes Cortex Hemisphäre in kleine Stücke mit scharfen Klingen (etwa 4 bis 8 Mal).
- Unter sterilen Bedingungen Transfer Cortex Stück in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen und fügen HBSS auf ein Gesamtvolumen von 22,5 ml.
- 2,5 ml 2,5% Trypsin, Mischung und inkubierendas Gewebe im Wasserbad bei 37 ° C für 30 min. Mix von gelegentlichem Schütteln alle 10 min.
- Zentrifuge 5 min bei 300 xg zu pelletieren Cortex Gewebestücke.
- Sorgfältig Überstand zu entfernen durch Dekantieren. Um zu vermeiden, verlieren das Gewebe Pellet Sie können mechanisch bewahren Sie sie mit einer Pipette. Dissoziation des Gewebes in einer einzigen Zelle Suspension durch Zugabe von 10 ml Astrozyten Plattierungsmedium und kräftig Pipettieren mit einem 10 ml Kunststoff-Pipette bis Gewebestücke dissoziiert in einzelne Zellen (20 bis 30 mal) sind. Lautstärke auf 20 ml mit Astrozyten Plattierungsmedium. Sie können Nachweis der Dissoziation des Kortex Gewebe in einzelnen Zellen durch Zählen mit einer Zählkammer. Eine Herstellung von 4-Maus pup Kortex sollte zu 10-15 x10 6 dissoziierten Einzelzellen.
- Absaugen PDL aus dem T75 Kulturflasche, Platte die dissoziierte einzigen Zellsuspension und bei 37 ° C im CO 2-Inkubator.
2. Der Erhalt eines Enriched Astrocyte Kultur
- Ändern Sie die Medium 2 Tage nach dem Ausplattieren der gemischten kortikalen Zellen und alle 3 Tage danach.
- Nach 7 bis 8 Tagen, wenn Astrozyten konfluent und Überlagerung Mikroglia sind sitzen exponiert auf der Astrozyten Schicht oder sind bereits aus der Astrozyten Schicht (Abbildung 2) lösen, schütteln Sie die T75 Kolben bei 180 rpm für 30 min auf einem Schüttler um Mikroglia zu entfernen. Überstand verwerfen, die Mikroglia oder wenn Sie zu Kultur und möchten prüfen, Mikroglia, drehen Sie es nach unten und Platte für Kultur 28,29.
- 20 ml frisches Astrozyten Kulturmedium und weiter durch Schütteln der Kolben bei 240 rpm für 6 h auf Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) zu entfernen. Da einige OPCs wird nicht vollständig von der Astrozyten Schicht lösen, weiterhin unter kräftigem Schütteln für 1 min, um OPC Kontamination zu verhindern. Überstand verwerfen oder drehen Sie es nach unten und Platte, wenn Sie die Kultur OPCs 29 wollen.
- Spülen Sie die verbleibenden confluent Astrozyten Schicht zweimal mit PBS absaugen PBS, 5 ml Trypsin-EDTA und Inkubation im CO 2-Inkubator bei 37 ° C. Überprüfen Ablösung der Astrozyten alle 5 min und durchzusetzen Ablösung von Astrozyten durch Anschlagen des Kolbens gegen die Handfläche (2-3 mal).
- Nach Astrozyten aus der Kulturflasche abgelöst werden, 5 ml Astrozyten Kulturmedium, Spin-Zellen bei 180 xg für 5 min, Überstand entfernen und 40 ml frisches Astrozyten Plattierungsmedium. Eine T75 Zellkulturflasche sollte etwa 1x10 6 Zellen nach der ersten Zelle Split ergeben. Platte Zellen in zwei T75 Kulturflaschen und bei 37 ° C im CO 2-Inkubator. Anderer das Medium alle 2 bis 3 Tage.
- 12-14 Tage nach der ersten Spaltung Astrozyten sind in der entsprechenden Zelle Konzentration 24-48 h vor Durchführung des Experiments überzogen. Eine T75 Zellkulturflasche sollte etwa 1,5-2 x10 6 Zellen nach der zweiten Zelle Split ergeben.
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Representative Results
Nach Isolierung des gesamten Gehirn der Maus (Abbildung 1A), das Kleinhirn und die Riechkolben müssen entfernt (Abbildung 1B) werden. Die Rinden werden mit der Maus Hirnstamm (1C) und der Hirnhäute der einzelnen Kortex (1D) geschält werden sorgfältig entfernt (1E). Hirnhäute sind offensichtlich durch die meningea und unvollständige Entfernung führt zur Verunreinigung der endgültigen Astrozyten Kultur meningealen Zellen und Fibroblasten.
Nach dem Plattieren des gemischten kortikalen Zellsuspension einige Astrozyten bereits der Kulturflasche Befestigen innerhalb von 24 h (Abb. 2A). Allerdings wird der Zellkulturüberstand Zelltrümmer und sterbende Nervenzellen in den ersten 3 bis 5 Tagen (Abbildung 2A-C) enthalten als das Kulturmedium begünstigt Überleben und Wachstum von Gliazellen. Sobald Astrozyten sind konfluent und Mikroglia sitzen auf dem astrocyt ausgesetzte-Schicht, in der Regel am Tag 7 nach Isolation von gemischten kortikalen Zellen, sollte aus Astrozyten und Mikroglia OPCs durch Schütteln (2D) getrennt werden. 2 Tage nach den ersten Split-Zellen zeigen Astrozyten Morphologie. An diesem Punkt Astrozyten Dichte niedrig ist, und Astrozyten sind voluminös (2E, schwarzen Pfeile markieren eine Zelle). Die zu erwartende Ausbeute an diesem Punkt ist günstig mit ungefähr 4-6 x 10 5 Zellen pro T75 Zellkulturflasche. Allerdings sind die Zellen noch vermehren und reifen in der Kultur an diesem Zeitpunkt. Astrozyten sind in der Regel für Experimente an Tag 21 bis 28 (2F) verwendet, um eine reife Phänotyp isoliert Astrozyten gewährleisten. An dieser Stelle der erwarteten Ausbeute beträgt ca. 1,5-2 x10 6 Zellen pro T75 Zellkulturflasche.
Die Astrozyten Reinheit der Kultur wurde durch Elektronenmikroskopie morphologische Studien, Zell-Marker-Expression und pharmakologischen Ansprechverhalten 27 gekennzeichnet. Eine Kontamination desstrocyte Kultur kann durch Marker für Mikroglia (IBA-1) und OPCs (O4) untersucht werden. Die erhaltene Kultur Astrozyten Reinheit und Reife sollte durch immuncytochemische Untersuchung unter Verwendung eines Antikörpers gegen das GFAP-Protein untersucht. Es wird erwartet, dass die Mehrheit der Zellen eine intensive, filamentösen Signals (Bild 3) zeigen. Unsere Isolierung und Kultivierung Verfahren kortikalen Astrozyten führten zu einer Reinheit von Astrozyten größer als 98%, zeigte unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Protein GFAP (Abbildung 3). Wenn das Verfahren erfolgreich war, gibt kontaminierenden Zellen selten (<2%) und enthalten Mikroglia und OPCs, die unter Verwendung IBA-1 und O4, jeweils angefärbt werden kann. Gegebenenfalls weitere Analyse anderer Astrozyten Marker wie Aquaporin-4, BLBP, S100B und GLAST verwendet werden. Neben GFAP wurden diese Marker alle von den 28 Tage alten Astrozytenkulturen ausgedrückt. Aktuelle Genexpressionsanalysen von gereinigten Astrozyten Populationen zeigten neue Potenziale astrocyte Marker wie der Folat Stoffwechselenzyms ALDH1L1 30,31, die ebenfalls von der Mehrzahl der isolierten corticalen Astrozyten (Figur 3) ausgedrückt wird.
Abbildung 1. Dissection der postnatalen (P3) Maus Kortex. A) Whole-Brain. B) Brain nach Entfernung der Riechkolben und Kleinhirn. C) Isolierung des Kortex durch Abziehen der plattenähnlichen Struktur des Kortex des Gehirns. D, D ') Cortex vom ventralen und dorsalen Seite mit Hirnhäute (schwarzen Pfeile zeigen meningealen Arterien). E) Cortex ohne Hirnhäute. Maßstab, 1,5 mm.
Abbildung 2. Morphologische Überblick über isolierte gemischten kortikalen Zellen und reinen Astrozyten Kultur zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Isolierung.A) 1 Tag nach der Beschichtung von gemischten kortikalen Zellen. Ersten Astrozyten sind an der Unterseite des Kolbens (schwarze Pfeile) befestigt und sterbende Nervenzellen sind im Überstand. B) 3 Tage nach dem Ausplattieren der gemischten kortikalen Zellen. Astrocyte Schicht bildende (schwarze Pfeile). Neuronen sind fast abwesend. C) 5 Tage nach Plattieren von gemischten kortikalen Zellen. Erste Mikroglia und OPCs auf einem Astrozyten Schicht (schwarze Pfeile). D) 7 Tage nach dem Ausplattieren der gemischten kortikalen Zellen. Astrocyte Schicht ist komplett konfluent. E) Nach Entfernen Mikroglia und OPCs durch kräftiges Schütteln und 2 Tage nach dem Spalten zeigen anhaftenden Zellen Astrozyten Morphologie mit niedriger Dichte (Pfeile zeigen eine Zelle). F) Astrocyte Schicht zeigt hoher Dichte 2 Wochen nach der ersten geteilten. Maßstab, 10 mm.
Abbildung 3. Reinheit des primären Astrozyten Kultur. Immunmarkierung der primären Maus Astrozyten culturen mit den Markern GFAP, GLAST, S100B, Aquaporin-4, ALDH1L1 und BLBP (alle grün) ergab reine primäre Astrozyten Kultur. Kerne werden mit 4 ', 6'-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (blau) gefärbt. Maßstab: 10 um.
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Discussion
Die beschriebene Methode ist hier auf der Astrozyten Kultur Zubereitung von Nagetieren neonatalen Gehirn, die ursprünglich von McCarthy und de Vellis in 1980 27 beschrieben ist. Die modifizierte Methode der Isolierung und Kultivierung von kortikalen Astrozyten aus postnatalen P1 bis P4 Maushirn hier vorgestellten ist schnell, liefert reines primären Astrozyten und ist hoch reproduzierbar. Diese Technik kann leicht übertragen Astrozyten aus anderen Spezies, wie zB von Ratte oder Schwein und von anderen Hirnregionen, wie dem Rückenmark isolieren. Erwägung Astrozyten Vorläuferzelle Isolierung aus neonatalen Gehirns durch McCarthy und deVellis Verfahren erzeugt hoch proliferativen Zellen wird die Zellproliferation und Vermehrung von isolierten Astrozyten des postnatalen P1-P4 Maus Jungtieren begrenzt. Nach der Spaltung Astrozyten einmal 7 Tage in vitro (DIV), sie wird wachsen Konfluenz und reifen. In vivo, ist am Astrozytenproliferation weitgehend abgeschlossen P14 32. Ererneut, schlagen wir vor, Astrozyten für Experimente nutzen am Tag 21 bis 28 DIV (2F), um das reife Phänotyp der isolierten Astrozyten zu gewährleisten. Aufgrund der inhärenten Rückhalteeinrichtung zu proliferieren Astrozytenkulturen sollte nicht mehr als 3 Mal gespaltet werden.
Kritische Schritte in der beschriebenen Verfahren zur Isolierung sind die Verdauung von Kortex und die folgende Verreiben des verdaute Gewebe für den Erhalt der einzigen Zellsuspension. Daher ist es notwendig, die Konzentration und Trypsin Verdauung Zeit zu optimieren, um eine Einzelzellen-Suspension nach Verreiben der Hirnrinde Gewebe für 20-30 mal erhalten. Zur Minimierung Variation Trypsin sollte aliquotiert und Frost-Tau-Zyklen sollte vermieden werden. Das beschriebene Verfahren beruht auf Ausplattieren der gemischten kortikalen Zellen auf PDL-beschichteten Kulturflaschen, die die Bindung von Astrozyten sichert und fördert eine konfluente Schicht Astrozyten mehrere Tage nach dem Ausplattieren. Während PDL-Beschichtung ist nicht für Astrozyten m notwendigartungund nach ihrer Trennung von Mikroglia und Oligodendrozyten, kann es für bestimmte Anwendungen wie stromabwärtigen immunofluorescene Färbung durchgeführt werden. Gutes Timing der ersten Zelle Spaltung ist für Zell-Integrität und Ausbeute wichtig. Wenn Astrozyten kultiviert werden über sie Konfluenz erreichten, verlieren Sie möglicherweise die Mehrheit der Zellen aufgrund unzureichender Ablösen während der ersten Zelle geteilt. Dies kann nicht durch eine Erhöhung der Zeit für die Ablösung, da umfangreiche Inkubationszeit mit Trypsin negativ beeinflusst die Integrität der Zelle überwunden werden. Im Gegensatz dazu wird das Plattieren der kortikalen Zellsuspension zu knapp einer unzureichenden Bildung einer konfluenten Zellrasen Astrocyten führt. Der beste Zeitpunkt für die erste Zelle Spaltung ist bei 7 bis 8 Tage nach dem Ausplattieren der gemischten kortikalen Zellen, wenn Astrozyten und Mikroglia sind konfluenten Zellen sitzen auf der obersten Position des Astrozyten Schicht.
In der beschriebenen kortikalen Zellkultur zeigen Astrozyten zellulären Heterogenität (<strong> Abbildung 3), wie es für Astrozyten wurde in vivo 33,34 beschrieben. Allerdings hat die Definition vielfältigen Astrozyten Morphologie und Funktionalität durch die begrenzte Anzahl von Markern behindert zu identifizieren und zu unterscheiden potentiell heterogenen Astrozyten Subtypen. Ein gut charakterisierten Marker von reifen faserig und reaktiven Astrozyten ist GFAP. Allerdings ist kaum GFAP durch reife protoplasmatischen Astrozyten exprimiert, was die Verwendung als Marker für alle Astrozyten und es wird auch von RG-Zellen während der Entwicklung und von B-Zellen in der Erwachsenen exprimiert, die seine Verwendung als Bühne-spezifischer Marker. Andere Marker von Astrozyten, einschließlich GLAST, ALDH1L1 oder BLBP, werden auch von unreifen Astrozyten exprimiert und daher nicht ausschließlich Mark Älteres Astrozyten. Schließlich sind reife Astrozyten Marker wie GFAP, Aquaporin-4 und S100B (Abbildung 3) immer up-reguliert während der postnatalen Reifung.
In unseren Händen, astrocyte Kulturen in einem Alter von 4 Wochen haben Eigenschaften von reifen Astrozyten in vivo. Mit primären Astrozytenkulturen wir identifizieren konnten den molekularen Mechanismus, wie das Blut geboren Fibrinogen Astrozyten-Aktivierung 17 induziert. Unsere Untersuchungen zeigten, dass ein Träger Fibrinogen von latentem TGF-β ist. Behandlung von primären Astrozyten mit Fibrinogen führte zu aktivem TGF-β-Bildung und Aktivierung des TGF-β/Smad Signalweges in Astrozyten 17,26. Diese Ergebnisse wurden bestätigt mit Fibrinogen Injektionen in vivo. Weiterhin steuern Astrozyten anderen Zelltypen durch die Sekretion von Substanzen, die sich durch Ernten Astrozyten-konditioniertem Medium und Anlegen dieses konditionierten Mediums auf andere Zelltypen analysiert werden kann. Wir zuvor verwendeten Astrozyten-konditionierte Medium in einem funktionalen Assay wie konditioniertem Medium von Fibrinogen-behandelten Astrozyten auswirkt Neuritenwachstum zu analysieren. Reaktiven Astrozyten exprimieren und sekretierenProteine des CSPG Familie, die Neuritenwachstum 16 hemmen. Tatsächlich konditionierte Medium aus Fibrinogen-behandelten Astrozyten signifikant verringert sowohl Neuritenlänge und den Prozentsatz an Zellen, welche Neuritenauswuchs 17.
Die Isolierung und Kultivierung von kortikalen Astrozyten in diesem Protokoll beschriebenen stellt ein leistungsfähiges Tool für die Untersuchung von Astrozyten Biologie, da ihre Handhabbarkeit in vielfältigen Anwendungen stark abschließen kann ihre Untersuchung in vivo. Es sollte jedoch bedacht werden, dass die erhaltenen Astrocyten in vitro kultiviert wurden und während sie viele Astrozyten Merkmale beziehen, sie unterscheiden sich auch von in vivo Astrozyten. Daher stellen andere Methoden der direkten Selektion und Isolierung von Astrozyten durch Immunopanning 35 oder Antikörper-basierte FACS isoliert 36 neue Wege zur weiteren Untersuchung der grundlegenden Eigenschaften von Astrozyten.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Unterstützt durch die Fazit-Stiftung Graduate Stipendium für SS, das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF 01 EO 0803) zu KB und der Europäischen Kommission RP7 Finanzhilfevereinbarung PIRG08-GA-2010 bis 276.989, NEUREX, und der Deutschen Forschungsgemeinschaft Foundation Grant SCHA 1442 / 3-1 bis CS Die Autoren haben keine widerstreitenden finanziellen Interessen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
| Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
| PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Water bath | Julabo | SW20; 37 °C | |
References
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