Summary
האסטרוציטים הוכרו כתאים צדדיים המשתתפים בתהליכים ביולוגיים בסיסיים שחיוניים להתפתחות המוח ותפקודו תקין, ותיקון מערכת עצבים מרכזי. כאן אנו מציגים הליך מהיר לקבלת תרבויות astrocyte עכבר טהורות ללמוד ביולוגיה בכיתה זו גדולה של תאים במערכת עצבים מרכזיים.
Abstract
האסטרוציטים הם סוג תא בשפע במוח של היונקים, עדיין נותרים הרבה מה ללמוד על המאפיינים המולקולריים ופונקציונליים שלהם. במערכות סלולריות תרבות astrocyte מבחנה יכול לשמש כדי ללמוד את הפונקציות הביולוגיות של תאי גליה אלה בפירוט. פרוטוקול וידאו זה מראה כיצד להשיג האסטרוציטים טהורים על ידי בידוד והתרבות של תאי קליפת מוח המעורבים של גורי עכברים. השיטה מבוססת על העדר נוירונים קיימא וההפרדה של האסטרוציטים, oligodendrocytes ומיקרוגלים, שלוש האוכלוסיות העיקריות גליה התאים של מערכת העצבים המרכזית, בתרבות. תמונות מייצגות בימים הראשונים של התרבות להדגים את נוכחותה של אוכלוסיית תאים מעורבת ומצביעות timepoint, כאשר האסטרוציטים הופכים confluent וצריך להיות מופרדים מהמיקרוגליאה וoligodendrocytes. יתר על כן, אנו מדגימים טוהר ומורפולוגיה astrocytic של האסטרוציטים תרבית באמצעות stainings immunocytochemical למבוסס היטב ותאר חדש סמני astrocyte. מערכת זו התרבות יכולה לשמש בקלות להשיג האסטרוציטים עכבר טהורים ובינוני astrocyte ממוזג ללימוד היבטים שונים של ביולוגית astrocyte.
Introduction
האסטרוציטים הם סוג תא נפוץ מאוד במערכת העצבים המרכזית (CNS). היחס של האסטרוציטים לנוירונים הוא 1:03 בקליפת המוח של עכברים וחולדות, ואילו יש 1.4 האסטרוציטים לנוירון ב1 קליפת אדם. ריבית בתפקוד astrocyte גדלה באופן דרמטי בשנים האחרונות. תפקיד מרכזי של האסטרוציטים הוא תפקידם במתן תמיכה מבנית לנוירונים וטבולים 2,3. תפקידים חדשים שהתגלו להאסטרוציטים לכסות ספקטרום רחב של פונקציות. אלה כוללים מנחים ההגירה של האקסונים המתפתחים וneuroblasts המסוים במהלך הפיתוח 4-6, פונקציות בהעברה הסינפטית, כוח סינפסה ועיבוד מידע על ידי מעגלים עצביים 7-9, תפקידים במחסום דם מוח (BBB) היווצרות 10 ויושרה 11-13 ורגולציה של 14 טון כלי הדם במוח. תכונה בולטת נוספת של האסטרוציטים היא תגובתם לפציעה. תחת תנאי astrocyt פתולוגיes להיות תגובתי ועוד upregulate הביטוי של חלבון ביניים נימת גליה fibrillary חומצי (GFAP) ומטריצת החלבונים תאיים מעכבים (ECM) 15,16. האסטרוציטים תגובתי לתחום את הפגיעה באתר מהרקמה בריאה על ידי יצירת צלקת גלייה, המורכבת בעיקר מחלבונים מופרשים ECM astrocyte של סולפט כונדרואיטין משפחת גליקן (CSPG), הגורמים העיקריים המעכבים התחדשות axonal לאחר פציעת CNS 15-17.
האסטרוציטים מקורן תאי גלייה רדיאלי (RG) במהלך התפתחות עוברת מאוחר וחיים לאחר לידה מוקדמים. לאחר מפרט astrocyte התרחש, מבשרי astrocyte להגר למצבם הסופי, שבו הם מתחילים בתהליך של בידול מסוף. בחי, האסטרוציטים להיראות בוגר שלושה עד ארבעה שבועות לאחר לידה כפי שצוינו על ידי המורפולוגיה האופיינית 18,19. תת אוכלוסיות של תאי RG להמיר לתוך האסטרוציטים אזור subventricular (סוג B תאים). Both, RG ותאים מסוג B לתפקד כתאי astrocyte דמוי גזע עצביים (NSCs) במהלך התפתחות ובמבוגרים, בהתאמה. כמו האסטרוציטים, RG ותאים מסוג B גם להביע טרנספורטר astrocyte הספציפי גלוטמט (GLAST), חלבון מוח שומנים מחייבים (BLBP), וGFAP, המציין כי סמנים אלה לא ניתן להשתמש באופן בלעדי במיוחד כדי לתייג את האסטרוציטים בוגרים. בניגוד להאסטרוציטים parenchymal מבוגרים, שאינם מחלקים במוח, RG הבריא ופוטנציאל הסוג B תאי תערוכת תאי גזע כגון יכולת עצמית לחדש. Dysregulation של האסטרוציטים היה מעורב בפתולוגיות רבות, כולל מחלת אלצהיימר 20,21, מחלת הנטינגטון 22, מחלת פרקינסון 23, 24 רט התסמונת ומחלתו של אלכסנדר 25. יתר על כן, האסטרוציטים להגיב לכל העלבונות של מערכת העצבים המרכזיים, מה שמוביל להפעלת astrocyte והיווצרות צלקת גלייה astrocytic 16,26. צלקת גלייה astrocytic שיוצרת מוח tr הבאפגיעה בחוט שדרה או auma נחשבת למכשול העיקרי המונע התחדשות תאי עצב 15.
הפיתוח של שיטות אמינות לבודד ולשמור על אוכלוסיות מטוהרות של תאים היה חיוני להבנה של מערכת העצבים שלנו. עבודתו החלוצית של מקארתי ודה Vellis מאפשרת לחוקרים למועד להכין תרבויות כמעט טהורות של האסטרוציטים מרקמות חולדת יילודי 27. רב כבר למד על ביולוגית astrocyte שימוש בשיטה זו, המוצגת כאן בצורה שונה מעט לבידוד האסטרוציטים קליפת המוח של עכברים. משלימים במחקרי vivo, האסטרוציטים, כמו גם מדיום מותנה הושג באמצעות תואר בתרבות מבחנה, הם כלים חשובים נוספת להבנה הטובה של פונקציות astrocyte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בידוד וציפוי של תאים קליפתיים מעורבים
בידוד תא קליפת מוח מעורב עבור תרבויות astrocyte יכול להתבצע באמצעות P1 עד P4 גורי עכברים. על מנת להשיג צפיפות astrocyte נכונה יש צורך להשתמש 4 קורטקס סיירי עכבר לבקבוק תרבית רקמת T75. לכן, כרכים בפרוטוקול הבא מחושבים להכנת תאים באמצעות 4 גורי עכברים.
- לפני שתתחיל בהליך הנתיחה, 30 מ"ל של prewarm תקשורת תרבות astrocyte (DMEM, רמת סוכר גבוה + 10% חום מומת עוברי סרום שור + 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ראה טבלה) עד 37 ° C. 1 T75 בקבוק מעייל עם 20 מ"ל של פולי-D-ליזין (PDL) בריכוז של 50 מיקרוגרם / מיליליטר מים בכיתת תרבית תאים ל1 שעות ב 37 ° C בחממת CO 2.
- להליך הנתיחה, להכין את כל החומרים כימיים וחומרים דרושים. יהיה עליך: מספרי כירורגיות, מלקחיים עדינים חלקים, מלקחי קצוות שטוחים, מגבות נייר, שקית אשפה, 70% אתנולד 2 מנות מבתרות (3.5 סנטימטרי קוטר) על קרח מלא עם 2 HBSS מ"ל כל אחד.
- עדינות ולרסס את הראש והצוואר של עכבר הגור עם אתנול 70%. החיה מוקרבת על ידי עריפת הראש באמצעות מספריים.
- לבצע חתך קו אמצע, אחורי לקדמי, יחד הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.
- חותך את הגולגולת בזהירות מהצוואר אל האף. שני חתכים נוספים מבוצעים על מנת לאפשר גישה נוספת למוח: החתך הראשון הוא עשה קדמי של נורות חוש הריח, 1 הנח של המוח הקטן לנתק את הגולגולת מבסיס הגולגולת האחרת.
- שימוש במלקחי הקצוות השטוחים, דשי גולגולתם בעדינות התהפכו לצד והמוח נלקח החוצה והניח למנה הראשונה מלאה עם ביתור HBSS. הנח את הצלחת חזרה על קרח ולהמשיך לקצור את כל 4 המוחין.
- שאר הליך הנתיחה מתבצע תחת מיקרוסקופ סטראוסקופי. ראשית, את נורות חוש הריח והמוח הקטן מוסרות באמצעות הקנסמלקחיים מבתרים (1B איור).
- כדי לאחזר את קליפת המוח, לתפוס את הקצה האחורי של המוח עם מלקחיים העדינים, לבצע חתך קו אמצע בין שני חצאים המוח, להוסיף סט שני של מלקחיים לחורשה שנוצרה ולקלף את המבנה דמוי צלחת של קליפה מ מוח.
- זהירות לנתח את קרומי המוח מחצי הקליפה על ידי משיכה עם מלקחיים העדינים (1D איור '). צעד זה ימנע זיהום של תרבות astrocyte הסופית על ידי תאים ופיברובלסטים meningeal. העבר את ההמיספרות קליפה המוכנות למנה השנייה, מלאה HBSS ולהחזיר אותו על גבי קרח. המשך בהתאם עם כל 4 הקורטקס.
- לבסוף, חותך כל חצי קליפה לחתיכות קטנות באמצעות להבים חדים (כ 4-8 פעמים).
- בתנאים סטריליים, חתיכות קליפה להעברת צינור אחד 50 מ"ל פלקון ולהוסיף HBSS להיקף כולל של 22.5 מ"ל.
- הוסף 2.5 מ"ל של טריפסין 2.5%, לערבב ודגירההרקמה באמבט המים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לערבב מדי פעם על ידי מטלטל כל 10 דקות.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 XG לחתיכות רקמת קליפת גלולה.
- מוציא בזהירות את supernatant ידי decantation. על מנת להימנע מאיבוד רקמת הגלולה שמכאנית עשויים לשמר אותו באמצעות pipet. לנתק את הרקמות לתוך השעית תא בודדה על ידי הוספת מדיום 10 מ"ל astrocyte ציפוי והנמרץ pipetting באמצעות פיפטה פלסטיק 10 מ"ל עד פיסות רקמה הן ניתקו לתוך תאים בודדים (20 עד 30 פעמים). התאם נפח 20 מ"ל באמצעות מדיום הציפוי astrocyte. אתה יכול הוכחת הניתוק של רקמת קליפת המוח לתאים בודדים על ידי ספירה באמצעות hematocytometer. הכנה אחד 4 קורטקס סיירי עכבר אמורה להניב 10-15 x10 6 תאים בודדים ניתקו.
- PDL לשאוב מבקבוקון התרבות T75, צלחת השעיה ניתקה התא הבודדה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממת CO 2.
2. קבלת Enrתרבות astrocyte iched
- שנה את 2 ימים הבינוניים לאחר ציפוי של תאים המעורבים של קליפת המוח וכל 3 ימים לאחר מכן.
- לאחר 7 עד 8 ימים, כאשר האסטרוציטים המיקרוגליאה confluent כיסה לשבת נחשפו בשכבת astrocyte או שהם כבר מנותקים משכבת astrocyte (איור 2), לנער את בקבוק T75 ב 180 סל"ד למשך 30 דקות בהקפה ייקרה להסיר המיקרוגליאה. השלך המיקרוגליאה המכילה supernatant או אם תרצה לתרבות ולבחון מיקרוגליאה, לסובב אותו וצלחת לתרבות 28,29.
- הוסף 20 מ"ל הבינוני טריה astrocyte תרבות ולהמשיך בניעור הבקבוק ב 240 סל"ד עבור 6 שעות כדי להסיר תאים מבשרים oligodendrocyte (OPC). מאחר שחלק מOPCs לא להתנתק לגמרי משכבת astrocyte, תמשיך ללחוץ נמרצות ביד במשך דקות 1 כדי למנוע זיהום OPC. בטל supernatant או לסובב אותו כלפי מטה וצלחת, אם אתה רוצה תרבות OPCs 29.
- שטוף את conflue שנותרשכבת astrocyte nt פעמים עם PBS, לשאוב PBS, מוסיף 5 מ"ל טריפסין-EDTA ולדגור בCO 2 החממה ב 37 ° C. בדקו ניתוק של האסטרוציטים כל 5 דקות ולאכוף ניתוק של האסטרוציטים על ידי להכות את הבקבוק על כף היד שלך (2-3 פעמים).
- לאחר האסטרוציטים מנותקים מבקבוקון התרבות, מוסיף 5 מ"ל של מדיום התרבות astrocyte, תאי ספין ב 180 XG למשך 5 דקות, לשאוב supernatant ולהוסיף 40 מ"ל בינוני טריה astrocyte ציפוי. בקבוקון תרבות אחת T75 רקמה אמור להניב כ 1x10 6 תאים לאחר פיצול התא הראשון. תאי פלייט בשתי T75 צלוחיות תרבות ולדגור על 37 ° C בחממת CO 2. שינוי הבינוני כל 2 עד 3 ימים.
- 12-14 ימים לאחר את האסטרוציטים המפוצלים 1 מצופים ב24-48 שעתי ריכוז התא המתאימות לפני ביצוע הניסוי. בקבוקון תרבות אחת T75 רקמה אמור להניב כ 1.5-2 6 תאי X10 לאחר פיצול התא השני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על הבידוד של מוח העכבר השלם (איור 1 א), המוח הקטן ואת נורות חוש הריח יש להסיר (1B איור). הקורטקס הם קלפו של גזע מוח העכבר (התרשים 1C) וקרומים של קליפת הפרט (1D איור ') הם הוציאו בזהירות (האיור 1E). קרום המוח הוא ברור על ידי מערכת עורק קרום המוח ותוצאות הסרה חלקיות בזיהום של תרבות astrocyte הסופית על ידי תאים ופיברובלסטים meningeal.
לאחר הציפוי של השעית תא קליפת המוח המעורבת, כמה האסטרוציטים כבר לצרף לבקבוק התרבות בתוך 24 שעות (איור 2 א). עם זאת, את supernatant תרבות התא יכיל פסולת תא ונוירונים גוססים במשך 3 עד 5 הימים הראשונים (איור 2A-C), כמדיום התרבות מעדיף הישרדות וצמיחה של תאי גליה. ברגע האסטרוציטים confluent והמיקרוגליאה יושבת חשופה על astrocytשכבת דואר, בדרך כלל ביום 7 אחרי הבידוד של תאי קליפת מוח מעורבים, האסטרוציטים צריך להיות מופרדת מהמיקרוגליאה וOPCs ידי רועד (האיור 2D). 2 ימים לאחר התאים המפוצלים 1 מראים מורפולוגיה astrocyte. בצפיפות astrocyte שלב זה הוא נמוך והאסטרוציטים הם משופעים (2E איור, חצים שחורים מסמן תא אחד). התשואה הצפויה בשלב זה היא נמוכה בכ 04-06 מאי תאי X10 לבקבוק תרבית רקמת T75. עם זאת, התאים עדיין יתרבו ולהתבגר בתרבות בtimepoint זה. האסטרוציטים בדרך כלל משמשים לניסויים ביום 21 עד 28 (האיור 2F) כדי להבטיח פנוטיפ בוגר של האסטרוציטים מבודדים. בשלב זה התשואה הצפויה היא כ 1.5-2 6 תאי X10 לבקבוק תרבית רקמת T75.
טוהר תרבות astrocyte התאפיין מחקרי אלקטרון מיקרוסקופיה מורפולוגיים, ביטוי סמן תא והיענות תרופתית 27. זיהוםתרבות strocyte ניתן לבחון באמצעות סמן להמיקרוגליאה (רשות שידור-1) וOPCs (O4). הטוהר הושג astrocyte התרבות ובגרות יש לבחון על ידי בדיקת immunocytochemical באמצעות נוגדן נגד חלבון GFAP. צפוי כי רוב התאים להראות אות אינטנסיבית, פילמנטיות (איור 3). שיטת הבידוד והתרבות שלנו של האסטרוציטים קליפת המוח הביאה לטוהר astrocyte של יותר מ 98%, חשפה באמצעות נוגדן נגד חלבון GFAP (איור 3). אם ההליך היה מוצלח, תאים מזהמים הם נדירים (<2%) ומכילים המיקרוגליאה וOPCs, שאפשר לצבוע באמצעות רשות שידור-1 וO4, בהתאמה. אם תרצו ניתוח, נוסף של סמני astrocyte אחרים, כגון Aquaporin-4, BLBP, S100B וGLAST עשוי לשמש. בנוסף לGFAP, סמנים אלה באו לידי ביטוי בכל 28 ימי תרבויות astrocyte הישנות. הפרופיל של התבטאות הגנים האחרון של מטוהר אוכלוסיות astrocyte חשף AST פוטנציאל החדשסמני rocyte, כגון החומצה פולית אנזים המטבולי ALDH1L1 30,31, שבאו לידי ביטוי גם על ידי רוב של האסטרוציטים קליפת המוח המבודדים (איור 3).
איור 1. נתיחה של קליפה לאחר לידה (P3) עכבר.) כל מוח. B) מוח לאחר הסרת פקעות והמוח קטן ריח. ג) בידוד של קליפת מוח על ידי קילוף המבנה דמוי צלחת של הקליפה מהמוח. ד,) קורטקס 'ד מאתר גחון והגבה עם קרומי מוח (חיצים שחורים מצביעים על עורקי meningeal). E) Cortex ללא קרומי מוח. סרגל קנה מידה, 1.5 מ"מ.
איור 2. סקירה מורפולוגי של תאים בודדים מעורבים בקליפת מוח ותרבות astrocyte הטהורה בנקודתי זמן שונים לאחר בידוד.א) ביום 1 לאחר ציפוי של תאי קליפת מוח מעורבים. האסטרוציטים ראשונים מצורפים לתחתית הבקבוק (חיצים שחורים) ונוירונים גוססים נמצאים בsupernatant. ב) 3 ימים לאחר הציפוי של תאי קליפת מוח מעורבים. שכבת astrocyte היא להרכיב (חיצים שחורים). הנוירונים הם כמעט נעדרים. ג) 5 ימים לאחר הציפוי של תאי קליפת מוח מעורבים. המיקרוגליאה ראשונה וOPCs על גבי שכבת astrocyte (חיצים שחורים). ד) 7 ימים לאחר הציפוי של תאי קליפת מוח מעורבים. שכבת astrocyte לחלוטין confluent. ה) לאחר הסרת המיקרוגליאה וOPCs ידי טלטול נמרץ ו2 ימים לאחר פיצול, תאים מצורפים מראים מורפולוגיה astrocyte עם צפיפות נמוכה (חצים מציינים תא אחד). F) שכבת astrocyte מראה צפיפות גבוהה 2 שבועות לאחר הפיצול הראשון. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר.
איור 3. טוהר תרבות astrocyte העיקרית. Immunolabeling של מבוי סתום astrocyte עכבר העיקריtures עם סמני GFAP, GLAST, S100B, Aquaporin-4, ALDH1L1 וBLBP (כולו הירוק) חשף תרבות astrocyte הראשונית טהורה. גרעיניהם מגואלות ב4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (כחול). סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת כאן מבוססת על הכנת תרבות astrocyte ממוח של ילוד מכרסם, שתואר לראשונה על ידי מקארתי ודה Vellis בשנת 1980 27. השיטה השונה של הבידוד והתרבות של האסטרוציטים קליפת המוח מP1 לאחר הלידה למוח עכבר P4 מוצגת כאן הוא מהיר, תשואות האסטרוציטים ראשוניים וטהורים וניתן לשחזור ביותר. טכניקה זו יכולה בקלות להיות מועברת לבודד את האסטרוציטים ממינים אחרים, כגון מחולדה או חזיר ומאזורים אחרים במוח, כמו חוט השדרה. בעוד בידוד astrocyte מוליד תא ממוח ילוד ידי מקארתי ושיטת deVellis מייצר תאי שגשוג מאוד, התפשטות התאים וההתפשטות של האסטרוציטים בודדים של גורים לאחר לידת P1-P4 עכבר הוא מוגבלת. לאחר פיצול האסטרוציטים פעם ב7 ימים במבחנה (DIV), הם יגדלו לconfluency ובוגר. בחי, התפשטות astrocyte ביותר היא במידה רבה על ידי שלמה P14 32. הואמחדש, אנו ממליצים להשתמש האסטרוציטים לניסויים ב21-28 DIV (האיור 2F) היום כדי להבטיח את הפנוטיפ הבוגר של האסטרוציטים מבודדים. בשל האיפוק הפנימי להתרבות תרבויות astrocyte לא צריך להיות splitted יותר מ 3 פעמים.
צעדים קריטיים בשיטת הבידוד תארה הם את מערכת העיכול של קליפת מוח והטחינה הדקה הבאה של הרקמה מתעכלת לקבלת השעית התא הבודדה. לכן, יש צורך לייעל את ריכוז טריפסין וזמן עיכול על מנת לקבל השעית תא בודדה לאחר טחינה דקה של רקמת קליפת המוח במשך 20-30 פעמים. כדי למזער טריפסין וריאציה יש aliquoted ומחזורי הקפאת הפשרה יש להימנע. ההליך המתואר מסתמך על ציפוי תאי קליפת המוח המעורבים על צלוחיות תרבות PDL מצופות, אשר מבטיחים את הכריכה של האסטרוציטים ומקדם שכבת astrocyte confluent מספר ימים לאחר ציפוי. בעוד PDL הציפוי אינו הכרחי עבור מ astrocyteaintenance לאחר פרידתם מהמיקרוגליאה וoligodendrocytes, ייתכן שהוא בצע עבור יישומים במורד זרם מסוימים, כגון צביעת immunofluorescene. תזמון טוב של פיצול התא הראשון הוא חשוב לשלמות תא ואת התשואה. אם האסטרוציטים מתורבתים מעבר הגיעו confluency, אתה עלול לאבד את הרוב של תאים עקב ניתוק מספק במהלך פיצול התא הראשון. זה לא ניתן להתגבר על ידי הגדלת הזמן לניתוק, משום שזמן דגירה נרחבת עם טריפסין שלילי משפיע על שלמות תא. לעומת זאת, ציפוי השעית תא קליפת המוח גם בקושי יביא להיווצרות מספקת של שכבת תאי astrocyte confluent. הזמן הטוב ביותר לפיצול התא הראשון הוא בגיל 7 עד 8 ימים לאחר ציפוי של תאי קליפת מוח מעורבים, כאשר האסטרוציטים confluent ותאי מיקרוגליה לשבת על העמדה העליונה ביותר של שכבת astrocyte.
בתרבית התאים בקליפת המוח שתואר, האסטרוציטים להראות ההטרוגניות סלולרית (<חזק> איור 3), כפי שכבר תאר להאסטרוציטים in vivo 33,34. עם זאת, הגדרת מורפולוגיה astrocyte מגוונת ופונקציונלי כבר הקשה על ידי המספר המוגבל של סמנים כדי לזהות ולהבחין בין תת astrocyte פוטנציאלי הטרוגניות. סמן מאופיין היטב מסיבי בוגרים והאסטרוציטים תגובתי הוא GFAP. עם זאת, כמעט ואינו בא לידי ביטוי GFAP ידי האסטרוציטים protoplasmic בוגרים, המגביל את השימוש בו כסמן לכל האסטרוציטים וזה בא לידי הביטוי גם על ידי תאי RG במהלך פיתוח ועל ידי תאי B במבוגרים, המגביל את השימוש בו כסמן שלב ספציפי. סמנים אחרים של האסטרוציטים, כולל GLAST, ALDH1L1 או BLBP, באים לידי הביטוי גם על ידי האסטרוציטים לא בשלים, ולכן לא רק אל תסמנו האסטרוציטים בוגרים. לבסוף, סמני astrocyte בוגרים כמו GFAP, Aquaporin-4, וS100B (איור 3) הם יותר ויותר מוסדרים מעלה במהלך התבגרות לאחר לידה.
בידות שלנו, ASTתרבויות rocyte בגיל 4 שבועות יש מאפיינים של האסטרוציטים בוגרים in vivo. שימוש בתרבויות astrocyte העיקריות שאנחנו יכולים לזהות את המנגנון המולקולרי כיצד פיברינוגן חלבון הדם נולד גורם הפעלת astrocyte 17. המחקרים שלנו הראו כי פיברינוגן הוא הנשאית של TGF-β הסמוי. טיפול של האסטרוציטים עיקריים עם פיברינוגן הוביל להיווצרות TGF-β הפעיל וההפעלה של מסלול איתות TGF-β/Smad בהאסטרוציטים 17,26. תוצאות אלה אושרו באמצעות זריקות פיברינוגן in vivo. יתר על כן, האסטרוציטים לשלוט סוגי תאים אחרים על ידי הפרשת חומרים, אשר יכול להיות מנותח על ידי איסוף בינוני astrocyte ממוזג והחלה בינונית מותנית זו לסוגי תאים אחרים. אנחנו השתמשנו בעבר בינוני astrocyte ממוזג לנתח בבדיקה פונקציונלית איך מזגן בינוני של האסטרוציטים פיברינוגן טופל משפיע תולדת neurite. האסטרוציטים תגובתי מפורש ומפרישיםחלבונים של המשפחה, שמעכבים CSPG תולדת neurite 16. ואכן בינוניים, מזגן מהאסטרוציטים פיברינוגן טופל ירידה משמעותית גם באורך neurite ואחוז התאים מראים תולדת neurite 17.
הבידוד והתרבות של האסטרוציטים קליפת המוח שתוארו בפרוטוקול זה מספק כלי רב עצמה לחקר ביולוגית astrocyte, מאחר יכולת הניהול שלהם ביישומים שונים יכולה להשלים את חקירתם בגוף חי מאוד. עם זאת, יש לזכור כי האסטרוציטים שהושגו כבר בתרבית במבחנה ותוך שהן משקפות תכונות astrocyte רבות, הם גם שונים מהאסטרוציטים vivo. לכן, שיטות אחרות של בחירה ישירה ובידוד של האסטרוציטים ידי immunopanning בידוד 35 או נוגדן מבוסס FACS 36 מייצגות אפיקים חדשים נוסף כדי לחקור את התכונות הבסיסיות של האסטרוציטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
נתמך על ידי קרן Fazit בוגרת המלגה לס"ס, המשרד הפדרלי לחינוך ולמחקר (BMBF 01 איו 0803) לק"ג והנציבות האירופיים FP7 גרנט PIRG08-GA-2010-276989, NEUREX, וקרן המחקר הגרמני גרנט SCHA 1442 / המחברים 3-1 לCS אין אינטרסים כלכליים סותרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
| Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
| PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Water bath | Julabo | SW20; 37 °C | |
References
- Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).
- Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation. Cell Metab. 14, 724-738 (2011).
- Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia - more than just brain glue. Nature. 457, 675-677 (2009).
- Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology. Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).
- Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression. BMC Neurosci. 11, 132 (2010).
- Kaneko, N., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Min, R., Nevian, T. Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses. Nat. Neurosci. , (2012).
- Eroglu, C., Barres, B. A. Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature. 468, 223-231 (2010).
- Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Action-potential modulation during axonal conduction. Science. 331, 599-601 (2011).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 Forthcoming.
- Alvarez, J. I., et al. The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence. Science. 334, 1727-1731 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).
- Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles. Nature. 456, 745-749 (2008).
- Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).
- Schachtrup, C., Moan, N. L. e, Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).
- Schachtrup, C., et al. Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage. J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113, 221-233 (2002).
- Dabir, D. V., et al. Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes. J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).
- Wisniewski, H. M., Wegiel, J. Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components. Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).
- Shin, J. Y., et al. Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity. J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).
- Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson's disease brains. Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).
- Lioy, D. T., et al. A role for glia in the progression of Rett's syndrome. Nature. 475, 497-500 (2011).
- Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. GFAP and its role in Alexander disease. Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).
- Beck, K., Schachtrup, C. Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta. Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Siao, C. J., Tsirka, S. E. Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II. J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).
- Anthony, T. E., Heintz, N. The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects. J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).
- Skoff, R. P., Knapp, P. E. Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages. Glia. 4, 165-174 (1991).
- Molofsky, A. V., et al. Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective. Genes Dev. 26, 891-907 (2012).
- Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71, 799-811 (2011).
- Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60, 894-907 (2012).
