Summary
Les astrocytes ont été reconnus pour être des cellules polyvalentes qui participent au processus biologiques fondamentaux qui sont essentiels pour le développement normal du cerveau et la fonction, et réparation du système nerveux central. Nous présentons ici une procédure rapide afin d'obtenir des cultures pures astrocytes de souris pour étudier la biologie de cette classe importante de cellules du système nerveux central.
Abstract
Les astrocytes sont un type de cellule abondant dans le cerveau des mammifères, mais il reste beaucoup à apprendre sur leurs caractéristiques moléculaires et fonctionnelles. Astrocytes in vitro systèmes de culture cellulaire peut être utilisé pour étudier les fonctions biologiques de ces cellules gliales dans le détail. Ce protocole vidéo montre comment obtenir les astrocytes pures par l'isolement et la culture des cellules corticales mixtes de souriceaux. La méthode est basée sur l'absence de neurones viables et la séparation des astrocytes, les oligodendrocytes et les microglies, les trois principales populations de cellules gliales du système nerveux central, de la culture. Images représentatifs au cours des premiers jours de culture en évidence la présence d'une population cellulaire mixte et indiquer le point temporel, lorsque les astrocytes deviennent confluentes et ne doit être séparé de la microglie et les oligodendrocytes. De plus, nous démontrons la pureté et de la morphologie des astrocytes astrocytes en culture en utilisant des colorations immunocytochimiques pour bien établies etnouvellement décrit marqueurs astrocytaires. Ce système de culture peut être facilement utilisé pour obtenir des astrocytes de souris pures et astrocytes conditionné moyen pour étudier divers aspects de la biologie des astrocytes.
Introduction
Les astrocytes sont un type cellulaire très abondante dans le système nerveux central (SNC). Le ratio des astrocytes aux neurones est de 1:3 dans le cortex des souris et des rats, alors il ya 1,4 astrocytes par neurone dans le cortex humain 1. L'intérêt pour la fonction des astrocytes a augmenté de façon spectaculaire ces dernières années. Une des principales fonctions des astrocytes est leur rôle dans le soutien structural et métabolique des neurones 2,3. Rôles récemment découverts pour astrocytes couvrent un large éventail de fonctions. Il s'agit notamment de guidage de la migration des axones et des neuroblastes développement au cours du développement de certaines 4-6, fonctions de la transmission synaptique, la force des synapses et de traitement d'informations par des circuits neuronaux 7-9, les rôles de barrière hémato-encéphalique (BHE) formation 10 et 11-13 intégrité et la réglementation des 14 tonus cérébrovasculaire. Une autre caractéristique importante des astrocytes est leur réponse à une blessure. Sous astrocyt conditions pathologiqueses devenue plus réactive et augmentent l'expression de la protéine intermédiaire filament gliale fibrillaire acide (GFAP) et inhibiteurs de la matrice extracellulaire (ECM) 15,16 protéines. Astrocytes réactifs délimiter le site de la lésion des tissus sains en formant une cicatrice gliale, qui se compose principalement d'astrocytes protéines de la MEC sécrétées de la chondroïtine sulfate protéoglycanes (GCEP) de la famille, les principaux facteurs qui inhibent la régénération axonale après une lésion du SNC 15-17.
Les astrocytes proviennent gliales radiales (RG), les cellules lors de l'embryogenèse fin et au début de la vie postnatale. Après la spécification des astrocytes a eu lieu, précurseurs astrocytaires migrer vers leurs positions finales, où ils commencent le processus de différenciation terminale. In vivo, les astrocytes semblent être mature trois à quatre semaines après la naissance, comme indiqué par leur morphologie typique 18,19. Une sous-population de cellules RG convertir en zone sous-ventriculaire (astrocytes de type cellules B). Both, RG et les cellules de type B fonctionnent comme des astrocytes de type cellules souches neurales (NSC) au cours du développement et chez l'adulte, respectivement. Comme les astrocytes, cellules RG et de type B expriment également le transporteur du glutamate astrocytes spécifique (GLAST), le cerveau des lipides-binding protein (BLBP), et de la GFAP, ce qui indique que ces marqueurs ne peuvent pas être exclusivement utilisé pour marquer spécifiquement les astrocytes adultes. Contrairement aux adultes, les astrocytes parenchymateux, qui ne se divisent pas dans le cerveau, RG sain et cellules de type B présentent un potentiel de cellules souches telles que la capacité d'auto-renouvellement. Le dérèglement des astrocytes a été impliquée dans de nombreuses pathologies, y compris la maladie d'Alzheimer 20,21, la maladie de Huntington 22, la maladie de Parkinson 23, le syndrome de Rett 24 et la maladie d'Alexander 25. Par ailleurs, les astrocytes réagir à toutes les injures du système nerveux central, conduisant à l'activation des astrocytes et astrocytaire formation cicatrice gliale 16,26. La cicatrice gliale astrocytaire qui forme tr cerveau suivantelésions de la moelle épinière ou auma est considéré comme le principal obstacle empêchant la régénération neuronale 15.
Le développement de méthodes fiables d'isoler et de maintenir des populations purifiées de cellules a été essentielle à notre compréhension du système nerveux. Travaux pionniers de McCarthy et de Vellis permet aux enquêteurs à ce jour pour préparer des cultures d'astrocytes presque purs de tissu de rat nouveau-né 27. On a beaucoup appris sur la biologie des astrocytes en utilisant cette méthode, qui est présentée ici sous une forme légèrement modifiée pour isoler les astrocytes corticaux de souris. En complément des études in vivo, les astrocytes, ainsi que le milieu conditionné obtenu en utilisant le décrit la culture in vitro, sont des outils précieux pour mieux avoir un aperçu des fonctions astrocytes.
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Protocol
1. Isolement et placage de Mixed cellules corticales
Mixte isolement des cellules corticales des cultures d'astrocytes peuvent être effectuées à l'aide de P1 à P4 souriceaux. Afin de parvenir à un bon densité des astrocytes, il est nécessaire d'utiliser 4 cortex de souris chiot par T75 flacon de culture tissulaire. Par conséquent, les volumes dans le protocole suivant sont calculés pour une préparation de cellules en utilisant 4 souriceaux.
- Avant de commencer la procédure de dissection, préchauffer 30 ml de milieu de culture d'astrocytes (DMEM, taux élevé de glucose + 10% de sérum de sérum de veau foetal + 1% de pénicilline / streptomycine; voir tableau) à 37 ° C. Revêtez un flacon T75 avec 20 ml de poly-D-lysine (PDL) à une concentration de 50 pg / ml dans l'eau de culture de cellules de qualité pendant 1 heure à 37 ° C dans l'incubateur CO 2.
- Pour la procédure de dissection, préparer tous les réactifs et le matériel nécessaires. Vous aurez besoin: ciseaux chirurgicaux, pinces fines lisses, pinces à bout plat, serviettes en papier, sac à déchets, éthanol à 70% d'und 2 plats de dissection (3,5 cm de diamètre) sur la glace remplie de 2 ml de HBSS chacun.
- Tenir délicatement et pulvériser la tête et du cou de la souris chiot avec de l'éthanol à 70%. L'animal est sacrifié par décapitation à l'aide des ciseaux.
- Effectuer une incision médiane, arrière en avant, le long du cuir chevelu pour révéler le crâne.
- Couper le crâne soigneusement à partir du cou vers le nez. Deux coupes supplémentaires sont effectués pour permettre un accès plus vers le cerveau: La première coupe est faite antérieure des bulbes olfactifs, l'autre inférieure du cervelet de débrancher le crâne de la base du crâne.
- En utilisant la pince à bout plat, les volets crâniens sont doucement basculé sur le côté et le cerveau est prélevé et placé dans le premier plat dissection rempli avec du HBSS. Placer le plat de retour sur la glace et continuer à récolter les 4 cerveaux.
- Le reste de la procédure de dissection est effectuée sous une loupe binoculaire. Tout d'abord, les bulbes olfactifs et le cervelet sont éliminés en utilisant l'amendePince à dissection (figure 1B).
- Afin de récupérer les cortex, saisir l'extrémité postérieure du cerveau avec les pinces fines, effectuer une incision médiane entre les deux hémisphères, insérez un second jeu de pinces pour le bosquet créé et décoller la structure en forme de plaque du cortex de la cerveau.
- Disséquer soigneusement les méninges des hémisphères du cortex en tirant avec une pince fine (figure 1D). Cette étape permet d'éviter la contamination de la culture finale des astrocytes par les cellules méningées et les fibroblastes. Transférez les hémisphères du cortex préparés dans le deuxième plat rempli avec du HBSS et le retourner sur la glace. Continuer en conséquence avec les 4 corticales.
- Enfin, couper chaque hémisphère du cortex en petits morceaux à l'aide des lames tranchantes (environ 4 à 8 fois).
- Dans des conditions stériles, des morceaux du cortex transfert dans un tube Falcon de 50 ml et ajouter HBSS pour un volume total de 22,5 ml.
- Ajouter 2,5 ml de trypsine, mélange 2,5% et incuberle tissu dans le bain d'eau à 37 ° C pendant 30 min. Mélanger en agitant de temps toutes les 10 min.
- Centrifuger pendant 5 min à 300 xg à granulés de morceaux de tissus de cortex.
- Retirez délicatement le surnageant par décantation. Afin d'éviter de perdre le culot de tissus vous pouvez retenir mécaniquement à l'aide d'une pipette. Dissocier le tissu dans une suspension cellulaire unique en ajoutant 10 ml Milieu de pipetage astrocytes et vigoureuse à l'aide d'une pipette en plastique 10 ml jusqu'à morceaux de tissu sont dissociées en cellules individuelles (20 à 30 fois). Réglez le volume à 20 ml en utilisant un milieu placage astrocytes. Vous pouvez la preuve de la dissociation des tissus du cortex dans des cellules individuelles en comptant l'aide d'un hématocytomètre. Une préparation de 4 cortex de souris chiot doit rendement de 10-15 x 10 6 cellules dissociées simples.
- Aspirer PDL du flacon T75 culture, plaque de la suspension de cellules dissociées unique et incuber à 37 ° C dans l'incubateur CO 2.
2. L'obtention d'un Enriched Culture Astrocyte
- Changer les 2 moyennes jours après l'étalement des cellules corticales mixtes et les 3 jours suivants.
- Après 7 à 8 jours, alors que les astrocytes sont les microglies confluentes et superposition s'asseoir exposé sur la couche d'astrocytes ou sont déjà détachés de la couche d'astrocytes (figure 2), agiter le flacon T75 à 180 rpm pendant 30 min sur un agitateur orbital pour enlever la microglie. Jeter le surnageant contenant la microglie ou si vous souhaitez à la culture et à examiner les microglies, il ralentit ou plaque de culture 28,29.
- Ajouter 20 ml de milieu de culture frais astrocytes et continuer en agitant à 240 tours par minute pendant 6 heures pour éliminer les cellules précurseurs d'oligodendrocytes (OPC). Étant donné que certains pays producteurs de pétrole ne sera pas complètement se détacher de la couche d'astrocytes, continuer à agiter vigoureusement à la main pendant 1 minute afin d'éviter la contamination OPC. Jeter le surnageant ou le tourner vers le bas et plat, si vous le souhaitez à la culture OPC 29.
- Rincez le reste confluent couche d'astrocytes deux fois avec du PBS, aspirer le PBS, ajouter 5 ml de trypsine-EDTA et incuber dans l'incubateur CO 2 à 37 ° C. Vérifiez détachement des astrocytes toutes les 5 min et appliquer détachement des astrocytes en frappant le ballon dans la paume de votre main (2-3 fois).
- Après astrocytes sont détachées du flacon de culture, ajouter 5 ml de milieu de culture des astrocytes, cellules de spin à 180 xg pendant 5 minutes, aspirer le surnageant et ajouter 40 ml de milieu frais placage astrocytes. Un flacon de culture tissulaire T75 devrait produire environ 1x10 6 cellules après la scission première cellule. Cellules de la plaque dans deux flacons T75 culture et incuber à 37 ° C dans l'incubateur CO 2. Changer le milieu tous les 2 à 3 jours.
- 12-14 jours après les astrocytes première division sont étalées dans la concentration cellulaire appropriée 24-48 heures avant de réaliser l'expérience. Un flacon de culture tissulaire T75 devrait produire environ 1,5 à 2 x 10 6 cellules après la scission deuxième cellule.
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Representative Results
Après isolement du cerveau de la souris complète (figure 1A), le cervelet et des bulbes olfactifs doivent être éliminés (figure 1B). Les cortex sont pelées de la tige de cerveau de souris (figure 1C) et les méninges du cortex individuel (figure 1D ») sont soigneusement retirés (figure 1E). Méninges sont évidents par le système de l'artère méningée et les résultats élimination incomplète de la contamination de la culture finale des astrocytes par les cellules méningées et les fibroblastes.
Après étalement de la suspension cellulaire corticale mixte, certains astrocytes déjà attacher à la fiole de culture dans les 24 heures (figure 2A). Cependant, le surnageant de culture cellulaire contiendra les débris cellulaires et les neurones qui meurent pour les 3 à 5 premiers jours (figure 2A-C), selon le milieu de culture favorise la survie et la croissance des cellules gliales. Une fois que les astrocytes sont confluentes et microglie assis exposée sur le astrocytcouche électronique, généralement au jour 7 après l'isolement de cellules corticales mixtes, les astrocytes doit être séparée de la microglie et les OPC en secouant (figure 2D). 2 jours après les cellules divisées en premier Afficher la morphologie des astrocytes. A ce point de la densité est faible et astrocytes astrocytes sont volumineux (2E figure, les flèches noires marquent une cellule). Le rendement prévu à ce stade est faible avec environ 4-6 x10 5 cellules par flacon T75 culture de tissus. Cependant, les cellules continuent à proliférer et à mûrir dans la culture à ce point de temps. Les astrocytes sont généralement utilisés pour des expériences au jour 21 à 28 (figure 2F) afin d'assurer un phénotype mature des astrocytes isolés. A ce stade, le rendement attendu est environ 1,5-2 x 10 6 cellules par flacon T75 culture de tissus.
La pureté de la culture des astrocytes a été caractérisé par des études morphologiques en microscopie électronique, l'expression marqueur des cellules et la réactivité pharmacologique 27. La contamination de l'uneculture strocyte peuvent être examinés à l'aide de marqueur de la microglie (IBA-1) et OPC (O4). La pureté de la culture et de la maturité des astrocytes obtenus devraient être examinées par un examen immunocytochimique utilisant un anticorps contre la protéine GFAP. Il est prévu que la majorité des cellules montrent une forte intensité, le signal filamenteuses (figure 3). Notre procédé d'isolement et la culture des astrocytes corticales donné lieu à une pureté d'astrocytes de plus de 98%, a révélé à l'aide d'un anticorps dirigé contre la protéine GFAP (figure 3). Si la procédure a réussi, cellules contaminantes sont rares (<2%) et contiennent des microglies et les OPC qui peut être teinté à l'aide d'IBA-1 et O4, respectivement. Si on le désire, en outre l'analyse des autres marqueurs, tels que les astrocytes aquaporine-4, BLBP, S100B et GLAST peuvent être utilisés. En plus de la GFAP, ces marqueurs ont tous exprimé par les 28 jours d'âge cultures d'astrocytes. Récente profil d'expression génique des populations d'astrocytes purifiée a révélé de nouveaux ast potentielmarqueurs rocyte, comme l'enzyme métabolique du folate ALDH1L1 30,31, qui est également exprimée par la majorité des astrocytes corticaux isolés (figure 3).
Figure 1. Dissection du cortex de souris post-natal (P3). Un cerveau) plénier. B) Brain après le retrait de bulbes olfactifs et le cervelet. C) Isolement du cortex en enlevant la structure en forme de plaque du cortex du cerveau. D, D ') à partir du site Cortex ventral et dorsal avec méninges (flèches noires indiquent les artères méningées). E) Cortex sans méninges. La barre d'échelle, de 1,5 mm.
Figure 2. Vue d'ensemble morphologique des cellules corticales isolées mixtes et pures culture d'astrocytes à différents points dans le temps après l'isolement.A) 1 jour après l'étalement des cellules corticales mixtes. Astrocytes premiers sont fixés sur le fond du flacon (flèches noires) et les neurones sont décédés dans le surnageant. B) 3 jours après l'étalement des cellules corticales mixtes. Couche d'astrocytes est de formage (flèches noires). Les neurones sont presque absents. C) 5 jours après l'étalement des cellules corticales mixtes. Première microglie et les OPC au-dessus d'une couche d'astrocytes (flèches noires). D) 7 jours après l'étalement des cellules corticales mixtes. Couche d'astrocytes est complètement confluentes. E) Après avoir retiré la microglie et les OPC par agitation vigoureuse et 2 jours après la division, les cellules ci-jointes montrent la morphologie des astrocytes avec une faible densité (les flèches indiquent une cellule). F) couche astrocytes montre de haute densité 2 semaines après la première division. La barre d'échelle, 10 pm.
Figure 3. Pureté de la culture des astrocytes primaires. Immunomarquage de cul souris astrocytes primairestures avec les marqueurs GFAP, GLAST, S100B, Aquaporin-4, ALDH1L1 et BLBP (tous verts) a révélé pur culture primaire d'astrocytes. Les noyaux sont colorés avec 4 ', 6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (bleu). Barre d'échelle: 10 um.
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Discussion
La méthode décrite ici est basée sur la préparation des cultures d'astrocytes à partir de cerveaux de rongeurs nouveau-nés, initialement décrite par McCarthy et de Vellis en 1980 27. La méthode modifiée de l'isolement et la culture des astrocytes corticaux de P1 à P4 postnatal du cerveau de souris présentée ici est rapide, rendements pures astrocytes primaires et est hautement reproductible. Cette technique peut facilement être transférée à isoler les astrocytes à partir d'autres espèces, comme chez le rat ou le cochon et de d'autres régions cérébrales, comme la moelle épinière. Alors que des astrocytes isolement de cellules souches du cerveau néonatal par la méthode DeVellis McCarthy et génère des cellules hautement proliférantes, la prolifération cellulaire et la propagation des astrocytes isolés de postnatales souriceaux P1-P4 est limité. Après le fractionnement astrocytes une fois à 7 jours in vitro (DIV), ils vont grandir jusqu'à la confluence et mature. In vivo, la prolifération des astrocytes est largement plus complète par P14 32. Ilre, nous suggérons d'utiliser les astrocytes pour des expériences au jour 21 à 28 DIV (figure 2F) pour assurer le phénotype mature des astrocytes isolés. En raison de la limitation intrinsèque à proliférer cultures d'astrocytes ne doit pas être découpé plus de 3 fois.
Les étapes critiques de la méthode d'isolement décrites sont la digestion des cortex et la trituration suivante du tissu digéré pour obtenir la suspension cellulaire unique. Par conséquent, il est nécessaire d'optimiser la concentration de la trypsine et le temps de digestion afin d'obtenir une suspension cellulaire unique après trituration des tissus du cortex cérébral pendant 20-30 fois. Afin de minimiser la trypsine variation devrait être aliquotés et cycles gel-dégel doit être évitée. La procédure décrite s'appuie sur l'étalement des cellules corticales mixtes sur des flacons de culture PDL-enduits, qui assure la liaison des astrocytes et favorise une couche confluente astrocytes plusieurs jours après placage. Tandis PDL-revêtement n'est pas nécessaire pour astrocyte mAINTENANCE après leur séparation de la microglie et les oligodendrocytes, il peut être réalisée pour certaines applications en aval comme la coloration immunofluorescene. Bon timing de la division première cellule est importante pour l'intégrité des cellules et le rendement. Si les astrocytes sont cultivées au-delà ils ont atteint la confluence, vous risquez de perdre la majorité des cellules due à un décollement insuffisant au cours de la division cellulaire premier. Cela ne peut pas être surmonté en augmentant le temps de détachement, car le temps d'incubation avec de la trypsine vaste influence négativement l'intégrité cellulaire. En revanche, le placage de la suspension de cellules corticales trop difficilement se traduira par la formation insuffisante de la couche de cellules confluentes astrocytes. Le meilleur moment de la scission première cellule est à 7 à 8 jours après l'étalement des cellules corticales mixtes, lorsque les astrocytes sont confluentes et les cellules microgliales s'asseoir sur la position la plus élevée de la couche d'astrocytes.
Dans la culture de cellules corticales décrites, montrent astrocytes hétérogénéité cellulaire (<strong> Figure 3), il a été décrit pour les astrocytes in vivo 33,34. Cependant, la définition de la morphologie des astrocytes et diversifiée fonctionnalité a été entravée par le nombre limité de marqueurs pour identifier et distinguer potentiellement hétérogènes sous-types d'astrocytes. Un marqueur bien caractérisé du fibreuse mature et astrocytes réactifs est GFAP. Cependant, la GFAP est à peine exprimée par matures astrocytes protoplasmiques, ce qui limite son utilisation comme marqueur de tous les astrocytes et il est également exprimé par les cellules du receveur au cours du développement et par les cellules B chez l'adulte, limitant son utilisation comme marqueur spécifique du stade. D'autres marqueurs d'astrocytes, y compris GLAST, ALDH1L1 ou BLBP, sont également exprimés par les astrocytes immatures et ne sont donc pas exclusivement marquer astrocytes matures. Enfin, matures marqueurs astrocytes GFAP tels que, Aquaporin-4, et S100B (figure 3) sont de plus en plus régulée à la hausse au cours de la maturation postnatale.
Dans nos mains, astcultures rocyte à un âge de 4 semaines ont des caractéristiques d'astrocytes matures in vivo. En utilisant des cultures primaires d'astrocytes nous avons pu identifier le mécanisme moléculaire comment le fibrinogène protéine du sang né induit l'activation des astrocytes 17 ans. Nos études ont révélé que le fibrinogène est un transporteur de TGF-β latent. Traitement des astrocytes primaires avec du fibrinogène actif conduit à TGF-β et la formation de l'activation de la voie de signalisation dans les astrocytes TGF-β/Smad 17,26. Ces résultats ont été confirmés en utilisant des injections de fibrinogène in vivo. Par ailleurs, les astrocytes contrôler d'autres types cellulaires par la sécrétion de substances qui peuvent être analysés par la récolte des astrocytes milieu conditionné et l'application de ce milieu conditionné à d'autres types cellulaires. Nous avons déjà utilisé des astrocytes milieu conditionné à analyser dans une analyse fonctionnelle comment milieu conditionné par des astrocytes fibrinogène traités affecte la croissance des neurites. Réactif astrocytes expriment et sécrètentprotéines de la famille CSPG, qui inhibent la croissance des neurites 16. En effet, un milieu conditionné à partir de fibrinogène traités par une diminution significative des astrocytes longueur des neurites et à la fois le pourcentage de cellules présentant une excroissance des neurites 17.
L'isolement et la culture des astrocytes corticaux décrites dans ce protocole fournit un outil puissant pour étudier la biologie des astrocytes, depuis leur maniabilité dans des applications diverses peuvent grandement terminer son enquête in vivo. Cependant, il faut garder à l'esprit que les astrocytes obtenus ont été cultivés in vitro et tandis qu'ils reflètent de nombreuses caractéristiques astrocytaires, ils diffèrent également dans les astrocytes in vivo. Par conséquent, d'autres méthodes de sélection directe et l'isolement des astrocytes par immunopanning 35 ou à base d'anticorps isolement FACS 36 représentent de nouvelles voies pour approfondir l'étude des propriétés fondamentales des astrocytes.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Soutenu par la Fondation de bourses d'études supérieures à Fazit SS, le ministère fédéral de l'Education et de la Recherche (BMBF 01 EO 0803) à Ko et la Commission européenne FP7 Grant PIRG08-GA-2010-276989, Neurex, et la fondation allemande de recherche Grant SCHA 1442 / 3-1 à CS Les auteurs n'ont pas de conflits d'intérêts financiers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
| Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
| PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Water bath | Julabo | SW20; 37 °C | |
References
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